マウス大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症の病変の定量分析とキャラクタリゼーション

サマリー

大動脈洞と上行大動脈の精密切片化と組織化学的および免疫組織化学的分析を組み合わせて、マウスモデルのアテローム性動脈硬化病変を定量化し、特徴付ける手順について説明します。

要約

アテローム性動脈硬化症は、大動脈の病気であり、心筋梗塞や脳卒中の主な根本的な原因です。この疾患の分子および細胞の病態生理学の研究を容易にするために、いくつかの異なるマウスモデルが開発されています。この原稿では、マウス大動脈洞および上行大動脈におけるアテローム性動脈硬化性病変の定量化と特性評価のための特定の手法について説明します。この手順の利点は、病変の断面積と総体積を正確に測定できることであり、これを使用して、異なる治療グループ間でのアテローム性動脈硬化症の進行を比較できます。これは、解剖学的なランドマークとして弁尖を使用し、切片化角度を慎重に調整することで可能になります。また、アテローム性動脈硬化症の進行を特徴付けるために使用できる基本的な染色方法についても説明します。これらは、研究者が特定の関心のある抗原を調査するためにさらに改変することができます。記載されている技術は、一般に、アテローム発生の既存および新たに作成された食事モデルおよび遺伝的に誘導された多種多様なモデルに適用できます。

概要

過去20年間で、食事および/または遺伝子操作によるアテローム性動脈硬化症になりやすいマウスモデルの開発と使用により、アテローム性動脈硬化症病変の発生に関与する分子的および細胞的メカニズムについての理解が大幅に増加しました^1-3。アテローム発生に関する私たちの知識と理解の大部分は、アテローム性動脈硬化性病変が自然に発症し、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)欠損5のアポリポタンパク質(Apo)-E欠損^{マウスで行われた研究から来ています4}マウスで実施された研究から来ています。 アテローム性動脈硬化症が食事療法によって誘発されるマウス。これらのモデルの重要な利点は、制御された食事および環境条件下で、比較的多数の遺伝的に定義された動物の研究を可能にすることです。さらに、これらのマウス系統の一部で発生する進行したアテローム性動脈硬化症病変は、ヒト被験者で観察されたものと非常に類似していると考えられ、脂質で満たされた壊死性コアと線維性キャップが含まれています。アテローム性動脈硬化症は、これらのマウスモデルで急速に進行し、脂肪線から進行したプラークまでの病変の発達を数週間で研究することが非常に実現可能になります。さらに、糖尿病⁶、脂質異常症⁷、肥満⁸、高血圧⁹、タバコの煙¹⁰、および座りがちな環境¹¹を含むヒトの心血管疾患の既知の危険因子は、病変の発症をさらに加速することが示されています。

すべてではないにしても、ほとんどのアテローム性動脈硬化症になりやすいマウスモデルでは、病変の発生は最初に大動脈洞で検出できます。発症時期はマウスの系統と食事によって異なります。病変のサイズが大きくなると、上行大動脈まで成長する傾向があります。ApoE-/-およびLDLR-/-マウスでは、その後の病変の進行は、大動脈弓の大動脈分岐部、下行大動脈、およびその他の大きな動脈で検出できます^12-14。Beverly Paigen博士らは、食事誘発性アテローム性動脈硬化症の最も初期のモデルのいくつかを開発しただけでなく、マウスモデル¹⁵の病変測定の標準となっている大動脈洞のアテローム性動脈硬化性病変の定量化のためのアッセイも確立しました。何年にもわたって、この技術は洗練され、詳細に説明されてきました¹⁶。ここでは、マウスのアテローム性動脈硬化性病変の定量化と特性評価のための「Paigen法」の修正版を紹介します。特定の血管領域から、定義された固定された向きで連続した大動脈断面積の分析により、正確なデータ収集が容易になり、さまざまな治療グループでの病変発生の変動を正確に検出できます。ここで紹介する方法は、前の手法に基づいています。具体的には、組織化学と免疫組織化学の組み合わせを使用した連続切片の検査を通じて、面積、体積、壊死性、および細胞内容の観点から病変の特性評価がどのように可能になるかを説明します。

プロトコル

マクマスター大学の動物研究倫理委員会は、ここに記載されているすべての手順を事前に承認しています。

1. 心臓と大動脈の収穫

1. マウスに麻酔をかけ、胸腔を慎重に開いて心臓と近位大動脈を明らかにします。
   1. 心臓の右心室に直接句読点を付けてマウスから血液を抽出します。
      注:血液は保存され、血漿脂質やその他の血液媒介因子の分析に使用できます。
2. 子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。
3. 血管系を5mlの生理食塩水ですすいでください
   注:これは、左心室への針穿刺による重力灌流によって達成されます。ドレナージを可能にするために、右側のアトリウムに小さな切開が行われます。血管系をすすぎた後、肝臓、筋肉、脂肪組織の組織サンプルを採取し、液体窒素で瞬間凍結し、将来の分析のために-80°Cで保存することができます。
4. 血管系は、重力灌流によって10%の中性緩衝ホルマリンで左心室に固定されます.
   注:灌流が開始されると、10%中性緩衝ホルマリンの流れがゆっくりとしたドリップに調整されるため、プロセスには1〜2分かかります。灌流固定された臓器や組織は、免疫蛍光法や組織化学法によるタンパク質発現の研究に使用できますが、一般的にはウェスタンブロッティングや遺伝子発現の研究のためのサンプルとして使用することはできません。
5. 死体から心臓と約2mmの近位大動脈を慎重に抽出します。下行性大動脈を含む他の組織を採取し、その後の分析のために保存することができます
   注:下行大動脈(腸骨分岐部へ)は、アテローム性動脈硬化症の検査にも使用できます。
6. 上行大動脈に対して垂直になるように、切除した心臓にメスで横切開を行います.
   注:これは、解剖顕微鏡の使用によって容易になり、左右の心房の下端を結ぶ直線に沿って切断することで効果的に行うことができます(図1)。
7. 心臓の頂端部(上部)を埋め込みカセットに保管し、中性緩衝ホルマリンに浸して処理します。

2. 大動脈の準備

1. 解剖した組織を入れたカセットをティッシュプロセッサーに入れます。
2. 組織サンプルの処理.
   注:一般的に、ティッシュプロセッサーは、手術の長さとこのプロセスに関連する溶液のために、一晩中作業するようにプログラムされています。サンプルは、確立されたプロトコルに従って処理されます。
   1. 10% 中性緩衝ホルマリンを 42 °C で 1 時間
   。
   2. 10% 中性緩衝ホルマリンを 42 °C で 1 時間
   。
   3. 70%エタノールを40°Cで30分間
   。
   4. 85%エタノールを40°Cで30分間
   。
   5. 100%エタノールを40°Cで45分間
   。
   6. 100%エタノールを40°Cで45分間
   。
   7. 100%エタノールを40°Cで45分間
   。
   8. キシレンを40°Cで1時間
   。
   9. キシレンを40°Cで1時間
   。
   10. キシレンを40°Cで1時間
   。
   11. パラフィンワックスを63°Cで45分間
   。
   12. パラフィンワックスを63°Cで45分間
   。
   13. パラフィンワックスを63°Cで45分間
   。
   14. パラフィンワックスを63°Cで45分間
   。
3. パラフィンワックスを62°Cで一晩溶かします(図1D-E)。組織型を充填するために必要なパラフィンワックスのグラム数と準備するブロックの数に基づいて、使用するパラフィンワックスの総量を見積もります。
   注:深い組織型は、切片化時に回転角が広くなるため、浅い型よりも好まれます。1つの深い組織型には、11gのパラフィンワックスが必要です。
4. 処理した各組織を深い組織型に入れ、溶かしたパラフィンワックスを注いで型を完全に満たします(図1F)。ラベル付きのプラスチックカセットで金型を覆います(図1G)。
5. 充填された型を氷上または冷たい表面(図1H)で冷却して、固体ブロックを作成し、ブロックを型から分離します(図1I-J).
   注意: 解剖した心臓を型に入れるときは、心臓の内面が型の底部に触れていることを確認してから、ブロックに溶けたパラフィンを充填します。ラベル付きのプラスチックカセットは、ブロックを処理するためのベースを提供するために、固化する前に金型を覆います。冷却後、型を取り出し、パラフィンブロックを室温で無期限に保存できます。

3. 大動脈の切片化

1. ミクロトームの標本ホルダーに心臓を載せたブロックを、内側から心臓の上部に向かって切片化できるように配置します(図2)
2. ミクロトームを調整して切片の厚さを10μmに切り取り、心臓の切片化に進みます。
3. スライドガラス上の切片を採取し、光学顕微鏡で観察して位置と向きを決定します。
4. 大動脈洞の1つまたは2つの弁が明らかになったら、必要に応じてブロックの角度を調整します(図3A).
   注:洞は、リーフレットが取り付けられた3つの二部弁ベースとして表示される必要があります。1つまたは2つのバルブリーフレットのみが観察される場合は、それに応じて切断角度を調整する必要があります。
5. ミクロトームを4〜5μmでカットするように調整し、コーティングされたスライドガラス上の切片を収集します.
   注:手順はさまざまですが、大動脈洞から上行大動脈まで進む最初の10の切片をラベル付きスライドガラス(1〜10のラベルが付いたスライド)の上部に集める体系的なアプローチが推奨されます。後続の切片は、アテローム性動脈硬化病変が観察されなくなるまで、#11-20、#21-30、#31-40という同じパターンに従って収集されます(図3B)。このようにして、アテローム性動脈硬化病変を上行大動脈に沿った正確な位置で検査し、特徴付けることができます。たとえば、スライド 1 には、セクション 1、11、21、31、41、51 があり、大動脈洞から上行大動脈までのアテローム性動脈硬化病変を表しています。11〜20とラベル付けされた追加のスライドは、病変が大きい場合、同じパターンに従ってより多くの遠位切片を収集するために含めることができます。
6. アテローム性動脈硬化病変が観察されなくなるまで切片の収集を続けます.
   注:スライドは、さらなる分析の前に、室温で数ヶ月間保存することができます。

4. アテローム性動脈硬化性病変の染色と定量化

アテローム性動脈硬化性病変は、さまざまな手法を使用してさまざまな方法で分析できます。最も基本的な分析には、病変の断面積の決定が含まれます。病変領域を正確に比較するためには、病変測定の開始点がサンプルごとに一貫していることが重要です。これは、向きにバルブリーフレットを使用することで容易になります。病変領域の正確な同定と定量化を容易にするために、選択した断面をヘマトキシリンとエオシンで染色します。これには、スライドを一連の溶液に指定された時間浸すことが含まれ、これにより組織が脱パラフィン/染色されます。

ヘマトキシリンおよびエオシン染色のためのプロトコル:

1. スライドをエアドライヤーに8分間入れてから、キシレンで4×を洗浄して切片を脱パラフィンします。
2. スライドを100%エタノールで3×それぞれ3分間洗浄します。
3. 3×を70%エタノールで各3分間洗浄し、次に2×を50%エタノールで各3分間洗浄します。
4. 蒸留水ですすぎ、メイヤーのヘマトキシリンに15分間浸します。
5. 水道水で5分間洗い、次に蒸留水で5分間洗います。
6. Eosin Yに1〜5分間浸します。
7. 蒸留水で3×各5分間洗浄し、50%エタノールで2×各2分間洗浄し、次に70%エタノール3×各2分間
洗浄します。
8. 100%エタノールで3×各2分間洗浄し、次にキシレン4×で各2分間洗浄します。
9. キシレンベースの封入媒体で切片を封止し、光学顕微鏡に取り付けたデジタルカメラで画像を撮影します。
10. イメージングソフトウェアを使用して病変領域を特定し、定量化します.
    注:病変領域は、大動脈洞から特定の距離で40〜50μm間隔で決定できます(各セクションの厚さによって異なります)。これらの面積測定値と距離のプロットは、アテローム性動脈硬化症の病変のプロファイルを提供します(図4)。曲線の下の面積は、アテローム性動脈硬化症病変の総体積の推定値を表しています。病変のさらなる特徴付けには、壊死領域の決定が含まれることができる。進行性病変の壊死性コア(nc)は、アポトーシス泡沫細胞によって形成されます。実践を重ねると、これはヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の無細胞領域を調べることで決定できます(図4A)。初期の病変では壊死がほとんどない傾向がありますが、より進行した病変では壊死領域が増加し、プラークの不安定性に寄与する可能性があります。同じ大動脈の連続切片を検査して、壊死領域の存在を確認する必要があります。.

5. アテローム性動脈硬化性病変のさらなる特徴付け

特定の細胞タイプまたはマーカーに対する抗体で染色することにより、アテローム性動脈硬化症の発症段階に関する特定の詳細を決定できます。パラフィン切片の免疫組織化学は、周囲の未染色組織の状況下で特定の細胞タイプまたはマーカーを同定するために使用される標準的な手法です。抗原検出は、一般に西洋ワサビペルオキシダーゼ基質を用いて達成されます。

免疫蛍光染色は、蛍光色素標識抗体の使用を伴い、検出には蛍光顕微鏡と適切なフィルターが必要です。この技術により、2つ(またはそれ以上)の抗原を同時に染色することができます。

免疫組織化学染色の一般プロトコル:

1. スライドをエアドライヤーに8分間入れます。
2. キシレンの4つの変更でセクションをデパラフィン、3分それぞれ。
3. 100%エタノールで3×ずつ3分間洗浄し、キシレンを除去します。
4. 3×を70%エタノールで各3分間洗浄し、次に2×50%エタノールで各3分間洗浄します。
5. 蒸留水で各5分間洗浄し、次にPBSで3×を各5分間洗浄します。
6. 抗原賦活化を行います。これは、マイクロ波圧力鍋および抗原賦活化溶液(10 mMクエン酸緩衝液、pH 6.0)で熱誘起エピトープ賦活化(HIER)法を使用して達成できます
   注:ホルマリン固定のプロセスは、目的の抗原を隠す可能性があります。私たちの経験では、HIERは一部の抗体の性能を大幅に向上させますが、他の抗体には必要ではありません。さらに、抗原賦活化のHIER法に代わる他の方法もあります。
7. 圧力鍋が冷めたら、スライドをPBSに15分間入れます。
8. 正常な血清(二次抗体が由来したのと同じ種由来)の切片を30分間インキュベートします。
9. 一次抗体を正常ブロッキング血清で希釈した一次抗体と室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベー
トします。
10. PBS 3×で各5分間洗浄します。
11. ビオチン化二次抗体をPBSで室温で1時間希釈した切片とインキュベートします。
12. スライドを西洋ワサビペルオキシダーゼストレプトアビジンと30分間インキュベートし、PBSで3×それぞれ5分間洗浄します。
13. 発色反応-スライドを新鮮なDAB(3,3'-ジアミノベンジジン)で5〜30分間インキュベートします。この反応は顕微鏡を使用して監視する必要があります。水道水でスライドを洗って反応を止めます。
14. ヘマトキシリンで1分間対比染色し、水道水で5分間洗浄した後、蒸留水で3×5分間各5分間洗浄します。
15. スライドの取り付けについては、手順4.7〜4.9を繰り返します。

6. 免疫蛍光染色の一般プロトコール

同様のプロトコルを、わずかな変更を加えて、免疫蛍光染色にも使用できます。

1. スライドをエアドライヤーに8分間入れてから、キシレンを4回交換し、それぞれ3分間、切片を脱パラフィンします。
2. 100%エタノールで3×ずつ3分間洗浄し、キシレンを除去します。
3. 3×を70%エタノールで各3分間洗浄し、次に2×50%エタノールで各3分間洗浄します。
4. 蒸留水で各5分間洗浄し、次にPBSで3×各5分間洗浄します。
5. 抗原賦活化を行います。これは、マイクロ波圧力鍋および抗原賦活化溶液(10 mMクエン酸緩衝液、pH 6.0)で熱誘起エピトープ賦活化(HIER)法を使用して達成できます
   注:ホルマリン固定のプロセスは、目的の抗原を隠す可能性があります。私たちの経験では、HIERは一部の抗体の性能を大幅に向上させますが、他の抗体には必要ではありません。さらに、抗原賦活化のHIER法に代わる他の方法もあります。
6. 圧力鍋が冷めたら、スライドをPBSに15分間入れます。
7. 正常な血清(二次抗体が由来したのと同じ種由来)の切片を30分間インキュベートします。
8. 一次抗体を正常ブロッキング血清で希釈した一次抗体と室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベー
トします。
9. PBS 3×で各5分間洗浄します。
10. 正常ブロッキング血清(またはPBS)で希釈した二次蛍光色素標識抗体を添加します。室温で1.5時間インキュベートします。
11. PBS 3×で各5分間洗浄します。
12. DAPIで対比染色します。
13. PBS 3×で各5分間洗浄します。
14. 色あせ防止封入剤を使用してカバースリップを塗布します。

結果

 5週齢のLDLR-/-マウスに、標準食または高脂肪食を10週間投与した。マウスを犠牲にし、上述の手順に従ってホルマリンで灌流した。大動脈洞の横断切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、病変の面積および体積を測定した（図4）。標準的な飼料を投与した場合、動脈硬化の発達は非常に限定的であり、15週齢の時点では検出できない可能性がある。本モデルにおいて高脂肪食は動脈硬化を著しく促進し、壊死性の無細胞コアと線維性被膜を含む、進行した巨大な病変の形成を誘導する。

動脈硬化病変は、病変形成の段階を定義する特定の細胞型や因子の存在を染色することで、さらに詳細に特徴づけることができます。内膜への単球浸潤は、アテローム形成における最も初期のイベントの一つです。内膜の単球はマクロファージへと分化し、細胞 debris や脂質を貪食します。泡沫細胞として知られる脂質を蓄積したマクロファージは、動脈壁に「脂肪線条」を形成します。

マクロファージ/泡沫細胞は、F4/80¹⁷、...

ディスカッション

アテローム性動脈硬化症は、心筋梗塞や脳卒中の主な根本的な原因である大筋動脈の複雑な慢性疾患です。疾患の進行には、動脈壁内の多くの異なる細胞型と、循環血球、リポタンパク質粒子、その他の血液由来の因子が相互作用することが含まれます。アテローム性動脈硬化症の発症と進行に関する現在の知識の多くは、特別に設計されたアテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスモデルシステムで実施された研究から来ています。

アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにはいくつかの重大な制限があることを覚えておくことが重要です。明らかに、マウスはヒト被験者と比較して、血管のサイズと表面積、血流、脈拍数、血圧、せん断応力に大きな違いがあります。ヒトにおけるほとんどの心筋梗塞の直接的な原因である病変破裂および動脈血栓症は、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスモデルの大部分では観察されません。さらに、これらの株には遺伝的多様性が一般的に欠如しているため、実験結果のばらつきが減少しますが、説明が困難な病状に人為的な制約も導入されます。したがって、ヒト心血管疾患に関してこれらのマウスモデルから収集されたデータの解釈と外挿には...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
LDLR欠損マウス (D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)	ジャクソン研究所	の株式#002207
ホルマリン	シグマ-アルドリッチ	HT5011
組織学金型	テッドペラ株式会社	27195
パラフィン	パラマット	19286-10
コーティングスライドフィ		ッシャー12-550-15
溶剤容器	ティッシュテックII	4457
ミクロトーム	ライカ	RM22S5
ウォーターバス	VWR80086-982
	リンパス	BX41TF
カメラ	リンパス	DP72ImageJ
	NIH	www.rsbweb.nih.gov/ij/
プロセッサ	Sakura Finetek	VIP6-A1
カセット処理	VWR	18000-134
Preassure Cooker	Nordic Ware
	Coverslip Fisher	12-545-M
PBS Sigma-Aldrich		P3813
ミクロトームブレード	Thermo Scientific	30-518-35
褪色防止封入媒体	Sigma-Aldrich	F-4680
キシレン埋込ミディアム	Sigma-Aldrich	44581
Aquous 実装媒体	Sigma-Aldrich	I1161
Mac-3 anbody	BD Pharmingen	553322
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
F4/80 抗体	Abcam	Ab6640
Alpha actin antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-32251
Mayer’S ヘマトキシリン	Sigma-Aldrich	E4382
エオシン Y	Sigma-Aldrich	MHS16
DAB (3,3'-ジアミノベンジジン)	Dako	K3468