インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

サマリー

一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。

要約

移動は、生細胞の重要な特性であり、正常な発生、免疫応答、および癌の転移や炎症などの疾患プロセスにとって重要です。細胞遊走を調べる方法は、がん生物学、免疫学、血管生物学、細胞生物学、発生生物学など、幅広い生物医学研究にとって非常に有用で重要です。ここでは、腫瘍細胞の遊走と浸潤を例にとり、これらのプロセスを測定するために一般的に使用される、簡単にアクセスできる方法を示すために、2つの関連するアッセイについて説明します。1つ目の方法は、コンフルエントな細胞単分子膜上にスクラッチを生成する細胞培養創傷閉鎖アッセイです。創傷閉鎖と細胞移動の速度は、通常の倒立顕微鏡で数回の時間間隔でスナップショット写真を撮ることで定量化できます。より詳細な細胞移動行動は、タイムラプス顕微鏡システムを使用して文書化できます。この論文で説明した2つ目の方法は、細胞の運動性とケモアトラクタントグラジエントへの浸潤性を測定するトランズウェル細胞遊走および浸潤アッセイです。私たちの目標は、これらの方法を非常にアクセスしやすい方法で説明し、基本的な細胞生物学のセットアップだけでも研究室で手順を成功裏に実行できるようにすることです。

概要

運動性は、生きた細胞の本質的な特徴である。細胞遊走は、生命、胚発生、免疫応答、並びに癌転移および炎症^1-9のような多くの病理学的プロセスの概念に関与する。そのため、細胞移動挙動を研究するための方法は生物医科学、生物学、生物工学、および関連分野における専門分野の広い範囲のために非常に有用な研究ツールである。

癌患者の死亡の主な原因は、転移の進行に関連しているように、癌研究における細胞移動の研究は、特に重要である。体全体に広がり、普及させる癌のために、癌細胞は、移行する必要がありますし、intravasate血液循環中に、細胞外マトリックス（ECM）を介して侵入し、離れた部位に付着し、最終的には遠くの巣^1,10-12を形成するために浸出。様々な生物学的方法が詳細にこれらの事象を研究するために用いることができる。細胞培養創傷閉鎖ANdは、トランスウェル遊走および浸潤アッセイが広く科学界^1,10に使用される。これらのテストは、特定の細胞型が自然に移行または化学誘引物質に反応し、方向的にそれに向かって移動することができますどれだけの理解を可能にすることができる必要なデータを提供することができます。いくつかの渡り鳥の表現型が記載されている。細胞は、間葉またはアメーバ様運動で、または多細胞運動によって見られるような単細胞状に移動することができる¹³の^{ストリーミング}遊走または細胞集団....

プロトコル

1。細胞培養創傷閉鎖アッセイ

1. 0.25％トリプシン-EDTA溶液を用いて組織培養プレートから細胞を剥離。ペレットを遠心分離により15ミリリットルの円錐管中の細胞上清を吸引し、培養培地中に再懸濁細胞。 24時間で100％のコンフルエンスのために6ウェルプレート中の適切な数の細胞をプレート。
   注：試験による細胞型と同様に使用されているのサイズに100％の集密度を達成するための時間および細胞の数を決定するために必要とされてもよい（例えば、1×10 ⁶個のB16F10メラノーマ細胞をウェルに播種し創傷の発生の24時間前に6ウェルプレート）。あるいは、12ウェルまたは24ウェルプレートを使用することができる。
   注意：使用可能な場合は、細胞が傷プレキャストを作る処理した組織培養プレート上で培養インサート（ibidi LLCから）中に播種することができます。文化の挿入は、ピペットチップによる損傷から組織培養プレートの表面を保護することができる。文化挿入はオミットステップを使用している場合1.2。
2. 無菌環境（通常はバイオセーフティフード）で組織培養プレートの上にしっかりと押して、速やかに細胞単層を通って下の縦傷を作るために200μlのピペットチップを使用しています。異なるサイズのピペットチップは、所望される創傷サイズを作製するために使用されてもよい。それは表面を傷つける可能性があるピペットチップで組織培養プレートに無理な力を加えないでください。創傷が予めキャスト....

結果

ここに提示創傷閉鎖アッセイ及びトランスウェル細胞移動アッセイをモデル系としてマウスB16F10メラノーマ細胞を用いて行った。創傷閉鎖アッセイでは、B16F10細胞を6ウェル組織培養プレートに播種し、24時間で100％のコンフルエンスまで増殖させた。約700μm幅の傷をタイムラプス顕微鏡を用いて記録したピペットチップ及び創傷閉鎖（細胞遊走）を用いて生成した。タイムラプス顕微鏡検査は^、1利用できない場合、あるいは、創傷閉鎖はまた、異なる時点でのスナップショットを撮影することによって研究することができる。四つ0における経時系列からのピクチャ、4,8、および12時間の時点を図1に示す。創傷の幅に基づいて、我々は40.42ミクロンでの細胞移動の移動距離と速度を算出/時間（ 図1B）。タイムラプス画像もImageJのプログラム（補足ビデオ参照）を使用してビデオに組み立てた。目電子動的セル移行プロセスを研究することができる。 図2に示すように、葉状仮足（前縁）及び尾部（後縁）を用いて細胞の移行の形態は明瞭に観察された。

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ディスカッション

細胞遊走は、癌研究において研究する重要な側面であり、それはまた、免疫学的発達および創傷治癒の研究に適用することができる。細胞培養は、閉鎖アッセイを巻き取り、トランスウェル細胞遊走および浸潤アッセイは、細胞遊走挙動の詳細な情報を明らかにし、細胞遊走^1,2,10,14の分子機構を研究するために使用することができる。我々の研究は、B16F10メラノーマ細胞株の移動速度および浸潤能力を決定するために、これらの細胞運動性アッセイを用いる。

細胞創傷閉鎖アッセイは移動し、続いて細胞のコンフルエントなプレートで行われた創傷を閉鎖するための特定の細胞系の能力を調べる。このアッセイは、基本的な機器とし、既存の方法と比較して、基に高度にアクセス可能な細胞遊走を測定するための簡単​​な方法である。創傷閉鎖アッセイにおけるいくつかの変化は、個々の治療群に見られるが、そのMA、いくつかのステップがありますYはそれを軽減に役立つように注意する。ばらつきを低減する一つの潜在的な方法は、同期コンフルエンスを達成し、各実験の開始時に健康な細胞状態を維持するために、同数の細胞に各試料をメッキする.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコS modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal usvine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)	Gibco	14190-250
クリスタルバイオレット	Sigma	C0775-100G	0.2%で水に溶解
細胞解離緩衝液	Gibco	13151-014
細胞培養インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック		モデル # 3145
SterilGARD バイオセーフティフード	The Baker Company, Inc.		モデル#VBM-600
EVOS Fl倒立顕微鏡	サーモフィッシャーサイエンティフィック		モデル#AMF-4302-US
組織培養プレート	ベクトン・ディキンソン	353046	カタログ番号は培養プレートの種類によって異なります
コーニング・トランズウェル・インサート	フィッシャー	07-200-150	カタログ番号はメンブレンの細孔サイズによって異なります