インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

サマリー

一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。

要約

移動は、生細胞の重要な特性であり、正常な発生、免疫応答、および癌の転移や炎症などの疾患プロセスにとって重要です。細胞遊走を調べる方法は、がん生物学、免疫学、血管生物学、細胞生物学、発生生物学など、幅広い生物医学研究にとって非常に有用で重要です。ここでは、腫瘍細胞の遊走と浸潤を例にとり、これらのプロセスを測定するために一般的に使用される、簡単にアクセスできる方法を示すために、2つの関連するアッセイについて説明します。1つ目の方法は、コンフルエントな細胞単分子膜上にスクラッチを生成する細胞培養創傷閉鎖アッセイです。創傷閉鎖と細胞移動の速度は、通常の倒立顕微鏡で数回の時間間隔でスナップショット写真を撮ることで定量化できます。より詳細な細胞移動行動は、タイムラプス顕微鏡システムを使用して文書化できます。この論文で説明した2つ目の方法は、細胞の運動性とケモアトラクタントグラジエントへの浸潤性を測定するトランズウェル細胞遊走および浸潤アッセイです。私たちの目標は、これらの方法を非常にアクセスしやすい方法で説明し、基本的な細胞生物学のセットアップだけでも研究室で手順を成功裏に実行できるようにすることです。

概要

運動性は、生きた細胞の本質的な特徴である。細胞遊走は、生命、胚発生、免疫応答、並びに癌転移および炎症^1-9のような多くの病理学的プロセスの概念に関与する。そのため、細胞移動挙動を研究するための方法は生物医科学、生物学、生物工学、および関連分野における専門分野の広い範囲のために非常に有用な研究ツールである。

癌患者の死亡の主な原因は、転移の進行に関連しているように、癌研究における細胞移動の研究は、特に重要である。体全体に広がり、普及させる癌のために、癌細胞は、移行する必要がありますし、intravasate血液循環中に、細胞外マトリックス（ECM）を介して侵入し、離れた部位に付着し、最終的には遠くの巣^1,10-12を形成するために浸出。様々な生物学的方法が詳細にこれらの事象を研究するために用いることができる。細胞培養創傷閉鎖ANdは、トランスウェル遊走および浸潤アッセイが広く科学界^1,10に使用される。これらのテストは、特定の細胞型が自然に移行または化学誘引物質に反応し、方向的にそれに向かって移動することができますどれだけの理解を可能にすることができる必要なデータを提供することができます。いくつかの渡り鳥の表現型が記載されている。細胞は、間葉またはアメーバ様運動で、または多細胞運動によって見られるような単細胞状に移動することができる¹³の^{ストリーミング}遊走または細胞集団を標識した。運動性細胞において使用される移動の方法は、容易に細胞培養創傷閉鎖アッセイ法を用いて観察することができる。

細胞移動を研究するための多くの方法の中でも、細胞創傷閉鎖アッセイは、最も簡単なの一つである。この方法は、全細胞塊の遊走能を決定するために有用である。さらに一歩撮影時には、移行中に¹⁴個々の細胞の形態学的特徴を観察するために使用することができる。創傷閉鎖の分析に続いて、多くの表現型を明らかにすることができる。コントロールと比較し時間をかけて、閉じた距離を測定することは、特定の移行変更やこれまで知られていなかった障害のある渡り鳥の表現型を明らかにすることができる。さらに、単一細胞葉状仮足の形成、尾部退縮、および方向移動は、関心対象¹⁴の細胞で損なわ又は増強することができる何の手 ​​がかりを与えることができる。

トランスウェル遊走および浸潤アッセイは、それらが方向性ケモカイン、増殖因子、脂質、またはヌクレオチド^4,5,8,15,16であるかどうかを、種々の化学誘引物質に応答する単一細胞の能力を分析するために使用されてもよい。それはまた、受容体^1,14の過剰発現に差動回遊能力を評価することができる。これらのアッセイはまた、低分子量GTPase ²のRhoファミリーなどの細胞移動の重要な調節因子を同定および特徴付けるために使用することができる。これらの短い、以下、簡単にアクセスもてアクセスします試験、細胞移動のモードと3-Dマトリックスに浸潤する細胞の能力を決定することもできる。

プロトコル

1。細胞培養創傷閉鎖アッセイ

1. 0.25％トリプシン-EDTA溶液を用いて組織培養プレートから細胞を剥離。ペレットを遠心分離により15ミリリットルの円錐管中の細胞上清を吸引し、培養培地中に再懸濁細胞。 24時間で100％のコンフルエンスのために6ウェルプレート中の適切な数の細胞をプレート。
   注：試験による細胞型と同様に使用されているのサイズに100％の集密度を達成するための時間および細胞の数を決定するために必要とされてもよい（例えば、1×10 ⁶個のB16F10メラノーマ細胞をウェルに播種し創傷の発生の24時間前に6ウェルプレート）。あるいは、12ウェルまたは24ウェルプレートを使用することができる。
   注意：使用可能な場合は、細胞が傷プレキャストを作る処理した組織培養プレート上で培養インサート（ibidi LLCから）中に播種することができます。文化の挿入は、ピペットチップによる損傷から組織培養プレートの表面を保護することができる。文化挿入はオミットステップを使用している場合1.2。
2. 無菌環境（通常はバイオセーフティフード）で組織培養プレートの上にしっかりと押して、速やかに細胞単層を通って下の縦傷を作るために200μlのピペットチップを使用しています。異なるサイズのピペットチップは、所望される創傷サイズを作製するために使用されてもよい。それは表面を傷つける可能性があるピペットチップで組織培養プレートに無理な力を加えないでください。創傷が予めキャストである場合、このステップは省略してもよい。
3. 注意深く培地および細胞の破片を吸引する。ゆっくりウェルの底をカバーし、追加の細胞を剥離しないように十分に壁に対して十分な培養培地を追加します。傷の発生や検査次の初期画面は、注意が必要です。適切な温度およびCO ₂濃度（通常37℃、5％CO _2）に設定したインキュベータ中で組織培養プレートを置き。
4. いくつかの時点で、3時間ごとなど 、incubatからプレートを取り外しまたはスナップショット撮影すると、創傷閉鎖をチェックするために倒立顕微鏡下に置きます。タイムラプス顕微鏡を使用できる場合は、いつでも温度の持続時間と、CO ₂制御室のために写真を（通常は5分ごとに始まる）分のすべてのXの数を取る。細胞型に依存して、創傷閉鎖時間は変わる場合があります。
5. スナップショット画像の結果を分析するために、スケールバーを使用して、他の創傷の片側の距離を測定する。散布図や棒グラフなどの 図1を使用して分析し、時間の経過とともに明らかに存在創傷閉鎖。
6. タイムラプス画像を分析するために、ビデオを作るために（http://rsb.info.nih.gov/ij/で自由に利用できる）ImageJソフトウェアに写真をインポートします。このオープンはImageJを行うには、ファイル、インポート、およびイメージシーケンスをクリックします。写真を使用してファイルを見つける。ファイル内の最初の写真をクリックしてください。 、ファイルを選択して、ビデオを保存として保存し、AVIファイル。シングル移動細胞は、キャラに観察されることがある方向の動きをcterize。さらに、このような葉状仮足の形成及び後縁の後退などの形態学的特徴（ 図2及び補助ビデオ）ならびに研究することができる。

2。トランスウェル細胞遊走および浸潤アッセイ

1. 無菌環境（典型的には、バイオセーフティーフード）中で遠心分離することにより、非酵素的細胞解離緩衝液または0.25％トリプシン-EDTA溶液を用いてペレット細胞を組織培養プレートから細胞を剥離し、ペレット化した細胞を残す既存の培地を吸引除去する。 0.1％BSA（ウシ血清アルブミン）を含有する無血清細胞培養培地中で細胞を再懸濁する。
   注：トリプシン-EDTAによる細胞表面¹⁷上の種々の受容体の切断に対する細胞の遊走および浸潤に影響を与える可能性が0.25％を調査される細胞株に依存して。
   注：ml当たりの細胞数、細胞のサイズに依存する。さらなる試験は、プロ播種密度を見つけるために必要とされ得る最良の結果をvides。 24ウェルトランスウェルインサートを使用するとき、典型的には1×10 ⁶細胞/ mlのほとんどの細胞型のための良い出発点である。トランスウェルインサートサイズの範囲と添加した細胞の数はそれに応じてのために調整されるべきでもある。
2. プレート100トランスウェルインサート内フィルター膜の上に細胞溶液の液とは、37℃で10分間インキュベートし、5％のCO ₂の細胞が落ち着いてできるようにする。
   注：使用されるトランスウェル膜の特定の細孔サイズは、試料中の細胞の個々の大きさに依存する。細胞が小さすぎる場合は、それらは、移行を容易にするために、またはそれらが大きすぎる場合、それらが孔を通って適合しない場合を必要とせずに細孔を通過することができる。いくつかのトランスウェル3ミクロンまでの範囲の細孔径を有する挿入、5ミクロン、および細胞遊走アッセイのための8ミクロンがあります。トランスウェルインサートは、例えば、コーニング社のような会社から市販されている。
   注：トランスウェルMigrationアッセイは、容易に細胞浸潤アッセイを行うために改変することができる。これを行うには、トランスウェル膜の上に、細胞外マトリックス（ECM）材料を追加してから、ECMの上にセルを追加。例えば、マトリゲルを解凍し、氷上で液化し、次いでマトリゲルの30〜50μlを、トランスウェルインサートを24ウェルに添加し、薄いゲル層を形成するために15〜30分間37℃のインキュベーター中で固化した。細胞溶液を細胞外マトリックスを介して侵入するのをシミュレートするためにマトリゲルコーティングの上に付加される。
   注意：トランスウェル細胞遊走およびトランスウェル細胞浸潤アッセイの間に明確な違いがあります。トランスウェル細胞移動アッセイは、化学誘引物質に向かう細胞の走化性能力を測定する。トランスウェル細胞浸潤アッセイは、しかしながら、細胞外マトリックスを介して一般に癌の転移又は胚発生中に見出されているプロセスを細胞走化性および細胞の浸潤の両方を測定する。
3. ピペットを用いて、非常にcarefully 24ウェルプレート内の下部チャンバーの底部に必要な化学誘引物質を600μlを加える。トランスウェルインサートを移動させずに化学誘引物質を加え、気泡を発生しないようにします。底に化学誘引液がうまく走化性勾配を形成するために、上だけでなく、膜と接触することを確認します。インキュベーション時間は、細胞の種類および使用される化学誘引物質に依存する。
   注：さらなる試験は、インキュベーション期間を決定するために必要とされてもよい。
   注：接着細胞の場合、移動した細胞を膜^1,8の他方の側に付着する。移動した細胞の定量化は、ステップ2.4​​（2.4〜2.8は、無菌環境で実施される必要がないステップ）2.8以下を行うことができる。非接着細胞の場合は、移動した細胞を下部チャンバーにメディアにドロップします。遊走した細胞の数は血球計数器を用いて計数または⁵フローサイトメーターすることができる。
4. プレートからトランスウェルインサートを削除する。慎重に損傷を与えることなく、膜の上から移行していないメディアや、残りの細胞を除去するために、必要に応じて何度でも綿棒を使用してください。
5. 24ウェルプレートのウェルに70％エタノールを600〜1,000μLを加える。細胞固定を可能にするために10分間70％エタノール中にトランスウェルインサートを配置する。 24ウェルプレートからトランスウェルインサートを取り外し、膜の上から残りのエタノールを除去し綿棒を使用しています。トランスウェル膜（一般的に10〜15分）を乾燥することができます。
6. 24ウェルプレートのウェルに0.2％クリスタルバイオレットの600〜1,000μLを加え、染色のために、その中に膜を配置する。 5〜10分間、室温でインキュベートする。
7. そっとピペットチップや綿棒で膜の上からクリスタルバイオレットを削除します。非常に慎重に、過剰な結晶ヴィオレを除去するために、必要に応じて蒸留水に何度でもメンブレンを浸し、固定した細胞を洗浄オフ避けるためにT。トランスウェルメンブレンを乾燥させる。
8. ビュー倒立顕微鏡の下や化学誘引物質に向かって、膜を通って移動し、膜の下側（ 図3）に付着した細胞の平均の合計を取得するために、ビューのさまざまな分野でのセルの数をカウントします。

結果

ここに提示創傷閉鎖アッセイ及びトランスウェル細胞移動アッセイをモデル系としてマウスB16F10メラノーマ細胞を用いて行った。創傷閉鎖アッセイでは、B16F10細胞を6ウェル組織培養プレートに播種し、24時間で100％のコンフルエンスまで増殖させた。約700μm幅の傷をタイムラプス顕微鏡を用いて記録したピペットチップ及び創傷閉鎖（細胞遊走）を用いて生成した。タイムラプス顕微鏡検査は^、1利用できない場合、あるいは、創傷閉鎖はまた、異なる時点でのスナップショットを撮影することによって研究することができる。四つ0における経時系列からのピクチャ、4,8、および12時間の時点を図1に示す。創傷の幅に基づいて、我々は40.42ミクロンでの細胞移動の移動距離と速度を算出/時間（ 図1B）。タイムラプス画像もImageJのプログラム（補足ビデオ参照）を使用してビデオに組み立てた。目電子動的セル移行プロセスを研究することができる。 図2に示すように、葉状仮足（前縁）及び尾部（後縁）を用いて細胞の移行の形態は明瞭に観察された。

...

ディスカッション

細胞遊走は、癌研究において研究する重要な側面であり、それはまた、免疫学的発達および創傷治癒の研究に適用することができる。細胞培養は、閉鎖アッセイを巻き取り、トランスウェル細胞遊走および浸潤アッセイは、細胞遊走挙動の詳細な情報を明らかにし、細胞遊走^1,2,10,14の分子機構を研究するために使用することができる。我々の研究は、B16F10メラノーマ細胞株の移動速度および浸潤能力を決定するために、これらの細胞運動性アッセイを用いる。

細胞創傷閉鎖アッセイは移動し、続いて細胞のコンフルエントなプレートで行われた創傷を閉鎖するための特定の細胞系の能力を調べる。このアッセイは、基本的な機器とし、既存の方法と比較して、基に高度にアクセス可能な細胞遊走を測定するための簡単​​な方法である。創傷閉鎖アッセイにおけるいくつかの変化は、個々の治療群に見られるが、そのMA、いくつかのステップがありますYはそれを軽減に役立つように注意する。ばらつきを低減する一つの潜在的な方法は、同期コンフルエンスを達成し、各実験の開始時に健康な細胞状態を維持するために、同数の細胞に各試料をメッキする...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコS modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal usvine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)	Gibco	14190-250
クリスタルバイオレット	Sigma	C0775-100G	0.2%で水に溶解
細胞解離緩衝液	Gibco	13151-014
細胞培養インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック		モデル # 3145
SterilGARD バイオセーフティフード	The Baker Company, Inc.		モデル#VBM-600
EVOS Fl倒立顕微鏡	サーモフィッシャーサイエンティフィック		モデル#AMF-4302-US
組織培養プレート	ベクトン・ディキンソン	353046	カタログ番号は培養プレートの種類によって異なります
コーニング・トランズウェル・インサート	フィッシャー	07-200-150	カタログ番号はメンブレンの細孔サイズによって異なります