方法論記事

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

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DOI：

10.3791/50925

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2013年12月13日

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1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

ゼブラフィッシュは、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、および関連する神経筋疾患をモデル化するための確立された強力なツールとなっています。複屈折と触覚誘発逃走行動は、ゼブラフィッシュ胚の早期発生における筋肉の混乱と運動障害の程度を決定するために使用される2つの一般的な非侵襲的アッセイです。

要約

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、哺乳類8のゲノムおよび構造保存が高いため、筋ジストロフィー1-3、先天性ミオパチー4,5、および肉腫集合の混乱6,7を含む骨格筋に影響を与えるヒトの疾患をモデル化するための特に効果的なツールとなっています.筋肉の解体と運動障害は、ゼブラフィッシュでは受精後の最初の数日間で迅速に評価できます。ゼブラフィッシュの骨格筋欠損を特徴付けるのに役立つ2つのアッセイは、複屈折(構造的)と触覚誘発逃避反応(行動的)です。

複屈折は、光が筋肉のサルコメア9の擬似結晶配列などの秩序ある物質を通過するときに回転する物理的特性です。これは、発生の初期段階で半透明のゼブラフィッシュの幼生の筋肉の完全性を評価するためのシンプルで非侵襲的なアプローチです。高度に組織化された骨格筋を持つ野生型ゼブラフィッシュは、2つの偏光フィルターの間で視覚化すると、暗い背景の中で非常に明るく見えますが、筋肉変異体は、モデル化する主要な筋肉障害に固有の複屈折パターンを持っています。筋ジストロフィーをモデル化するゼブラフィッシュは、筋線維の変性とそれに続く再生の繰り返しを特徴とする疾患であり、偏光下で骨格筋に変性した暗い斑点を示します。非ジストロフィー性ミオパチーは、壊死や再生変化とは関連していませんが、筋繊維の乱れや骨格筋の衰弱を引き起こします。ミオパシーゼブラフィッシュは、通常、サルコメアの解体を反映して、複屈折が全体的に減少します。

触覚誘発脱出アッセイは、触覚刺激10-12に応答して胚の遊泳行動を観察することを含みます。野生型の幼虫と比較して、突然変異型の幼虫はしばしば弱い脱出収縮を示し、その後、ゆっくりと泳ぐか、または幼虫を短距離以上推進できない他のタイプの障害運動を示します12。これらのアッセイの利点は、同じ種類の魚類の疾患の進行を数日間in vivoで監視できることと、高等脊椎動物と比較して多数の魚を短時間で分析できることです。

プロトコル

1. 複屈折による骨格筋構造のin vivo解析

  1. 給餌後の午後遅くに、目的のゼブラフィッシュ系統の雄と雌を分離する交尾ケージを準備します。
    1. 女性は大きな下腹部とわずかな青/白の色で区別し、男性は細い体型とピンク/黄色の色調で区別します。
    2. ペアワイズクロス(1つの男性と1つの女性)の成功は、約50%にすぎません。成功率を上げるには、1匹のオスと2〜3匹のメスを交配させます。
  2. 光が入り始めた直後の翌朝にケージディバイダーを取り外し、魚が邪魔されずに産卵できるようにします。
  3. タンクの底に十分な数の受精卵が産まれたら、ストレーナーを使用して卵を収集します。
  4. ストレーナーを魚の水ですすいで胚を深いシャーレに移し、親魚を水槽に戻します。胚の皿を28.5°Cのインキュベーターに入れます。
  5. その日のうちに、または翌朝に生存不能な卵子や破片を片付け、胚をインキュベーターに戻してさらに成長させます。
  6. 胚/幼虫は、受精後3〜7日(dpf)で複屈折を観察するのに適切な年齢に達します。これは、3 dpfより前の結果はコントラストが限られている可能性があるためです。野生型の胚は、受精後48〜60時間(hpf)に絨毛膜から孵化し、その後、体軸が矯正されます。孵化が遅れた野生型または突然変異の胚は、手動のデコレーションが必要になる場合があります。
    1. 鋭い鉗子で絨毛膜にそっと裂け目を作り、胚が落ちるように逆さまにします。
    2. アッセイを開始する前に、デコレーションされた胚をまっすぐにします。
    3. 胚をトリカイン(魚水中の0.04%)で麻酔して、正しい位置付けを支援します。
  7. 解剖顕微鏡には、回転させて偏光の角度を調整できる偏光レンズを取り付けます(図1A)。
  8. 脱角化され、麻酔をかけられた胚を、体の横軸に沿って2番目の偏光レンズの上に直接置きます。.2 番目のレンズは、顕微鏡ステージ上の上部レンズの下に配置する必要があります (図 1B)。複屈折アッセイのどの時点でもプラスチックのシャーレは使用しないでください、プラスチックは屈折光の伝送に適した媒体ではないためです。
  9. 2つのレンズの偏光軸が互いに90°の向きになり、背景が完全に暗くなるまで、目的の胚を視野に入れて上部のレンズを回転させます。
  10. アッセイの最適な出力は、2つの偏光レンズ間の魚の向きに依存します。魚を動かして、できるだけ平らに横たわっていることを確認します。
    1. 魚が湾曲している場合、この平らな方向のセグメントのみが偏光を通過し、複屈折を示します。このような場合は、平坦な領域での複屈折を測定し、野生型の魚類(例えば、野生型魚と変異魚の両方で体節1〜10)の対応する領域の複屈折を記録します。
  11. 魚の複屈折表現型を観察します。
    1. 高度に組織化された骨格筋を持つ野生型の魚は、ミオフィラメントに平行な光の屈折率がこれらの構造に垂直な偏光よりも高いため、明るい複屈折を示します。
    2. 非変性ミオパチーまたは発達障害を示唆する無秩序な骨格筋を持つ魚は、通常、複屈折の全体的な減少を示します。
    3. 筋ジストロフィーに特徴的な骨格筋が乱れた魚は、一般的にパッチ状の複屈折パターンを示し、正常な筋肉構造の明るい領域の中で暗い領域が筋肉の変性を表します。
  12. 野生型魚と変異魚の偏光下で、同じ露光設定と倍率で画像を撮影することにより、複屈折を定量化します。画像を.tiffファイルとして保存します。
    1. ImageJソフトウェア(http://rsbweb.nih.gov/ij/)で複屈折画像を開きます。
    2. 各画像について、ツールバーの「ポリゴン選択」オプションを使用して体の周りに線を引いて、ゼブラフィッシュの筋肉の領域を選択します。
    3. 「分析」ドロップダウンメニューの下にある「測定値の設定」を使用して、画像に必要な統計を選択します。
      1. 最小選択では、「Area」、「Mean gray value」、および「Min & max gray value」のチェックボックスがオンになっている必要があります。
      2. 最大グレー値 >255 は、ピクセルの彩度を示します。したがって、最大グレー値が 255 未満の画像を使用してください。
    4. 選択した領域で平均強度を正規化し、複屈折画像ごとにこれと同じ定量化手順を繰り返します。

2. タッチ誘発型エスケープビヘイビアアッセイ

  1. 適切なゼブラフィッシュ系統の交配ペアを設定し、上記のステップ1.1-1.5で説明したように胚を採取します。
  2. 受精後2〜7日で、脱乳した胚/幼虫を個々の深部シャーレまたはマルチウェルプレートのチャンバーに入れます。
  3. 一度に1つの胚のみで作業し、胚をSPOT RT3デジタルカメラシステムなどを搭載したニコンSMZ1500実体顕微鏡の視野の中央に配置し、シーケンシャルイメージングを開始します。
    1. 野生型と変異型の両方の魚に同じ頻度のイメージングを使用する必要があります。フレームレートは>30Hzが推奨されますが、これは通常、低速のレートでは野生魚の速い泳ぎを捉えるには不十分です。
  4. 昆虫ピンで尾に触れることで、胚に機械感覚刺激を送り込みます。
  5. 胚が泳ぐのをやめたとき、または視野から泳いだときにイメージングを停止します。
  6. SPOT 5.1 Advancedソフトウェアを使用して、連続した画像をビデオファイルに変換したり、タイムラプス画像の個々のフレームをオフラインで分析したりできます。同様のソフトウェアパッケージには、Open Lab、NIS Elements、または無料で入手できるImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)が含まれます。
  7. 複数の胚で触覚誘発反応を行うことにより、遊泳行動を定量化します。
    1. これは、ソフトウェアまたはメトリックルーラーを使用して、水泳試合の開始点と終了点をマークし、胚が一定の時間間隔で泳ぐことができる距離を平均化することで達成できます。
    2. 胚が時間の経過とともに触覚刺激に慣れるのを防ぐには、実験の繰り返しごとに新しい胚でアッセイを実施します。野生型で信頼性の高い変異体モデルにおける振る舞いは、再現性が高い傾向があります。

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結果

複屈折は、生存しているゼブラフィッシュ胚における筋原線維組織の状態を明らかにするための、効率的かつ非侵襲的なアッセイとして利用できます。野生型ゼブラフィッシュ、および骨格筋の発達と機能に重要な遺伝子の発現が低下したゼブラフィッシュの例を提示します。受精後5日（5 dpf）の野生型ゼブラフィッシュは、筋フィラメントが規則正しく配列しているため、偏光下で非常に強い複屈折を示す骨格筋を呈します（Figures 2A-B）。対照的に、ジストログリカン遺伝子（dag1）に病原性変異を持つホモ接合体の同齢胚では、筋変性領域を示す斑点状の複屈折が見られます（Figures 2C-D）2。この斑点状のパターンおよび初期発生過程における筋変性の急速な進行は、他のジストロフィー魚類モデルと一致しています1,3。5 dpfのジストロフィー性dag1変異体の複屈折を定量化したところ、野生型の兄弟魚に見られる最大複屈折の27.9%±5.3まで輝度が有意に低下していることが分かりました。この低下は、3 dpfのミオパチ...

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ディスカッション

原発性神経筋障害は、伝統的にジストロフィー性または非ジストロフィー性プロセスとして分類されます。筋ジストロフィーは、筋線維変性とそれに続く再生の繰り返しを特徴とし、最終的には線維症に代表される末期プロセスと脂肪組織による置換につながります14。対照的に、非ジストロフィー性ミオパチーは壊死や再生変化とは関連しませんが、筋線維の乱れと全体的な骨格筋の衰弱を引き起こします。

ゼブラフィッシュモデルは、さまざまな神経筋疾患の分子経路と病因をよりよく理解するための非常に貴重なリソースとして近年浮上しています。迅速な 子宮外 発生、半透明の胚、高い生殖能力、ヒトと密接に関連するゲノムなど、このモデルシステムの一般的な利点に加えて、ゼブラフィッシュ病モデルはしばしばヒトの病気を密接に模倣します。骨格筋に欠陥のある多くのゼブラフィッシュは形態学的異常を持っていますが、一部の変異表現型は肉眼的に正常であり、より詳細な特徴付けが必要です。これらおよびすべてのケースについて、筋肉の損傷と衰弱の程度は、複屈折および接触誘発脱出行動の非侵襲的 in vivo<...

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

複屈折画像の定量化に素晴らしい協力をしてくれたBehzad Moghadaszadehに感謝します。 この研究は、米国筋ジストロフィー協会(MDA201302)と国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(R01 AR044345)から資金提供を受けたほか、A Foundation Building Strength、Cure CMD、AUism Charitable Foundationからの寛大な支援を受けました。 VAGは、National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin DiseasesのK01 AR062601によってサポートされており、LLSはNational Institute of Neurological Disorders and StrokeのF31 NS081928によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
トリカインシグマA5040
ペトリ皿フィッシャーサイエンティフィック0875711Z
鉗子フィッシャーサイエンティフィック100189-588昆虫
ピンフィッシャーサイエンティフィS67375
偏光レンズリッツカメラクォンタレイトライスターオプティクスC-PL72mm
インキュベーターフィッシャーScientificIsotemp Incubator Model 630D
顕微鏡ニコンインスツルメンツSMZ 1500
カメラ診断機器株式会社SPOT RT3
イメージングソフトDiagnostic Instruments Inc.SPOT 5.1 詳細
ック

参考文献

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