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方法論記事

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌

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DOI:

10.3791/51043

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2013年9月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

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サマリー

リステリア菌は、頻繁に、細胞内寄生の研究のための主要なモデルとして用い、グラム陽性細菌の病原体である。後半L.イメージング低分子干渉RNA画面のコンテキスト内感染段モノサイトゲネスは、標的宿主細胞の細菌感染に必要な細胞経路をグローバル研究を可能にする。

要約

細菌の細胞内病原体は絶妙に操作し、宿主の標的組織への感染に必要な細胞機能を破壊するそれらの能力に起因する細胞のシグナル伝達カスケードを分析するための分子ツールとして考えることができる。これらの細菌の病原体の中では、 リステリア菌は、細胞性免疫応答の特徴づけに細胞内寄生のためのパラダイムとして使用されており、その細胞骨格と膜人身売買のダイナミクスを制御する分子経路の発見に尽力役割を果たしてきましたグラム陽性微生物である。この記事では、我々はLの遅い携帯感染の段階を検出するための堅牢な顕微鏡アッセイを記述リステリア InlC、感染細胞の細胞質に蓄積し、分泌された細菌タンパク質の蛍光標識をもとにして、このアッセイは、char型にするために、自動化ハイスループット低分子干渉RNAの画面に結合することができる感染のアップまたはダウンレギュレーションに関与する細胞シグナル伝達経路をacterize。

概要

グラム陽性菌、リステリア·モノサイトゲネス 、宿主細胞に侵入するその内部移行液胞を破壊し、宿主細胞1の細胞質で複製する食品媒介病原体である。L.細胞および動物モデルで観察細菌の病原性形質の持続性に関連した研究室のコンテキスト（急速な成長、健康な人のための低毒性）での操作のしやすさをモノサイトゲネス （溶血作用、白血球増加は）のための主要なモデルとして、1960年の最初の使用は許可されて細胞内寄生の感染2に対する細胞性免疫の理論的基礎の確立のための研究。 1980年代後半から1990年代には、細菌の細胞内サイクル3だけでなく、最も重要な細菌の病原性の分子特性の解剖は4-7 Lの使用を好む要因操作とスタッドのための重要な分子ツールとしてのリステリア宿主細胞の機能のY。 リステリア属の非病原性の存在（ のL.イノキュア ）と病原性（ リステリア菌 ）種は、比較ゲノム研究の8のための道を開いたこと、一緒に完全なLの最近の設立にリステリアは、L.の進化の理解を増加している、9をトランスクリプトームヒトの病原体として、感染の研究の10のためのモデル系として、 リステリア 。

リステリア菌は、それらの宿主細胞受容体はそれぞれ、E-カドヘリンおよびMet、11月12日で、細菌の表面タンパク質INLAおよびinlBの相互作用によって宿主細胞にその内在化を誘導する。最初の候補ベースの研究はINLBクリティカルなエフェクターとしてINLA -侵入経路13のとホスホイノシチド3 -キナーゼ（PI 3-K）の重要な構成要素として、α/βカテニン-アクチンリンクが同定された依存侵入カスカ14〜15·デ·。プロテオミクスおよび機能に基づくアッセイは、その後、新規な細胞骨格要素16および宿主細胞の浸潤に必要な脂質セカンドメッセンジャー17の同定を可能にした。転写の研究18と質量分析に基づく定量的プロテオミクス19は最近、ホストシグナル伝達カスケードの活性化とLの間の免疫応答の抑制に関する新たな光を当てるしている感染をモノサイトゲネス 。低分子干渉RNA（siRNA）をサイレンシングによる遺伝子（kinomes、完全なゲノム）の大きなセットの不活性化に基づいて、システム生物学的アプローチは、最近、食作用を含む特定の細胞機能のコンテキストでグローバルなホストシグナル伝達カスケード、解析のための新たな道を開いていて、病原体の内在化20。ゲノム規模のsiRNAスクリーンは、以前L.の感染に必要な細胞のカスケードを調査するために行われている食細胞ショウジョウバエのリステリア S2細胞21〜22が、この種の分析は、非食細胞中で行われていない、 生体内での感染のための重要な目標を表すものです。

我々はLで、感染の後期の顕微鏡検出のためのプロトコルを最適化しています上皮細胞内の細菌侵入のハイスループットのsiRNAの研究に適していネス 。我々のアッセイは、侵襲性の高いLのを利用していますprfAを点変異を提示するリステリア株、L.の主要な転写調節因子病原性は6因子 モノサイトゲネス ：（prfAを*という名前）は、この変異は23 prfAをが構成的に活性なレンダリング、したがって、そうでなければ不十分な感染非食細胞における細菌侵入を好む、侵入タンパク質INLAおよびinlBの発現増加につながる。感染のための私達の読み出しは、分泌された細菌タンパク質InlCの細胞質ゾル蓄積の検出に基づいている。この分子である細胞質内Lで優先的に発現される多面的エフェクターリステリア 9と参加し、細菌細胞間に24を広めるだけでなく、宿主の免疫応答25を変調するだけではなく。細胞内細菌によるInlC分泌の蛍光標識は、明らかに非感染細胞からの感染を区別することを可能にするだけでなく、その後の別工程で感染を分析するために使用することができ、エンドポイントの読み出しを表していない場合のみ：エントリー、液胞の脱出、細胞質性細菌を増殖および細胞から細胞への広がり。この顕微鏡ベースのプロトコルは、したがって、L.による宿主細胞の感染に関与する細胞経路を研究するためのsiRNAスクリーニングに結合することができるリステリア 。

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プロトコル

1。携帯電話や細菌培養、トランスフェクションツールと一次抗体の調製

  1. 個々のLを分離するために、新鮮な寒天プレートを準備します細菌グリセロールストック（50％glycerol/50％飽和菌液一晩培養）からのリステリアコロニーは-80℃で保存
    1. ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天プレート上で凍結した細菌グリセロールストック、ストリーク細菌を輸送するために（-80℃で保存）、アルミラックを使用。
    2. 48時間（または個々の細菌コロニーを単離することができるまで）の間、37℃でプレートをインキュベートする。
    3. （それは液体培養を播種するために使用されます）1月の最大時間の間、4℃で、その後このワーキングプレートを保管してください。
    4. 我々のプロトコルでは、L.を使用図1、Lに示すようにEGDe.PrfA *株1/2A血清型リステリアが、 P14.PrfA 4B リステリア血清型は、*株は、同様の結果が得られます。
  2. 彼ラATCC CCL2の細胞は、抗生物質の非存在下で、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で増殖させる。
  3. 独立したスクランブルのプール（対照）および抗MetをsiRNAは、黒色384ウェル顕微鏡細胞培養プレートにロードされる。
    1. RNaseフリー水500μlのsiRNAの160ピコモルを希釈し、ウェル当たり、この溶液5μl（最終濃度：1.6ピコモル）を追加します。
    2. 1年間の最大期間、-20℃で、このプレートを保管してください。
  4. 先に説明したように25 InlC-GST組換えタンパク質を用いて免疫化することによって得られたInlC細菌タンパク質に対するポリクローナルウサギ抗体。

2。のsiRNA細胞トランスフェクションを逆転

  1. 感染前の72時間は、各ウェル中で室温にRNaseフリー水5μlの1.6 pmolのsiRNAを含む黒色384ウェル顕微鏡細胞培養プレートをもたらす。
  2. 300で3分間プレートを遠心分離ウェルの壁に堆積されている可能性のsiRNAをダウンさせるために、室温でRCF。
  3. 0.4％リポフェクタミンRNAiMAXトランスを補った室温のDMEMを準備します。
  4. （siRNAのに追加する前に、より長い20分よりトランスフェクション培地をインキュベートしないでください）​​を各ウェルにDMEM / RNAiMAXトランスフェクション培地を25μLを加える。
  5. を形成するためのsiRNA-リポフェクタミン複合体を可能にするために室温で1時間プレートを保持次いで、トランスフェクション溶液でのsiRNAを混合するためにプレートを前後に移動させる。
  6. コンフルエント又は10ミリリットル37°C予め温めたPBSで1回、サブコンフルエント細胞培養フラスコからの洗浄HeLa細胞。
  7. 1ミリリットル37℃の細胞培養フラスコにトリプシンを予め温め、37℃で3〜5分間インキュベート添加することによってHeLa細胞をデタッチ
  8. 10ミリリットル、37℃で再懸濁細胞を、16％FBSを補充したDMEMを予め温めた。
  9. 細胞を計数し、補充したDMEM 1ml当たり12,000細胞の細胞懸濁液を調製16％FBS。
  10. 384ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液50μlを加える。
  11. 細胞を分配し、細胞を室温で10分間落ち着かせて前後に迅速にプレートを移動させる。
  12. パラフィルムでプレートを密封し、37℃で加湿した5％CO 2含有雰囲気中で72時間それを維持

3。携帯感染染色

  1. 感染の前日には、Lの単一コロニーを取るBHI寒天プレートからのリステリアとを15mlポリスチレンチューブ内の液体のBHI培地5ml中に再懸濁する。
  2. 細菌増殖を可能にするためにshacking装置中で37℃で一晩インキュベートする。
  3. 感染日、一晩L. 1mlの洗浄し卓上型遠心機で10,600 RCFで2分間遠心分離することによって文化をリステリア 。
  4. （分泌された細胞毒素テリオOを含む）上清を捨て、1mlのPBSに再懸濁ペレット（repea）洗浄工程を3回以上トン。
  5. 600 nmでの細菌の光学濃度を読んで、細菌の数を（OD = 1は1E9細菌/ mlに相当します）を推定する。
  6. 適切なLを用意する1％FBSを添加したDMEM中で希釈リステリア ：EGDe.PrfA *のような侵襲性の高い株を用いて、ウェル当たりの培地30μlに5E4の細菌の使用を（感染多重度が2000細胞について25と推定されている）を示唆している。
  7. 各ウェルの細胞培養培地（80μL）を取り外し、Lの30μLを追加することによってそれを置き換える培地リステリア含有。
  8. 感染プロセスを同期するために、室温で5分間、200 rcfでプレートを遠心分離する。
  9. 予め温めておいたアルミブロック上、37℃で加湿した5％CO 2含有雰囲気中で1時間プレートをインキュベート。
  10. Lを削除する各ウェルからリステリア含有培地および10％FBSを添加したDMEM予め温め30μlのを追加し、細胞外Lを殺すために40μg/ mlのゲンタマイシンリステリア 。
  11. あらかじめ温めておいた金属ブロック上で37℃、5％のCO 2を含む雰囲気中で4時間インキュベートする。
  12. PBSの溶液を調製し（ホルムアルデヒドモノマーではなく、パラホルムアルデヒドポリマーが、使用されているように、この溶液を新たに調製すべきである）8％ホルムアルデヒドを補充した。
  13. 細胞培養培地を廃棄せずに、8％のホルムアルデヒド（最終濃度：4％）を補充したPBSの30μlを添加し、室温で15分間インキュベートする。
  14. 固定液を除去して（ウェルあたりのPBSを80μlの最終体積中に細胞を維持する）ウェル当たりのPBS 80μLで細胞を3回洗浄する。
  15. 調製1:250のPBS中のウサギ抗InlC血清の希釈は、0.2％サポニンを補充。
  16. PBSを除去した後、各ウェルに一次抗体溶液10μlを添加し、室温で30分間インキュベートする。
  17. 原発を捨てる抗体溶液とウェルあたり40μlのPBSで4回洗浄する。
  18. 0.2％サポニンを補充したPBSで二アレクサフルーア546結合抗ウサギ抗体（1:250）、DAPI溶液（1:1,500）およびファロイジン-DY647（1:150）に希釈する。
  19. 各ウェルに、この二次染色溶液10μlを添加し、室温で30分間インキュベートする。
  20. 二染色液を捨て、（各ウェルに40μLの最終容量を残して、プレートをシール）ウェルあたり40μlのPBSで4回洗浄する。
  21. プレートは直ちに画像化することができ、またはその後の分析のために、光から保護された4°C（アルミホイルで覆う）で保存することができる。

4。画像収集と分析

  1. 10倍の対物レンズを使用して3の異なるチャネル（350ナノメートル、546ナノメートルと647ナノメートル）内の画像を取得する（ウェルあたり優先的に9画像を取得する）自動顕微鏡に搭載された。
  2. InlC信号は、画像を用いて測定することができるそれぞれ、DAPIおよびファロイジン染色を用いて、核および細胞体の自動セグメンテーションを可能にするCellProfiler等解析ソフトウェア。

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結果

細胞質InlCの蛍光標識は、L.により細胞感染のための堅牢な読み出しを提供していますリステリア 、 図1に示されるように：それは位相コントラスト画像（矢印、 図1A）で観察することができ、それがどこにDAPI信号によって確認されるように、顕微鏡写真の中央のセルは非常株P14.PrfA * 23に感染している個々の細菌は、明らかに（ 図1B）を区別することができる。 （図1C中のDAPI染色を重畳）InlC染色は、この分泌されたタンパク質が密に感染した細胞のサイトゾル中に蓄積し、感染した宿主細胞形態の明確な検出を可能にする方法を示している。蛍光ファロイジン（ 図1D）とアクチン細胞骨格の染色は完全に接種された細胞の単層の形態に関する情報を提供し、さらに、どのように、隣接する非感染細胞（*印細胞核）D示しOどんなInlCラベルが表示されませ。これは、細胞質ゾルInlCレベルは、細胞質の細菌数に依存していることから、我々は免疫蛍光とL...

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ディスカッション

いくつかのパラメータがInlC信号の明確な検出を可能にする十分に大きな細胞質を表示する健康な細胞株の使用を含む、我々のInlC検出プロトコルの成功のために重要である。検定では、我々は、それらの細胞質ゾルのスペースの拡張に私たちの分析に特に適しているのHeLa CCL2細胞の使用を提案し、この記事で提示し、このようなヒーラ京都細胞のような他のHeLa細胞クローンは小さく、細胞質を表示しますが、使用することができます我々の感染プロトコルで（細胞はしばしばCCL2のHeLa細胞の場合の隣接セルと重ならないので、京都のHeLa細胞を、特によくセグメンテーション分析のために適合されている）。このような多形核細胞やマクロファージなどの非常に小さな細胞質を提示する細胞は、我々のプロトコルと組み合わせて使用​​することが推奨されていません。

我々がここに存在する1つの撮像プロトコルの制限は、細胞の最小量INFEする必要があるということである十分な分解力電力をシステムに提供するために、対照条件における所与の単層、CTED：少数の細胞が感染している場合、それ以外の場合には、感染率の変化を決定することが...

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開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

P. Cossart研究室での研究は、パスツール研究所、研究所国立·デ·ラ·サンテら·デ·ラ·ルシェルシュMédicale、研究所国立·デ·ラ·ルシェルシュAgronomique、ERCアドバンスト·グラント（233348）、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（グラント三重でサポートされているSignRupVac）、ルイ·Jeantet財団と財団ル·ロッシュレMousquetaires。 AKは、パスツール、パリ大学国際博士課程/研究所カルノー病気Infectieusesから奨学金の受取人である。我々は、細胞のトランスフェクションプロトコルを最適化するためのジェイソンマーサーに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Bacto Brain Heart InfusionBD237500液体BHI調製用
Bacto AgarBD214010BHI寒天プレート用液体BHIへのサプリメント
熱不活化ウシ胎児血清Biowest51830-500
DMEMInvitrogen61965-026
Lipofectamine RNAiMaxInvitrogen13778-100
ゲンタマイシンSigmaG1397-10ML
ホルムアルデヒド (16%)EMS15710各実験の前に新鮮な準備
抗ウサギ Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
DAPIInvitrogenD-1306
Phalloidin Dy647Dyomics647-33
siRNA ScrambleDharmaconD-001810-10
siRNA MetDharmaconL-003156-00-0005
ブラック 384ウェル顕微鏡 細胞培養プレートCorning3985
AxioObserver Z1 顕微鏡ツァイス431007 9901
sCMOS カメラAndorNeo
Metamorph 解析ソフトウェアMolecular Devices4000
CellProfiler解析ソフトウェアBroad Instituteの公開ソフトウェアhttp://www.cellprofiler.org/

参考文献

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再版と許可

訂正


Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 6/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

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