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方法論記事

タンパク質A膜吸着体と合理化されたワークフローを用いたキメラヒトFc発現タンパク質の単離と特性評価

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DOI：

10.3791/51023

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2014年1月8日

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 3Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

プロテインAアガロースビーズパックカラムを用いた従来のアフィニティクロマトグラフィーと比較して、プロテインA膜吸着体は、抗体およびその他のFc断片発現タンパク質の実験室規模の単離を大幅に高速化することができます。適切な分析と定量化方法により、タンパク質処理がさらに加速し、20時間以上の作業時間ではなく、1営業日で分離/特性解析を完了できます。

要約

細胞培養上清および溶解細胞溶液からの生体分子の工業的規模への実験室規模の精製は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して達成することができる。多孔質タンパク質Aアガロースビーズを使用したアフィニティークロマトグラフィーは、IgGのFc断片を発現する抗体および組換えタンパク質の実験室規模分離の最も一般的な方法であるが、時間とコストのかかるプロセスであり得る。時間と財務上の制約は、希薄溶液から数百マイクログラムからミリグラムのタンパク質を回収しなければならない小さな基礎科学ラボでは特に困難ですが、バイオ分離の専門知識を持つ高圧液体送達システムや人員へのアクセスが不足しています。さらに、製品の定量化と特性評価は、複数の稼働日にわたって処理時間を過度に長くし、費用(消耗品、賃金 など)を膨らませる可能性があります。したがって、Fcフラグメントを保有する抗体および他のタンパク質の検査尺度の分離および特性評価には、迅速で安価でありながら効果的なプロトコルが必要です。そのために、20時間以上の作業時間を必要とする従来の方法とは対照的に、経験の限られた技術スタッフが9時間未満(約1作業日)、4時間で完了できるプロトコルを考案しました。ほとんどの必要な装置は標準的な生物医学、生物化学、および(生物)化学工学の実験室ですぐに利用でき、すべての試薬は市販されている。このプロトコルを実証するために、細胞培養上清からヒトFc(Gal-1hFc)に融合したキメラマウスガレクチン-1がタンパク質A膜吸着体を用いて単離した代表的な結果が提示される。精製Gal-1hFcを迅速なウェスタンブロッティング分析手順を用いて定量し、フローサイトメトリーを用いて特徴付けた。合理化されたワークフローは、抗体などの他のFc発現タンパク質に対して変更したり、代替定量法や特性評価方法を組み込むために変更することができます。

概要

免疫グロブリンG(IgG)Fc断片を発現する抗体および組換えタンパク質の単離は、細胞培養上清および希薄溶解細胞溶液から、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して達成することができる。基礎科学・工学研究所および産業では、高い財政コストと長い処理時間1〜3にもかかわらず、多孔質タンパク質Aコーティングアガロース、ガラス、またはポリマービーズを詰めたカラムが最も一般的にアフィニティークロマトグラフィーに使用されています。アフィニティクロマトグラフィーは、ラボと産業の両方の設定で最大の費用と処理のボトルネックを表すことを高く評価されています2,4.その結果、プロセストレイン1,2,5-7からの製品全体の回復を犠牲にすることなく、コストと処理時間を短縮するために数多くの改良が開発されています。特に抗体および他のFc発現タンパク質の単離に対して有望なのは、A膜吸着体2,5,7-10のタンパク質Aを用いたアフィニティークロマトグラフィーである。カラムクロマトグラフィーにおけるFc捕捉は拡散に制限される(すなわち、Fc発現タンパク質は、内部細孔を介して拡散して、大部分のタンパク質Aに到達しなければならない)、カラムを横切る高圧降下を伴い、膜吸着体における大量輸送はバルク対流によって駆動され、拡散制限の回避をもたらす8,9,11,12。また、膜吸着量全体の圧力降下が低く、ビードパックカラム8,9,11,12に比べてより速い灌流流速度が可能となる。したがって、実験室規模の分離のために、膜クロマトグラフィーは、数時間の分離時間を短縮し、カラムクロマトグラフィーと比較して製品のキャプチャを増加させると予測されます。さらに、膜吸着物中のIgG吸着の数学的モデルは8,9,11,12を提案されており、エンドユーザーがラボでの性能を予測できるようにしています。

基礎科学・工学研究室のもう一つのボトルネックは、Fc発現タンパク質の特性化である。しかし、このようなウェスタンブロットを、特性評価アッセイを完了するための適切な方法の選択は、製品のテストに費やす時間を大幅に削減することができます。例えば、不連続緩衝システムにおけるセミドライ移動は、連続緩衝システム13におけるタンク内(湿式)移動の1〜2時間とは対照的に、SDS-PAGEゲルからポリビニルジフルオリジン(PVDF)膜へのタンパク質の電気泳動を数分で達成することができる。

ヒトIgGのFc断片を発現するキメラ融合タンパク質を単離し、特徴付ける迅速、安価、および有効なプロトコルが、本明細書に記載されている。ほとんどの装置は標準的な基礎生物医学、生物学、化学、および(生物)化学工学の実験室ですぐに利用でき、すべての試薬は市販されている。代表的な結果は、マウスガレクチン-1/ヒトFcキメラ融合タンパク質(Gal-1hFc)の単離および特性解析から生成されたが、合理化されたプロトコルは、抗体、Fcフラグメント自体、または他のFc融合タンパク質などのFcフラグメントを有する他の分子の単離に適用することができる。当社の改善は、標準的な方法と比較して、類似または改善された製品の回復を達成しながら、処理時間を劇的に短縮しました(4時間ほどですが、通常は20時間以上の作業時間と比較して〜9時間)。.

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プロトコル

1. プロテイン A のアフィニティを確認する

  1. Fc発現タンパク質(組換え融合タンパク質またはIgG抗体、ここでは「タンパク質」と呼ばれる)が、タンパク質A膜吸着体を使用する前にタンパク質A14-17 に対して許容可能な親和性を有することを確認し、ストック溶液中にタンパク質の存在を試験する(例えば 、細胞培養上清を上清して1,000xgmin細胞に懸濁させた)。フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、ELISA などを使用します。ラボの好みに基づいて、Fcのタンパク質機能および/または存在を検出します。理想的には、細胞培養上清中のタンパク質を定量化する(ステップ6)タンパク質A膜吸着量を超えないようにする。タンパク質が検出された場合に進みます。

2. タンパク質A膜吸着剤および細胞培養上清を調製する

  1. 膜吸着を準備するためのメーカーの指示に従ってください。 空気を膜吸着器に入れないでください。膜吸着剤を介して浸透するすべてのソリューションは、室温で、0.22 μmフィルタを使用して事前にフィルタ処理する必要があります。 10 ml シリンジに 0.22 μmろ過ダルベックコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)またはバッファーを充填し、エアバブルを排出します。DPBSを浸透して貯蔵溶液を除去し、使用直前に膜吸着を平衡化する。
  2. 膜吸着体を通して灌流の直前に細胞培養上清をろ過し、真空駆動の0.22μm滅菌濾過ユニットを使用する。

3. タンパク質A膜吸着体をロードする

  1. 吸気細胞培養は、ルアーロックシリンジ(30ml以上)に上清し、気泡を排出します。
  2. 図 1に示すように、材料と機器を組み立てます。注射器を膜吸着器の入口に接続します。膜吸着口にフレキシブルチューブを取り付けます。必要に応じて、0.22 μmのシリンジフィルターをシリンジと膜吸着器の間に置きます。フラスコまたはボトルを使用して、吸着器から流れ(濾液とも呼ばれる)をキャッチします。
  3. シリンジポンプを所望の体積流量に設定しますが、メーカーの推奨流量(例えば 10ml/分)を超えないようにしてください。膜吸着剤を通して細胞培養上清を浸透させ、ビーカーまたは他の容器内を通って流れを集める。必要に応じて上澄みのあるシリンジをリロードします。
  4. 必要に応じて、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、ELISAなどを使用してタンパク質の存在のために流れをテスト します。ラボの好みに基づいて。通常、フローを再変換する必要はありません。

4. 膜吸着体からの溶出タンパク質

  1. 膜吸着体を10mlDPBSで洗浄し、非結合タンパク質を除去します。
  2. 10~15mlの溶出緩衝液(例えばアミン系溶出緩衝液(pH2.8))を用いて所望の流量(例えば1ml/min)で膜吸着体から溶出タンパク質。中和バッファー(例えば1 Mトリス(pH 9.4))を含むチューブ内の溶出液を溶出量の10%(1.0〜1.5ml)で捕捉する。
  3. あるいは、1ml単位で溶出したタンパク質を100μlの中和バッファーを含むチューブに、10〜15ml溶出バッファーの総体積を使用した。好ましい特性評価方法を使用して、各分画がタンパク質の存在をテストします。
  4. メーカーの指示に従って膜吸着を再生します。パーフューズ 10 ml の 0.22 μm フィルター DPBS またはバッファーを選択し、1 N NaCl で 0.22 μm フィルター 50 mM NaOH の 10 ml、最後に 10 ml の 0.22 μm フィルター DPBS を使用します。膜吸着剤にDPBSで20%エタノールを充填し、4ºCで長期保存します。

5. タンパク質の濃縮と透析

  1. 全ての溶出物(またはステップ4.3で決定したタンパク質を含む溶出画分)を10kDa分子量カットオフ遠心フィルターユニットに付着する。遠心分離の製造元の指示に従ってください。
  2. メーカーの指示に従って、選択したバッファーに対して少量透析ユニット(10 kDa分子量カットオフ)でリテン酸を透析します。タンパク質沈殿が懸念される場合、バッファーを透析材料に添加する必要があります。必要であれば、透析材料は、ステップ6まで冷蔵することができるが、防腐剤を使用しない長期保存はお勧めできません。

6. 迅速なウェスタンブロッティング手順における精製物の定量化と特性化

  1. SDS-PAGEにより、望ましい18-20の還元または非還元条件下で、選択したゲルに精製されたタンパク質およびFc基準を解決する。実行時間を最小限に抑えるには、ミディゲルではなくミニゲルを使用します。
    1. まだ知られていない場合は、帯信号がロードされる量(例えば 0.1-1mg)に関して線形に変化するFc規格範囲を決定する。精製タンパク質を定量化し、特性を示すために使用される同じゲル、走行条件、転移条件、試薬を使用します。
    2. DPBSで希釈したサンプルを含む精製タンパク質の複数のサンプル量をロードし、精製されたタンパク質バンド信号が画像分析におけるFc標準の線形シグナル範囲内にあることを確認する。
  2. 半乾燥ブロッター13を用いて、不連続な緩衝系でゲルからポリビニリデン(PVDF)膜にタンパク質を移す。転送時間は通常5〜10分です。所望であれば、クーマシーは転写後にゲルを染色し、転写効率21を検証する。
  3. アルカリ性ホスファターゼ(AP)またはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートされた抗Fcまたは抗IgGを用いて免疫ブロットを行い、真空支援タンパク質検出システムを使用してラボの好みに基づいて実行します。免疫ブロット時間は、典型的には1時間未満である。
  4. 選択した基質および方法(例えば AP基質および強化された化学発光)を用いて免疫ブロットを開発する。
  5. 画像解析により精製タンパク質を定量化します。Fc規格からのバンド信号に対して線形回帰を実行します。R2>0.90の場合、ラインの方程式を使用してバンド信号からタンパク質の量を計算します。必要に応じてサンプル希釈を考慮します。タンパク質の定量はFcに基づいて行われるので、タンパク質とFcとの分子量差の値 <を調整します。
  6. 機能的アッセイまたはフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、ELISA などを介してFcを検出する方法を使用してタンパク質を検証する。ラボの好みに基づいて。
  7. タンパク質を所望の濃度に希釈したり、長期保存、凍結、またはそれ以外の方法でアリクォートする前に、精製されたタンパク質溶液に所望の防腐剤または安定剤を加えたりします。

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結果

Fc発現タンパク質の単離および特性評価のための合理化されたプロトコルは、希薄細胞培養上清からヒトFc(Gal-1hFc)に融合したキメラマウスガレクチン-1を処理するために日常的に使用されています。 図 2 のフローチャートは、プロトコルの各ステップのワークフローと時間を示しています。300mlの上澄み物の典型的なバッチの場合、溶出画分の任意のフローサイトメトリー試験が行われると、総処理時間は約9時間です。フローサイトメトリー分析をすべて省略した場合、フローサイトメーターまたは個々のラボの好みの欠如のために、総処理時間は4時間と短くすることができます。一般に、処理時間はオペレータの経験、処理された上清の量、およびどの定量化および特性評価方法が実行されるかによって異なります。

フローサイトメトリーは、開始細胞培養上清における機能Gal-1hFc(すなわち、Gal-1は乳癌細胞上のリガンドを検出することができる)の存在を試験するために使用された。新鮮な細胞培養培地は、陰性対照18,22として役立った。細胞培養上清...

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ディスカッション

本明細書に記載されたプロトコルは、製品の回収や膨張コストを著しく損なうことなく、ヒトFc(Gal-1hFc)を発現するキメラ融合タンパク質を迅速に単離し、特徴付けるために開発された。合理化されたワークフローの主要なコンポーネントは、分離のためのタンパク質A膜吸着体、およびウェスタンブロッティングによる特性評価のためのセミドリー転送および真空支援免疫ブロットです。

300mlの細胞培養上清(従来のプロトコルでは20時間以上に比べて流線形プロトコルでは約9時間)からのGal-1hFcの分離および特性評価のための処理時間の劇的な減少は、前述の主要成分、特に膜吸着剤の組み込みに大きく起因する。最大推奨流量10ml上清/分で、膜吸着負荷は30分で完了することができます。タンパク質からのGal-1hFc回収膜吸着剤は、通常、私たちの研究室では10〜30%の範囲であり、細胞培養上清中のGal-1hFc濃度が5〜10mg/mlである場合、経験豊富なラボのスタッフによって日常的に達成される30%の回復があります。最大で、50%の回復が達成されています。完全な製品回収は、(a)膜吸着体上のタンパク質A...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

著者らは、ルイス・F・デルガディージョ氏(オハイオ大学化学・生体分子工学科)、マシュー・H・ウィリアムズ氏(オハイオ大学化学・生体分子工学科)、フィリベルト・セデノ・ローラン博士(ブリガム・アンド・ウィメンズ病院とハーバード大学医学部)に専門的な技術支援を求めています。著者らはまた、2011年冬のCHE 404/BME 504および秋2012 CHE 4830 /BME 5830学生(オハイオ大学化学・生体分子工学・生物医学工学専攻)に技術的な助言と議論を感謝したいと考えています。この研究は、国立科学財団(NSF)主要な研究計装助成金CBET-1039869(MMB)、NSF CBET-1106118(MMB)、皮膚財団研究助成金A050422(SRB)、国立衛生研究所(NIH)NCI助成金1R15CA161によって支援されました 830-01 (MMB)、NIHキルシュシュタイン-NRSAポスドク・フェローシップF32CA144219-01A1(SRB)、NIH/NCI R01CA173610(CJD)、NIH NCCAM助成金R01AT004628(CJD)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プロテインA膜吸着剤(Sartobind Protein A 2 ml) ザルトリウス・ステディム93PRAP06HB-12--A
アミコン ウルトラ遠心フィルター、10 kDa、4 mlミリポアUFC801008必要に応じて15 mlの容量を使用
滅菌真空フィルターユニット、0.22 & マイクロ;m、500 mlミリポアSCGPU05RE
10 ml シリンジ(ルアーロックチップ付きBD301604
30 ml シリンジ(ルアーロックチップ付きBD309650
タイゴンラボチューブ (1/16 インチ x 1/8 インチ x 50 フィート)コールパーマーWU-95903-16
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置(10K MWCO)Thermo Scientific69576
スナップ i.d. 抗体採取トレイEMD ミリポアWBAVDABTR
スナップ i.d. シングルウェルブロットホルダーEMD ミリポアWBAVDBH01
溶出バッファーThermo Scientific21004
Tris, ultra pureFisher Scientific819623
Nadium chlorideフィッシャーサイエンティフィック7647-14-5
Tween 20フィッシャーサイエンティフィックBP337-100
DPBSサーモサイエンティフィックSH30028.02
DPBS with Ca2+/Mg2+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
Human FCBethyl Research LaboratoriesP80-104
Anti-human Fc-APCJackson免疫研究109136170
抗ヒト Fc-APバイオ・ラッド170-5018
アルカリホスファターゼ基質PromegaS3841
フローサイトメトリーチューブ (5 ml ポリスチレンまたはポリプロピレン)BD352054
シリンジポンプハーバード装置55-2226蠕動ポンプも許容されます
タンパク質ゲル電気泳動システムBio-Rad Laboratories552BR094876任意のゲル電気泳動システムを使用できますが、ミニゲルシステムは最速の
セミドライブロッターBio-Rad Laboratories690BR006163どの転送システムでも許容されますが、不連続な転送システムは電気泳動転送を実行します 最速
のSNAP i.d. 真空支援タンパク質検出システムEMD ミリポアWBAVDBASEアップグレードされたモデルがこの特定の機器に取って代わりましたが、どちらも同じように機能するはずです
) ) を実行します

参考文献

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