人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

サマリー

血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。

要約

血液脳関門（BBB）は、しっかりと脳環境を制御する不透過性はなく適応脳毛細血管を含む。 BBBの障害は、臨床的に関連の研究を助けるために、インビトロ BBBモデルにおいてヒトの開発の必要性が生じ、多くの脳の病態の病因に暗示されている。これまでに説明した数々のBBBモデル、（フローなし）静的な中では、星状細胞および脳内皮細胞（BECは）は、多孔質膜の両側に共培養されたBBBモデルを連絡し、シミュレートするために、簡略化され、まだ本格的なシステムとして登場ハイスループットスクリーニング能力を有するBBB。それにもかかわらず、このようなモデルの生成は、いくつかの技術的な課題を提示。ここでは、一次ヒトBECはと不死化ヒトアストロサイトの新規な組み合わせを利用したコンタクト人間BBBモデルの製造のためのプロトコルを記述します。具体的には、詳細な反転インサート上の細胞播種のための革新的な方法だけでな​​く、inserを指定T染色技術と、我々は、BBB関連の研究のための我々のモデルをどのように使用するかを例示している。

概要

BBBは、末梢血液循環および脳止血の維持に決定的に責任が中枢神経系との間の特殊なインタフェースである。それは、機能的に脳内にしっかりと動的ゲートウェイを形成するために（下記参照）、いくつかの細胞性および無細胞成分によって影響される別個の脳微小血管内皮細胞（前記下部電極）を含む。生理的条件下でBBBは、脳内に、血液細胞、血漿成分と有害物質、すべての潜在的に神経毒性の通過を制限する。並行して、BBBを選択的に脳および脳正確に環境^を維持するために^、1,2の循環の間にキーイオンおよび栄養素（グルコースおよびアミノ酸）および代謝老廃物を交換する。近年、BBBの障害が神経変性または炎症関連疾患（ 例えば、アルツハイマー病およびmultiplのような慢性の脳の病理の多様で起こることが明らかになってきているEは³だけでなく、虚血性脳卒中⁴のような急性状態で）それぞれ硬化症。

脳内皮細胞（BECは）の固有のBBB特性は、主にそれらの脳環境⁵によって誘導され、特にアストロサイト^6,7によってれる。これと同時に「神経血管装置」（NVU）と呼ばれるような周皮^8、ニューロンとミクログリア^1,3だけでなく、基底膜^9、サポートBECはなどの他の細胞型、という機能ユニットを一緒になって成長して理解することがありますカップル彼らの供給毛細血管¹⁰への神経代謝要求。

病理学的状況でのBBBの関与は、BBB関連の研究^11,12を支援するためにin vitro BBBモデルで開発する多くの試みの下にある。これらのモデルは、NVU原理に従って生体 BBB特性にできるだけ近くを模倣することを目指しています。 インビトロ BBBモデルは、一般的に（、（主に牛¹³から、人間の^14、ラット^15、マウス^16、およびブタ^17,18起点）タイトジャンクションを形成する前記下部電極の単層上に多孔質膜上で培養し、一緒支えるアストロサイトに依存して広範囲にデリら 2005 ^11）によって検討。

星状細胞は、培養培地がまだ可溶性因子を介して前記下部電極¹⁶と通信することによって、（膜の上面上で培養）前記下部電極から分離されたウェルの組織培養の底面上に非接触状態で増殖させることができる。より良い生体内で BBBの解剖学的構造に似ている、より高度なモデルでは、アストロサイトが直接前記下部電極^13,15,17（ 図1）に近接した膜の反対側に接触条件で培養で維持されています。この構成は、確立され、前記下部電極とアストロサイトとの間の物理的な接触を可能にするときアストロサイトプロジェクト多孔質膜を通って、そのプロセス。アストロサイトのエンドフィートは小さい細孔サイズ（ すなわち 0.4ミクロン^）14,15を通過することができないため、重要なのは、発生する真の接触のための細孔は、直径1μmのを≥必要があります。注目すべきことに、コンタクトBBBシステムは、それらの経内皮電気抵抗（TEER）および種々のトレーサー^13,17,18の内皮透過性値に関して、それらの非接触型対応物よりも優れていることがいくつかの研究で実証されている。メディアフローの追加の次元が最近、脳血管系^12,19の近いシミュレーションに内皮にせん断力を加えるためのin vitro BBBモデルの数に追加されました。

コンタクトBBBモデルを生成する際に克服する一つの技術的な障害は、多孔質膜の反管腔側表面上の重力に抗して星状細胞の播種である。アストロサイトは、単に内の一番上のメディアの落下に播種した前回のプロトコル^13,20、verted挿入、許される唯一の短い播種回適切な細胞の付着のためには不十分であることが私たちの手で発見された（ すなわち 、10分¹³または2時間^20）。この基本的な方法を用いて、より長いアストロ装着期間は、特に、（温度、pH、湿度の変動を引き起こす）​​インキュベーターの頻繁な開口部によってインサートの常時監視を必要とし、また、孔を通る媒体の漏れに起因する不均一な細胞播種する傾向がある細孔場合が1μmよりも大きいが使用される。

ここでは、コンタクトBBBモデルの製造のための一般的なプロトコルを記載している。我々の手順は、上述の制限に対処反転インサート上の細胞播種のための代替の方法を含む。この方法は、長時間にわたって、平衡化したインキュベーター中、反管腔側膜表面上への星状細胞の乱されない付着を可能にする。その結果、星状細胞の均一な播種は、バリア品質を向上が達成されると挿入の間、基礎透過性の変動を最小限に抑えることができます。

ヒト細胞の使用は、人間が関連する研究²¹のために重要であるとして、我々は、さらに、この記事で初代ヒトBECは、新規な組み合わせの具体的な利用を実証し、ハイスループットスクリーニング能力との接触人間BBBモデルの確立のための人間のアストロサイトを不死化。多孔性膜上に細胞を観察すると、多孔質膜上に合流し、細胞形態の決定を補助することができる困難で、また我々の詳細を染色技術とすることができるからである。 BBB上 - 急性虚血性脳卒中のための唯一の治療選択肢となって血栓破裂酵素 - 最後に、私たちは私たち人間のBBBモデルは、組織型プラスミノーゲン活性化因子の影響（T-PA）を調べるために利用することができる方法の例である。

プロトコル

1。細胞培養（前はBBB総会に3〜7日）

1.1。初代ヒト脳微小血管内皮細胞（BECは）

BECは、商業的に入手した。細胞を、正常なヒト脳皮質組織のディスパーゼ解離によって生成され、通路3（<12回の集団倍加）で凍結提供された。

1. 基層 ：メーカーの指示に従って「接着因子」とコート組織培養容器。
2. 細胞の維持 ：血清含有完全培地中で前記下部電極を維持します。実験のために、完全無血清培地での培養BECは。加湿5％CO ₂で細胞を維持し、37℃で21％O ₂インキュベーター
   注 ：DMEM/F-12を15mMのHEPES、10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）を補充しながら、特殊な試薬に代わるものとして、0.1％（w / v）のゼラチン溶液をコーティング試薬として働くことができる、 2mMのL-グルタミン、50μgの/ mlのゲンタマイシン、20μg/ mlのヘパリン、および20μg/ mlの内皮細胞増殖サプリメントは、BECのメンテナンスのために使用することができる。
3. 、1:6 1:3の割合で分割コンフルエントBECは、次の使用を目的とし、時間（3-7日）に応じて、次の実験のために継代培養 。 3日ごとに維持培地を変更します。 15の通路に前記下部電極を使用してください。

1.2。 SVGのヒト胎児アストログリア細胞株

SVGヒト胎児アストログリア細胞^22は、本来複製欠損シミアンウイルス40で形質転換したヒト胎児脳の初代培養に由来した。

1. メンテナンス ：20％（v / v）のFCS（それらの親の一次細胞^22を維持するために使用されるのと同じ血清百分率）、2mMのL-グルタミン、50 U / mlのペニシリンを補充したアールの平衡塩溶液で最小必須培地中で培養SVG細胞および50μg/ mlのストレプトマイシン。加湿した5％CO _{2、21％O 2}中で細胞を維持するインキュベーター
2. 次の使用を目的とし、時間（3-7日）に応じて、1:5〜1:10の比率で分割コンフルエントSVGs： 実験のために継代培養 。トリプシンの除去により、培地中の血清の高含量に必要とされない。 3日ごとに培地を変更します。 20継代まで使用SVGs。

2。ヒトにおける体外 BBBモデルの組み立てと共培養（0日目）

コメント ： 体外接触BBBモデルにおける人間は変更を加えて、公開されたプロトコル^13,23に従って製造されている。

2.1。インサートのコーティング

1. 付属24ウェルプレートのウェルに組織培養インサート（ポリエステル多孔質膜と、直径6.5ミリメートル、3ミクロンの細孔サイズ）を配置します。コー​​トインサートの管腔側表面 一晩のラットコラーゲンで加湿した37℃のインキュベーター内のI（20μgの個/ cm ^2、132μgの50μlの/ mlのコラーゲンのMilli-Q水中0.02％酢酸中のI（MQH ₂ O））。残留酸を除去しMQH ₂ Oで（反管と管腔側からの両方）を1回の挿入を洗ってください。
   注意：脳の毛細血管の基底膜にはコラーゲンが含まれていない私が、主にラミニン、コラーゲンIV型アイソフォーム、ナイドジェン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン^9。このため、一部の研究者は、そのようなより本物BBBモデリングのためのコラーゲンIV、フィブロネクチン^13、またはマトリゲル（BDバイオサイエンス^）16のようなコーティング剤を利用する。

2.2。下側（反管）膜表面に播種SVGs

1. インサートを反転し、静かに多孔質膜の縁の周りに弾性シリコンチューブ（「外部チューブ ";〜10ミリメートル、長、8ミリメートル、内径、1.6ミリメートルの壁）の短い部分に合わせて、基本的によく反管腔側表面上に新しいを作成する（ 図2A）。
2. 挿入旧姓の下dsは、メディアの漏れを回避するために密封される。 プラスチック封止コーンと一端で封止さ、まず、（ 図2B;;約8 mmの長さ、3.2ミリメートル、内径1.6mmの壁「内部チューブ」と呼ばれる）シリコーンチューブからなるプラグ（ 図2Aおよび2B）を調製（〜3ミリメートル長い; 0.2ミリリットル、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）チューブの底部切断することによって調製し; 図2B）が 、 このコーンは、内部管腔を密封するだけでなく、インサートへの緊密な嵌合のためにその縁部を広げるだけでなく。それは、膜からのアップまで約1〜2ミリメートル（ 図2A）に達するまで、次の、滅菌ピンセットを使用して、管腔内、あらかじめ、その中にシリコン栓を挿入します。
3. 次に、200μlのSVG維持培地中に4×10 ⁴ SVG細胞（播種それctionの上記1.2.2）直接でなく反管腔側膜表面上のシリコン（ 図2A）に変換する。 SVGsはインキュベーター内に少なくとも4時間、接着させる。
   注：（他の上で倒立1プレートと、 図2C）2 6ウェルプレートの間で組み立てを挿入無菌輸送を維持するために、手順の間、フィルタリングされていない空気への曝露を最小限にするために。シリコーンチューブとプラグをエタノール中で洗浄し、後の使用のためにオートクレーブする。
   注：のみ膜の細孔を持つインサート用プラグ（2.2.2項）を使用して、1ミクロンよりも大きいサイズ。 1ミクロン≤孔径を有する膜はほとんど漏れていないため、外部シリコンチューブ（セクション2.2.1）の試着のみを必要とする。また、コラーゲン以外のコーティング剤は、I（2.1項の注を参照）でも、3ミクロンの孔を通して漏出を防ぐことができます。経験的にこれを決定する。
4. あなたの星状細胞の付着状態を監視するために、中に並列に播種アストロサイト細胞懸濁液の標準的な96ウェルの同一ボリューム。このウェルを6.5ミリメートルインサートと同じ表面積（0.33 cm ^2）を有し、インサート膜よりも位相差顕微鏡による細胞の可視化を容易に可能にする。あなたがコントロール内のアストロサイトの十分な接着性を観察すると、96ウェル、アストロサイトが適切に挿入膜にも付着している。
5. アストロサイトは十分にコントロールに付着した場合には、96ウェル、組織培養フードに挿入アセンブリを転送します（上記の注を参照）、静かに外付けシリコンチューブやプラグを外します。 800μL/ウェルのBEC維持培地（上記のセクション1.1.2）を含む供給ウェルに、通常の（ つまり直立）の向きに挿入を返します。

2.3。アストロサイト上の管腔チャンバー内に前記下部電極の播種

200μl中シード2×10 ⁴ BECはコラーゲンコート腔側表面上及びInSeにを返すインキュベーターにRTS。

2.4。共培養

実験の前に培地交換せずにBEC培地中で3日間、SVG / BECシードの挿入を共培養。

3。人間BBBモデルを用いた実験（3日目）

1. それぞれ、600μlの無血清BECは培地100μlで反管腔側とメディアを交換することによってin vitroでの BBB最初の洗浄細胞を刺激する。
2. 再び腔側媒体を吸引し、刺激剤との無血清培地100μlで交換してください。
   注意：反管室の刺激が必要な場合（アストロサイトのコンパートメントからのin vitro BBBを活性化するために）、反管メディアを吸引し、刺激剤との無血清培地の600 ULと交換してください。
3. 管腔の刺激は、3×100μlのを必要とする、実行される場合、したがって（三連で、各実験群を試験する、我々は、再を希釈することをお勧めウェル間のピペット誤差を最小限に群あたり無血清培地を350μl）中のそれらの最終濃度に薬剤。
4. 前述したように、および/ ​​またはTEER ^13,16,25の測定（後者のために我々は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合アルブミンを使用）標準傍細胞および/ ​​または標識トレーサー^16,24の経細胞透過性アッセイを行う。

透過性（最大の％）=（ベースライン透磁率の変動を考慮するために、実験の間、（最大の透過性の基準となる）細胞を含まないコーティングされた挿入物および式を用いて、ビヒクル処置群に対する相対透磁率の変化を分析実験的なインサートの透過値 - ブランクインサートの車群の平均透過性値）/（透磁率 - ビークル群の平均透過性値）×100。

4。多孔質膜上での細胞の可視化

NT "> コメント ：挿入膜上の未染色細胞は、膜が非常に不透明であり、光の透過を妨害するので、位相差や微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡によって観察することは困難である我々は上の細胞の種々の染色手順を開発し、この問題に対処するため。大幅膜上のセルの外観を向上させる。まだウェルズ、インサートに付属している。膜のみ取り付ける目的で、染色手順の終了時に削除する必要がある一般的には、挿入膜を染色挿入、。

4.1。ヘマトキシリン​​染色

1. 20分間、リン酸緩衝化生理食塩水（130mMのNaCl、10mMののNa ₂ HPO _4、10mMのNaH ₂ PO _4、pH7.2のPBS）中の（w / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）の氷冷4％インサートを固定する。 PBSで一度洗浄します。
2. 2分間0.1％マイヤーのヘマトキシリン​​液に挿入水没。
3. 優しくインを沈めることによって（水道水でインサートを洗う）水道水を含有する、穏やかに過剰の水をピペッティングビーカーにERT。希望の青色が発生するまで約20秒間スコットの水道水の溶液（2g / Lの_炭酸水素ナトリウム、20グラム/ LのMgSO _4）に挿入を転送します。水道水（セクション4.1.3）で再度挿入を洗ってください。任意エオシン染色は、水道水洗浄、続いて10秒間、1％エオシン溶液にインサートを浸漬することによりここに導入することができる。
4. 挿入膜を空気乾燥させます。膜を除去し、明視野イメージングのためのガラススライドにマウントし（膜カッティングエッジの周り）メスを用いて
   注意：ジ-n-butylphthalateinxylene（DPX）封入剤を利用する場合は、膜を除去してマウントする前にキシレンが続き、100％エタノールで挿入を洗う。

4.2。走査型電子顕微鏡（SEM）

1. 20分間、PBS中のPFA（w / v）の氷冷した4％のインサートを固定します。 PBS中で3回洗浄する。
2. W / V（1％の30分のための膜をポスト修正MQH ₂ Oに）四酸化オスミウム
3. 洗浄は、水（セクション4.1.3）に挿入し、エスカレートエタノール勾配（50％、70％、5分ごとに、90％、区間ごとに10分間、100％エタノールで、次いで3×）で脱水する。
4. エタノール（1:2、その後5分間2:1）：ヘキサメチルジシラザン（HMDS）の混合物で脱水挿入を扱う。
5. 乾燥条件下では5分、空気乾燥して保存するため、100％のHMDSで挿入を扱う。
6. （膜エッジの周りカット）メスを用いて膜を除去します。走査型電子顕微鏡により膜を調べる。

4.3。免疫蛍光

1. トリス緩衝生理食塩水（;フィルタリング50mMトリス-HCl pH7.6の、154のNaCl、0.22ミクロンTBS）で一度洗って、20分間、PBS中のPFA（w / v）の氷冷した4％のインサートを固定します。
2. 以前に^26を説明したように、挿入膜上で細胞の免疫染色を行ってください。
3. （膜エッジの周りカット）メスを用いて膜を除去してAGにマウント蛍光封入剤で少女のスライド。蛍光顕微鏡により膜を調べてください。

結果

人間を確立するために、BBBモデルに連絡し、我々は、内皮細胞^14,15,27,28と接触するアストロサイトのエンドフィートの通過を可能にするために示され、3ミクロンの細孔径を有する多孔質膜上SVGsと前記下部電極を育成しなければならなかった。完全な接触モデルの概略図を図1（図示の左側）に示されている。コンタクトシステムによって提示された主要な技術的な課題は、膜の反管腔側表面に重力に逆らって、星状細胞をシードする必要があることである。我々は、管腔内に挿入された追加のシリコーンプラグ（ 図2）媒体の漏洩を防止しつつ、主に管腔側膜表面の上に取り外し可能なシリコーンウェルを作成することによって、このタスクに成功した。この方法は、順番に強く、最小の細胞損失を有する多孔質表面に付着されるようになったSVGsの最適な、途切れない播種期間（最低4時間）、許可された。実際、3日SVGsとBECはアプリの両方を播種後ヘマトキシリン染色された挿入物の画像から判断されるよう（; 図3A、左パネルのセクション4.1を参照）、コンフルエント耳...

ディスカッション

脳の病理への医学研究は、多くの翻訳困難を抱えている。急性虚血性脳卒中の領域では、例えば、動物モデルにおいて非常に有望であった多くの薬剤は、臨床^38,39に失敗しました。これらの不本意な結果の理由は多様であり、人間のストロークシナリオおよび動物実験²¹から得られた結果の過大評価に前臨床試験システムの不倫が含まれています。臨床段階に前臨床調査結果の予測値を改善するための一つの戦略は、 ヒト細胞ベースのin vitroモデルの追加開発で、これらは新薬とメカニズムをスクリーニングするための強力かつ費用対効果の高いツールを提供し、臨床的に意義のある道に焦点を当て、より良い可能性があり^21。このような状況の中で、我々はここでは詳細に記載されたヒト不死化アストロの新規な組み合わせを利用し、人間の接触BBBモデルの確立のために我々の研究室で行われ、プロセスcytes（SVGs）や脳卒中に関連した現象の検査のためのヒト初代BECは。

（フローなし）静的条件の下では、（

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アタッチメントファクター	セルシステムズ社	4Z0-210
脳微小血管内皮細胞(BECs)、初代ヒト	セルシステムズ社	ACBRI 376
完全培地	セルシステムズ社	4Z0-500	CSC JetFuel添加物
完全無血清培地	セルシステムズ社	SF-4Z0-500	CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
内皮細胞増殖サプリメント(ウシ由来)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
外部シリコンチューブ	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil ブランド、内径 8 mm、壁 1.6 mm
胎児子牛血清	Lonza	14-501F
ゲンタマイシン硫酸塩	ライフテクノロジー	15750-060
ヘパリンナトリウム	ファイザー		1,000 U/ml
ヘキサメチルジシラザン (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
ヒト脳微小血管内皮細胞	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
内部シリコーンチューブ	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsilブランド、内径3.2 mm、壁1.6 mm
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer'sヘマトキシリン溶液	アンバーサイエンティフィック	MH
ールとの最小必須媒体平衡塩溶液	HyClone Laboratories	SH30244.01
ペニシリン/ストレプトマイシン	Life Technologies	15140
ラットコラーゲン I	トレビゲン	3440-100-01	Cultrex ブランド
組織培養インサート	コーニングライフサイエンス	3472	トランズウェルブランド、直径 6.5 mm、ポリエステル多孔質膜、3 & マイクロ;mポアサイズ