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方法論記事

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

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DOI:

10.3791/50985

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2014年2月18日

 ,  ,  , 
1Fondazione Filarete, 2Department of Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, 3Neuroscience Institute, National Research Council (CNR), 4Department of Health Science, "Magna Graecia" University of Catanzaro

この記事について

サマリー

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。

要約

これらは強烈interorganelle分子のトラフィックにもかかわらず、彼らの独特の構成と機能を保持しているが、真核細胞での脂質とタンパク質が連続的に、細胞区画間で交換される。このホワイトペーパーに記載されている技術は、 生体内とその生理的な環境で、タンパク質や脂質の移動と人身売買を研究する強力な手段である。 （FLIP）の光退色で（FRAP）の光退色後の蛍光回復および蛍光損失が広くエキソ - エンドサイトーシス経路、オルガネラまたはサブコンパートメント間の連続性、タンパク質複合体の形成、およびタンパク質局在化を介して細胞内輸送を研究するための生細胞イメージング技術を用いている脂質ミクロドメインに、それらの全ては生理学的および病理学的条件下で観察することができる。これらのアプローチの限界は、主に蛍光性融合タンパク質の使用によるものであり、それらの潜在的な欠点は、過剰発現アーチファクトを含む細胞内のイオンと、タグ付きおよび天然のタンパク質のフォールディングおよびローカリゼーションの違いの可能性。最後に、光学顕微鏡（約200nm）の解像度の限界としてストレス下の細胞に由来することができERまたは特定のサブコンパートメントの微細構造の調査を許可していない（ すなわち低酸素症、薬物投与、膜貫通の過剰発現ER常在性タンパク質）または病理学的条件の下で、我々は超微細で培養されたトランスフェクトされた細胞の生細胞イメージングを組み合わせることは、透過型電子顕微鏡法に基づいて解析する。

概要

緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのスペクトル変異体、および蛍光顕微鏡の並行開発の発見は、細胞におけるタンパク質の挙動の調査のための完全に新しい道を開いた。なぜなら強烈な照明の下での蛍光を消火する蛍光体の本質的な能力のために可能であるような（FRAP）を光退色後蛍光回復と（フリップ）の光退色の蛍光損失などの技術は、共焦点生細胞イメージングトランスフェクトの使用に基づいている蛍光融合タンパク質1-3。彼らは広く、その機能4に関する重要な手がかりを明らかにすることができ、タンパク質の局在だけでなく、彼らの機動性と小胞輸送だけでなく、を評価するために使用されています。

真核細胞のユニークな特徴は、特定の脂質およびタンパク質の組成物を有する細胞内コンパートメントの存在である。細胞小器官は、物理的に絶縁のあるですがオピニオン、それらは互いに通信し、細胞の恒常性を維持するために、分子成分を共有する必要がある。分泌経路は、ERで合成されたタンパク質や脂質は、彼らがその機能を発揮する正しい最終目的地に到達することが保証されます。細胞内小器官はまた、分子（脂質）が直接コンパートメントとの間で交換することを可能にする動的接触部位に接続することができる。さらに、多くのタンパク質は大きなヘテロ複合体で組み立てまたは機能的に活性になるか、その最終的な目的地に輸送されるために特定の脂質種（脂質ラフト/マイクロドメイン）に関連している。これらの生物学的局面の全てが大きく、タンパク質の動力学的特性に影響を与えるため、適宜、以下に記載される技術を用いて調べることができる。

我々のグループは、ERのアーキテクチャとその異なるサブを研究するために、電子顕微鏡と組み合わせ広く使われているFRAPやFLIPを持ってドメイン。 ER、分泌経路の最初のステーションであり、タンパク質および脂質5選別において重要な役割を果たしている。それは、その個別のサブドメイン（ すなわち 、タンパク質および脂質生合成および輸送、タンパク質の折り畳み、Ca 2 +の貯蔵と放出、および異物代謝）その多くの異なる機能を反映して非常にダイナミックな細胞小器官である。それらは形態学的に、空間的、および機能的に別個であるものの、これらのドメインは、互いに連続しており、それらの相対存在量は、生理学的および病理学的条件下で、細胞内で改変することができる。最もよく知られ、ERの通常空間的に分離されたドメインは、核膜、および平滑、粗ERであるが、我々及び他のER構造は、種々の細胞型におけるより精巧なアーキテクチャおよび三次元の組織に存在することが実証されているまた、低酸素症、薬物などのストレス刺激により誘導することができる、生理学的条件下での組織投与、またはERに存在する膜貫通タンパク質2,6の過剰発現（およびその中の参考文献）。

また、最近、ヒト疾患1,7の細胞モデルにおいて、このような構造の存在が実証されている。彼らはまた、彼らのような彼らのアーキテクチャに基づいてkarmellae、ラメラ 、及び晶質ERとして知られているが、滑らかなERの積み重ね嚢から発信さが、それらは、2003年6で編成滑面小胞体（OSER）の集合的な名前を与えられたサイズは、変えることができる。細胞が尾アンカー（TA）ERに存在するタンパク質（Dの EGFP-ER）の細胞質ゾル領域に融合GFPをトランスフェクトされた後、 トランスでGFPの弱い二量化傾向が劇的にERの組織や構造を変更します。 FRAPやFLIPの実験は、D EGFP-ERはOSERs内に拡散して自由であることを示した、それがに網状ERから移動し、 その逆もあるという事実/ em>は凝集体が周囲の網状のERと連続していることを示しています。超微細構造解析は、私たちは、ナノスケールレベルでのOSERアーキテクチャと組織の詳細な説明と蛍光データを相関させることができました。OSERsは、常に滑らかなERの対になった嚢のスタックで構成されていますが、このような規則的に正弦波に配置などの空間組織のさまざまな形態を有することができる配列や渦巻き、または六角形の「クリスタ」管状の配列。これらの再配列は、それらが生理学的条件下9および10低酸素症、薬物治療11、および癌9として以下の応力下で細胞中に見出されているように、超微細構造のマーカーとして大きな可能性を有していてもよい立方晶の形態8に導く。

GFP融合タンパク質を使用して、この最初の実証の後、我々は薬理学的治療12、ASSEに応答してERドメインの増殖を分析するためにイメージング実験を用いカテゴリーセル13にオリゴマー化するため、およびその病原1,8に関連し得るER由来の細胞内凝集体の形成における変異、ALS TA-結合タンパク質の役割を調べるために蛍光タンパク質の傾向。これは、（多くの神経変性疾患において生じる14）は、細胞内凝集物の形成が毒性変異体タンパク質及び周辺セル構成要素15との間の相互作用を防止するように設計された保護メカニズムであり得ることが示唆されている。

以下は、そのC末端疎水性ドメインはERの膜に挿入され、それらの動的挙動の解析およびERドメインに対するそれらの過剰発現の効果を調査するための構築物の光学および電子顕微鏡法の組合せの説明である培養細胞におけるアーキテクチャ（実験プロトコルのフローについては図1を参照）。

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プロトコル

1。 ER蛍光タンパク質を用いて、プラスミド、細胞培養、およびトランスフェクション

  1. この研究で使用したプラスミドは、ラットシトクロムbのERアイソフォームのテール領域へのC-末端で融合GFPの拡張バージョンで構成され（5）リンカー配列を介して（bと（5）ここでは略す）。テール領域（5）は、アップストリームおよびダウンストリームの極性配列が隣接する17残基のTMD（膜貫通ドメイン）、（UPSとDPS）​​などのネイティブBのトリプシン切断の後に結合した膜のまま、全配列（Pro94-Asp134）が含まれています。リンカーは、[（グリシン）4セリン] 3、続いてmycエピトープから構成され、全体のcDNAを哺乳動物発現ベクターのpCDNA3-Hind3でののXba1部位に挿入される。このプラスミドの構造の詳細は、それがGFP-ER 16とも呼ばれる、以前の刊行物に記載されている。
  2. 10％フェタを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でCOS-7細胞を増殖させるLのウシ血清、2mMのL-グルタミン、37℃でインキュベーター中で1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％CO 2。
  3. トランスフェクション。製造者によって記載されているように、プレート3×10 5 6ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ上の細胞とは、次の日に、JetPEIシステムとトランスフェクト。我々の場合に、JetPEI：2:1のDNA比は、70〜80％のトランスフェクション効率をもたらす最適なJetPEI / DNA比は、使用されるプラスミドおよび細胞株に応じて、最大のトランスフェクション効率を確立するためにテストされていることに留意されたい。

2。ライブ蛍光走査型共焦点顕微鏡

  1. 生細胞イメージング。トランスフェクトされた細胞を10％FBS、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、25mMのHEPESを補充したW / OフェノールレッドDMEMで充填された24mmカバースリップ用スチール培養細胞チャンバ内に播種したカバースリップを置く退色からサンプルを防ぐために、50μg/ mlのシクロヘキシミドおよび1:100 OxyFluor。 SP5共焦点microscopd個の GFP-ERは、488nmレーザー及び50分の525バンドパス発光フィルターを用いて可視化した状態で温度制御されたCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2）を備えた電子は、生細胞イメージング実験のために使用される。
  2. （FRAP）を光退色後蛍光回復。 OSER構造に対応する、関心領域（ROI）を描き、それは（試料で5.5〜6μWに対応する、30 mWのアルゴンレーザーの100％）の20回の反復と488nmの組み合わせを使用し、405nmの漂白（30 mWのダイオード405のレーザーの60％が、サンプルで11.6μWに相当する）我々の経験では、効率的かつ迅速な光退色につながる、レーザーが。
  3. 10分（画素時間= 1.61秒/ピクセル）のための単一フレームごとに10秒を取ることによって、漂白されたROI内の蛍光の回復を記録します。
  4. （フリップ）の光退色の蛍光損失。 OSER構造に対応するROI、上述したように漂白剤を描く。漂白は、30秒毎に繰り返される、とポスト漂白画像は30分（画素時間= 1.61秒/ピクセル）ごとに10秒を記録している。
  5. FRAPやFLIP分析。すべての画像は、ImageJソフトウェア（使用して分析するhttp://rsbweb.nih.gov/ij/download.htmlを ）。 FRAP実験では、漂白されたROIの蛍光回復を経時的に測定され、常に経時的に一定であることがチェックされる漂白細胞の総蛍光に対して標準化。
  6. FLIP実験のために、漂白OSER外と細胞全体をカバーするROIを描画します。経時的に蛍光強度を測定し、撮像自体による蛍光の低下を補正するために前記未漂白のセルに描かれたROIの蛍光レベルに正規化する。
  7. 全ての実験では、ROIの蛍光強度から（細胞の外側の領域で決定した）バックグラウンドシグナルを差し引く。最後に、Grのを使用して結果をプロットaphPad Prismソフトウェア。

3。透過型電子顕微鏡を用いて超微細構造解析

試薬の多くの毒性を考えると、すべての手順は、適切なラボを着て行われるべきである。ヒュームフードの下のコートと手袋。

  1. ペトリ皿からカバースリップを除去した後、室温で10分間、0.1 Mカコジル酸緩衝液、pH7.4中で濾過し、2％グルタルアルデヒドを用いて単層として皿の底の上に成長した残りの細胞を固定する。
  2. テフロンスクレーパーを用いて細胞をこすり落とし、1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに転送します。 10分間9,000 gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を除去し、新鮮な固定を追加し、4℃で一晩のまま
  3. 次いで、室温で1時間カコジル酸緩衝液中の1％四酸化オスミウム溶液で後固定し、緩衝液でペレットを洗浄する。
  4. ミリQ水で洗い流し、とした一括染色エン20〜60の間分間蒸留水中1％酢酸ウラニル。
  5. エタノールシリーズ（70％、80％、90％、100％、10分ごとに、100％）の増加でサンプルを脱水し、プロピレンオキシド（15分毎）​​で二回簡単に洗浄する。
  6. （2時間から一晩）、プロピレンオキシド+エポン（1:1）の混合物中にサンプルを浸潤する。
  7. 少なくとも24時間60℃で硬化さエポンエポキシ樹脂に埋め込む。
  8. セクション60から70ナノメートルの厚さの部分を取得するために45°のダイヤモンドナイフを装備したウルトラライカUC6を使用して手動でトリミングされた樹脂圏。 300メッシュ銅グリッド上のセクションを収集します。
  9. 酢酸ウラニル（20分）の飽和溶液でグリッド上のセクションを染色し、クエン酸鉛（7分）、徹底的に再蒸留ろ過された水でそれらを浸漬することによってグリッドを洗浄し、それらを室温で乾燥させます。
  10. 染色されたグリッドはTECNAI G2透過型電子顕微鏡を用いて観察し、画像がボットを使用して捕捉される（一般的には6,000-39,000 Xの範囲）異なる最終倍率でOMマウントされたCCDカメラ。

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結果

図2は、タンパク質の移動の例FRAP研究を示しています。 dは EGFP-ERタンパク質の移動度は、漂白OSERsに光退色後蛍光回復急速によって実証される。定量分析のために、半分の時間、モバイル画分は、以下の単一指数の式を当てはめることによって実験的に測定されたデータから導出された。

F（T）= F ポスト +（F REC-Fポスト ）（1-E-T /τ）

F ポストは 、光退色後の蛍光シグナルであり、F rec視聴、登録時トン 、漂白後に到達し、時定数τ最大蛍光回復値である。

蛍光回復と、結果的に、タンパク質の移動度分析を変える可能性が飽和画素せずに画像を取得することの重要性に注意してください。それI常に焦点面での画...

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ディスカッション

このホワイトペーパーで説明プロトコルおよびイメージングのアプローチは、生細胞の小胞体内に常駐トランスフェクションしたTAの蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用されてきた。我々はまた、超微細構造解析により、この細胞内区画のアーキテクチャにこれらのタンパク質の過剰発現の効果を分析した。

生細胞の共焦点イメージングおよび電子顕微鏡法の組み合わせが表すタンパク質の動的な特性を調査する非常に強力な手段であり、タンパク質機能に関する重要な情報を提供することができる。記載された方法は時間がかかり（仕事の典型的には3日間）ではなく、画像収集及び分析のための多くのユーザーフレンドリーなソフトウェアアプリケーションの開発は、比較的単純な、生細胞イメージングベースの光退色ができる。

これらの技術の主な限界は、蛍光融合タンパク質の使用であるため、蛍光タグは、目的のタンパク質の適切な折り畳みおよび/またはアセンブリに影響を与えることができる。また、過剰発現は、トランスフェクション、蛍光タグ化タンパク質の挙動を変更することができ、したがって、...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者らは、この記事の出版物でのヘルプとサポートのための伊Filareteに感謝しています。またTECNAI G2、透過型電子顕微鏡を使用するためのセントロEuropeoのディNanomedicinaに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコModified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen41966029
Dulbecco'Modified Eagle Medium (DMEM) w/o phenol redInvitrogen31053028
Fetal Bovine Serum (FBS)Invitrogen10270106
Pen/StrepInvitrogen15140-122
L-Glutamine 200 mM solutionInvitrogen25030-024
jetPEIPolyplus TransfectionPP10110
OxyFluorOxyrase株式 会社。OF-0005
グルタルアルデヒド グレード IΣ AldrichG5882
カコジル酸ナトリウム三水和物Σ AldrichC0250
四酸化オスミウム 4% 溶液電子顕微鏡 科学19150
酢酸ウラニル二水和物Σ Aldrich73943わずかに放射性
プロピレンオキシドΣ-Aldrich82320
EPON埋め込み培地キットSigma-Aldrich45359-1EA-F
クエン酸鉛電子顕微鏡 科学17800
ベンチトップ遠心分離機Eppendorf5415 D
スペクトル共焦点顕微鏡 ライカマイクロシステムTCS SP5
CO2 顕微鏡ケージインキュベーションシステム OkoLab
Ultramicrotome ライカマイクロシステムズUC6
ダイヤモンドナイフ DiatomeUltra 45 °
透過型電子顕微鏡 FEITecnai G2
GraphPad PrismソフトウェアGraphPad Software, Inc
24mm用鋼製培養細胞チャンバー カバーガラスバイオサイエンスツールCSC-25
電子顕微鏡グリッド電子顕微鏡 ScienceG300Cu
ズ

参考文献

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