方法論記事

マウス大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症の病変の定量分析とキャラクタリゼーション

DOI：

10.3791/50933

⸱

2013年12月7日

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1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

この記事について

サマリー

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大動脈洞と上行大動脈の精密切片化と組織化学的および免疫組織化学的分析を組み合わせて、マウスモデルのアテローム性動脈硬化病変を定量化し、特徴付ける手順について説明します。

要約

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アテローム性動脈硬化症は、大動脈の病気であり、心筋梗塞や脳卒中の主な根本的な原因です。この疾患の分子および細胞の病態生理学の研究を容易にするために、いくつかの異なるマウスモデルが開発されています。この原稿では、マウス大動脈洞および上行大動脈におけるアテローム性動脈硬化性病変の定量化と特性評価のための特定の手法について説明します。この手順の利点は、病変の断面積と総体積を正確に測定できることであり、これを使用して、異なる治療グループ間でのアテローム性動脈硬化症の進行を比較できます。これは、解剖学的なランドマークとして弁尖を使用し、切片化角度を慎重に調整することで可能になります。また、アテローム性動脈硬化症の進行を特徴付けるために使用できる基本的な染色方法についても説明します。これらは、研究者が特定の関心のある抗原を調査するためにさらに改変することができます。記載されている技術は、一般に、アテローム発生の既存および新たに作成された食事モデルおよび遺伝的に誘導された多種多様なモデルに適用できます。

概要

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過去20年間で、食事および/または遺伝子操作によるアテローム性動脈硬化症になりやすいマウスモデルの開発と使用により、アテローム性動脈硬化症病変の発生に関与する分子的および細胞的メカニズムについての理解が大幅に増加しました1-3。アテローム発生に関する私たちの知識と理解の大部分は、アテローム性動脈硬化性病変が自然に発症し、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)欠損5のアポリポタンパク質(Apo)-E欠損マウスで行われた研究から来ています4マウスで実施された研究から来ています。 アテローム性動脈硬化症が食事療法によって誘発されるマウス。これらのモデルの重要な利点は、制御された食事および環境条件下で、比較的多数の遺伝的に定義された動物の研究を可能にすることです。さらに、これらのマウス系統の一部で発生する進行したアテローム性動脈硬化症病変は、ヒト被験者で観察されたものと非常に類似していると考えられ、脂質で満たされた壊死性コアと線維性キャップが含まれています。アテローム性動脈硬化症は、これらのマウスモデルで急速に進行し、脂肪線から進行したプラークまでの病変の発達を数週間で研究することが非常に実現可能になります。さらに、糖尿病6、脂質異常症7、肥....

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プロトコル

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マクマスター大学の動物研究倫理委員会は、ここに記載されているすべての手順を事前に承認しています。

1. 心臓と大動脈の収穫

  1. マウスに麻酔をかけ、胸腔を慎重に開いて心臓と近位大動脈を明らかにします。
    1. 心臓の右心室に直接句読点を付けてマウスから血液を抽出します。
      注:血液は保存され、血漿脂質やその他の血液媒介因子の分析に使用できます。
  2. 子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。
  3. 血管系を5mlの生理食塩水ですすいでください
    注:これは、左心室への針穿刺による重力灌流によって達成されます。ドレナージを可能にするために、右側のアトリウムに小さな切開が行われます。血管系をすすぎた後、肝臓、筋肉、脂肪組織の組織サンプルを採取し、液体窒素で瞬間凍結し、将来の分析のために-80°Cで保存することができます。
  4. 血管系は、重力灌流によって10%の中性緩衝ホルマリンで左心室に固定されます.
    注:灌流が開始されると、10%中性緩衝ホルマリンの流れがゆっくりとしたドリップに調整されるため、プロセスには1〜2分かかります。灌流固定された臓器や組織は、免疫蛍光法や組織化学法によるタンパク質発現の研究に使用できますが、一般的にはウェスタンブロッティングや遺伝子発現の研究のためのサンプルとして使用することはできません。
    5. ....

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結果

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5週齢のLDLR-/-マウスに標準食または高脂肪食を10週間与えました。マウスを屠殺し、上記のようにホルマリンで灌流した。大動脈洞の断面を調製し、ヘマトキシリンとエオシンで染色して、病変の面積と体積を決定しました(図4)。マウスに標準的なチャウ食を与えた場合、アテローム性動脈硬化症の発症は非常に限られており、15週齢では検出できない場合があります。高脂肪食は、このモデルでアテローム発生を大幅に加速し、壊死性無細胞コアと線維性キャップを含む大きな進行性病変の形成を誘導します。

アテローム性動脈硬化症の病変は、病変の発生段階を定義する特定の細胞タイプと因子の存在を染色することによってさらに特徴付けることができます。単球の内膜への浸潤は、アテローム発生の最も初期のイベントの1つです。内膜単球はマクロファージに分化し、マクロファージが細胞の破片や脂質を飲み込みます。泡沫細胞として知られる脂質充血したマクロファージは、動脈壁に「脂肪筋」を作り出します。

マクロファージ/泡沫細胞は、F4/80.......

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ディスカッション

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アテローム性動脈硬化症は、心筋梗塞や脳卒中の主な根本的な原因である大筋動脈の複雑な慢性疾患です。疾患の進行には、動脈壁内の多くの異なる細胞型と、循環血球、リポタンパク質粒子、その他の血液由来の因子が相互作用することが含まれます。アテローム性動脈硬化症の発症と進行に関する現在の知識の多くは、特別に設計されたアテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスモデルシステムで実施された研究から来ています。

アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにはいくつかの重大な制限があることを覚えておくことが重要です。明らかに、マウスはヒト被験者と比較して、血管のサイズと表面積、血流、脈拍数、血圧、せん断応力に大きな違いがあります。ヒトにおけるほとんどの心筋梗塞の直接的な原因である病変破裂および動脈血栓症は、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスモデルの大部分では観察されません。さらに、これらの株には遺伝的多様性が一般的に欠如しているため、実験結果のばらつきが減少しますが、説明が困難な病状に人為的な制約も導入されます。したがって、ヒト心血管疾患に関してこれらのマウスモデルから収集されたデータの解釈と外挿には.......

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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この研究は、カナダ健康科学研究所とカナダ糖尿病協会からの運営助成金によって資金提供されました。DEVは、Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica(CONICYT、チリ)からの奨学金によってサポートされています。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LDLR欠損マウス (D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)ジャクソン研究所の株式#002207
ホルマリンシグマ-アルドリッチHT5011
組織学金型テッドペラ株式会社27195
パラフィンパラマット19286-10
コーティングスライドフィッシャー12-550-15
溶剤容器ティッシュテックII4457
ミクロトームライカRM22S5
ウォーターバスVWR80086-982
リンパスBX41TF
カメラリンパスDP72ImageJ
NIHwww.rsbweb.nih.gov/ij/
プロセッサSakura FinetekVIP6-A1
カセット処理VWR18000-134
Preassure CookerNordic Ware
Coverslip Fisher12-545-M
PBS Sigma-AldrichP3813
ミクロトームブレードThermo Scientific30-518-35
褪色防止封入媒体Sigma-AldrichF-4680
キシレン埋込ミディアム Sigma-Aldrich44581
Aquous 実装媒体Sigma-AldrichI1161
Mac-3 anbodyBD Pharmingen553322
DAPISigma-AldrichD9542
F4/80 抗体AbcamAb6640
Alpha actin antibodySanta Cruz BiotechnologySC-32251
Mayer’S ヘマトキシリンSigma-AldrichE4382
エオシン YSigma-AldrichMHS16
DAB (3,3'-ジアミノベンジジン)DakoK3468
顕微鏡オオ

参考文献

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  1. Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).
  2. Daugherty, A., Rateri, D. L. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice.

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LDLR

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