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方法論記事

膵神経可塑性をシミュレートする。

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DOI：

10.3791/51049

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2014年4月14日

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1Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

この記事について

サマリー

神経可塑性は、胃腸（GI）管のますます認識したが、十分に理解する機能です。ここでは、人間の膵臓疾患の例では、形態学的および機能的レベルでの消化管における神経可塑性の研究のためのin vitro神経可塑性アッセイを提示する。

要約

神経可塑性は、腸神経系および病理学的条件の下で胃腸（GI）神経支配の本質的な機能です。しかし、GI障害における神経可塑性の病態生理学的役割は不明である。シミュレーションと消化管神経可塑性の調節を可能にする新規実験モデルは、膵臓癌（PCA）および慢性膵炎（CP）などの特定のGI疾患における神経可塑性の寄与の強化鑑賞を可能にすることができる。ここでは、生まれたばかりのラットの後根神経節（DRG）と筋層間神経叢（MP）ニューロンを用いたin vitroの条件下で膵臓神経可塑性のシミュレーションのためのプロトコルを提示する。このデュアルニューロンのアプローチは、両方の臓器内因性および外因性神経可塑性の監視を許可するだけでなく、神経細胞やグリアの形態および電気生理学を評価するための貴重なツールを表していないだけ。また、彼らのIMPACを研究のために供給微小環境の内容の機能的調節を可能にする神経可塑性上のT。設立後は、現在の神経可塑性アッセイは、任意の消化器官における神経可塑性の研究に適用できる可能性を負いません。

概要

胃腸（GI）神経形態学および密度の変化は、長い間、消化器病理学者の注目を集めているが、消化管疾患の病態生理のための関連性は不明である1-3。実際、このような胃炎、逆流性食道炎、大腸炎、憩室炎、および虫垂炎のようないくつかの非常に一般的な胃腸障害は、炎症を起こした組織領域1での増加神経支配密度に関連している。しかし、本物の注目は、これまでのところ、消化管でのメカニズムと神経可塑性の意味に支払われていない。形態学的に変更された消化管神経はそれらの機能の面で、腸神経系の正常な状態、つまり 、通常の消化管の神経とは異なりますか？プラスチック腸神経における変化した神経ペプチド/神経伝達物質の含有量の意味は何ですか？周辺神経可塑性は、常に、中枢神経系に変更された信号伝達を伴うのですか？どこプラスチックextriの中心投影があるNSIC消化管神経経路？消化管神経可塑性の機能的な側面に関する知識の不足を見たときに、このような重要な質問の長いシリーズを容易に生成することができる。

機能レベルでのGI神経可塑性の研究は、有効な再現性があり、今でも容易に適用可能な実験モデルを必要とします。遺伝子操作された条件付きマウスモデル（GECoMM）の普及と受け入れの時代に、 生体内の設定で 、このような現実的な方法1でのGI神経可塑性のこれまで知られていなかった側面を解明する可能性を負うものとします。しかし、GECoMMの設計と製造コストのかかる、労働集約的で、特に、時間のかかるまま。さらに、これらは条件付きで遺伝子改変マウス（腸上皮細胞における神経成長因子/ NGFの例えばトランスジェニック過剰発現）で変調されるターゲットの事前選択が必要。したがって、DESのための成功GECoMMのIGNは、研究者は、価値のある目標のいくつかの指標（ 例えば 、以前の実験データ）を必要とする（ここでは、NGF）、対象となる分子は、少なくとも消化管の神経に何らかの生物学的に関連の効果を発揮することが期待できること、つまり 。

このような指標は、容易にインビボ系の複合体微小環境から単離された細胞サブタイプを選択的にヘテロ様式4-7に共培養することができるインビトロモデルにおいて十分に由来することができる。このような異文化環境における分子標的の変調が速く、平均して技術的にあまり面倒であり、したがって、in vivo試験での検証のための価値ある目標の事前フィルタリングを支援することができます。

最近では、膵臓内のNEの増加、神経密度と肥大をシミュレートするように設計されたイン·ビトロ神経可塑性アッセイを発表ヒト膵臓癌（PCA）および慢性膵炎（CP）の組織におけるrves。ここでは、生まれたばかりのラットの後根神経節（DRG）または筋層間神経叢（MP）に由来するニューロンは、外科的に切除されたPCaまたはCPの組織標本から組織抽出物に曝露し、正常ヒト膵臓（NP）組織抽出物5で培養されたものと比較した。代わりに、組織抽出物から、人はまた、神経可塑性に関する選択された細胞型の影響を研究するために細胞株の上清を使用することができる。標準化された形態計測測定と組み合わせることで、提示神経可塑性アッセイは、様々な膵臓微小環境に応じて、神経可塑性の有効かつ再現性のある評価を可能にする。特に、それが可能にする、神経突起伸長、およびニューロンパターン寸法を分岐し、2）機能的な神経可塑性、末梢ニューロンの興奮性の変化、すなわち変化、すなわち 1）形態学的可塑性のシミュレーション。また、周辺機器だけではなく（ つまり、 腸溶）だけでなく、） 例えば、DRG又は二次脊髄（中枢ニューロンは、異なるGI組織コンテンツへの形態学的および機能的反応を評価するために、本 ​​アッセイに含めることができる。現在のビデオチュートリアルでは、このアッセイの性能のための技術的なプロトコルを示し、その利点と弱点を議論する。さらに、我々はすべての消化器官における神経可塑性の研究にこのアッセイの基本的な概念の適用可能性に注意を引く。

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プロトコル

プロトコルのすべての動物実験手順はミュンヘン工科大学、ドイツの動物管理のガイドラインに従ってください。

1。メディア/抽出物の調製

  1. 組織の均質化
    組織の均質化の質は培養神経細胞における神経可塑的変化のその後の検出に重要である。ここでは、ホモジナイザーは、組織温度の大幅な増加なしに組織分離を可能にすることをお勧めします。
    1. 転送5ミリメートル×5ミリメートル×5ミリメートルの直接組織homogenator固相中の液体窒素や場所に-80℃から膵臓組織の立方体。理想的なhomogenatorはdefreezeさせることなく、十分な速さで組織を解離でしょう。
    2. すぐに解離した後、0.1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の300〜500μlに固体、粉末状のホモジネートを再懸濁する。ここでは、これは神経細胞を溶解可能性があるので（例えば、RIPAなど）任意の溶解バッファーを使用しないでください。
    3. あなたのベンチ遠心機（ 例：21130×g）での最大速度で少なくとも15分間、ホモジネートを遠心分離する。組織抽出物を表す透明な上澄みを収集します。
  2. 細胞株上清
    1. 通常の増殖培地中で80％コンフルエンス - その他の細胞は少なくとも70に到達しよう。
    2. 通常、これらの培地は、血清成分を含有し、ニューロンの成長時に制御不能な効果を発揮し得る。従って、所望の細胞密度に達した後、細胞培養グレードPBSで少なくとも3回あなたの細胞を洗浄し、最大48時間、無血清培地（SFM）に配置します。
      注：ここで、（膵臓星細胞のような）いくつかの細胞はそれらの正常な状態および構造を維持するために、それらの増殖培地中の血清を必要とするかもしれないと考えている。このような場合、無傷の細胞のfunctioのために必要な限り低い血清コンテンツを見つけるために目的の細胞の培地中に連続血清希釈を行うN。
    3. Bradfordタンパク質アッセイを介して組織ホモジネートまたは細胞上清のタンパク質濃度を測定する。これらの値は、組織および細胞型に応じて異なるが、膵臓組織抽出のために、人はμgの/μlの5〜12の間、及び/μlの3-8μgの間の細胞株の上清のための濃度範囲が予想される。

2。注しエキスおよび細胞上清

アッセイに使用する濃度に応じて、神経細胞培地中の抽出物または上清の最終濃度は100μg/ mlの5,8であるべきである。

注：ニューロンは、24ウェルプレートの各ウェルに500μlの培地中で増殖でアッセイのために、一つはウェル当たり各抽出物または上清からの50μgのタンパク質を必要とする。約10μgの/μLの典型的な抽出物濃度で、1は、各ウェルについての抽出物/上清の5μLが必要になります。すべてのsettin中Gは三連のように実施、これは抽出/上清の15μlに対応することになる。異なる組織または細胞型では、最終的な抽出物または上清濃度の希釈を行い、さまざまなエキス/上清濃度と観測され、神経栄養効果を比較。

ニューロンの3。分離

エキス/上清の収集が完了すると、神経細胞の分離を続けていく。

  1. DRGニューロンでは、断頭およびDRGの実体顕微鏡解剖（ 図1A）の後に生後間新生児ラットのDRG（P）2月12日に腰椎する頚椎を収集します。 24穴プレートに十分なDRGニューロンを持つために、プレートあたり1新生児ラットのDRG（5​​2 DRGに等しい）を腰椎へのすべての子宮頸を収集します。
    1. microscissorsによって末梢（神経）およびDRGの中央予測（ルーツ）を外した。
      所定の位置に突起物を残すことはチュレーションを妨げ、Tが増加彼は、線維芽細胞による文化のリスクを汚染。
  2. MPニューロンの場合は、（MP分離に関する詳細なプロトコルに対して、シェーファーらを参照してください。9、 図1B）、小腸から腸間膜を切り取ると、手動で、慎重に小腸の漿膜筋層の層を取り除く。 MPのために、24ウェルプレートあたり2匹のラットから神経叢を収集します。
    注：これらは小腸からの正常な分離を妨げるため、漿膜筋層の層に涙を避けるために、できるだけ優しくするようにしてください。
  3. DRGおよびゲンタマイシン（500ミリリットル培地中の20mg）をし、メトロニダゾール（中500ミリリットル中2.5ミリグラム）が供給氷のように冷たい最小必須培地（MEM）中の漿膜筋層の層を収集します。
  4. DRGのコレクションに続いて、20〜30分のためのコラゲナーゼタイプIIに付属のハンクス平衡塩溶液（HBSS）でそれらをインキュベートする。 MP単離のために、年齢に応じて、1〜3時間の間のコラゲナーゼタイプでインキュベート動物（ 図1C）の。
  5. MPについては、実体顕微鏡下で網目状のMP片を収集し、氷冷MEMに転送します。
  6. その後、径を小さくして、注射器を通してDRGとMPを粉砕する。
    注意：過度の粉砕して、神経細胞を破壊するが、あまりグリア細胞ができます。
  7. DRGまたはMPを含む培地は、5分間93.9×gで曇り、遠心サスペンションとなった後は、神経基本培地で培地に再懸濁を破棄（100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、0.5mMのL-グルタミンおよび2％B-27）。
  8. 血球計数器を用いて細胞の総数（ すなわちニューロンおよびグリア）を数える。
    注：必要な細胞の数は、測定パラメータに依存している。神経突起密度の定量のために、人は、神経突起伸長、perikaryonal大きさを測定するためのより高密度培養、従って、細胞のより多くを必要とするそして、個々の神経細胞のパターンを分岐。神経突起密度測定のために、 例えば 10,000個の細胞（ニューロン+グリア）/ウェルウェルまたは1500ニューロン/を使用しています。個々のニューロン、簡単に（1分の長さの）細胞のトリプシン処理および2,500細胞/ウェルまたは400ニューロン/の播種に対する形態計測のためによくお勧めします。 1ラットから得られた細胞の典型的な収量は約300,000〜500,000細胞である。
  9. （100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、0.5mMのL-グルタミンおよび2％B-27を補充した）Neurobasal培地でウェル前の晩に、上部を被覆した13mmのカバースリップ上に細胞を播種（ 図1D）。
    注：使用するポリ-D-リシン（40ミリグラム/ m 2）のオルニチンとラミニンでコーティングされた（1 mg / mlの各）コーティングされたカバーガラス。細胞は、このように多くの細胞が必要とされる実験（ すなわち、神経突起密度測定）に適して、非常に高速なポリ-D-リジンに付着する。ラミニンへの結合は、一般的ないくつかである弱い何が、ラミニン、神経突起伸長の強力なプロモーターである。このため、神経細胞の分岐や神経突起の長さの測定のために、オルニチン/ラミニンコーティングを好む。
  10. 細胞は一晩ウェルに添付を許可します。翌日、（100μg/ mlの最終的な抽出/上清濃度で）エキス添加培地を準備。
  11. 播種培地を吸引し、PBSで、オプションの、非常に穏やかな洗浄を行い、その後、ゆっくりと抽出/上清添加培地（ 図1E）をピペット。
  12. 細胞は48時間成長しましょう​​。培地を吸引除去し、免疫染色のための4％パラホルムアルデヒド（ 図1F）で固定します。
  13. 神経細胞特異的（ 例えば 、βIII-チューブリン）とグリア固有（ 例えば 、グリアfibriallary酸性タンパク質/ GFAP）マーカー（ 図1G）を用いた二重免疫蛍光染色を行う。
  14. 形態計測のために、組合せのwi CCDカメラを備えた倒立光学顕微鏡を使用し神経突起密度の測定を可能にする第自動化ソフトウェア（表を参照）。
  15. 神経細胞培養の神経突起密度は50ミクロンX 50ミクロンのグリッドを重ねて交差繊維で測定平方あたり繊維密度をカウントすることで、各カバースリップ上で最も高密度な成長の4つの異なる地域から200倍の倍率で4-5代表的な顕微鏡写真で測定される。神経突起伸長、ニューロンあたりの分岐数を意味し、平均枝長とperikaryonalサイズが神経突起および核周部（ 図1H）をマークすることによって、それぞれのカバーグラスからランダムに選択された30孤独な神経細胞から測定することができます。

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結果

形態的神経可塑性

新生ラット（P2-12）および播種密度の示された年齢の範囲では、MPとDRGニューロンは、既に48時間（ 図2A）の後に密な神経回路網を構築します。 PCaの、CPで培養ニューロン間の神経突起の密度、およびNP抽出物の比較は、NP抽出物中よりのPCa又はCP抽出物中のDRGニューロンの神経突起より大きな密度（ 図2A）5 を明らかにする。 MPのニューロンがより簡単にDRGニューロンよりも周囲のグリア細胞から解離する傾向があるので、我々は、特に、個々のニューロンの測定のためのMPニューロンを好む。ここでは、MPのPCaで栽培ニューロンまたはCP抽出物も長い神経突起を構築し、NP-エキス含有培地中で成長しているMPのニューロンよりも複雑な分岐パターンを示す（ 図2B）5。 NP、CP、およびPCAは抽出によって誘導された神経形態のこの差がないことは、Aの技術的な問題があることを示し...

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ディスカッション

この議定書は、最近、PCAとCP 5に神経可塑性のメカニズムを研究するために我々のグループが開発したin vitroでの膵神経可塑性アッセイの後ろに方法論を説明することを目的としています。プロトコルは、演奏者が、DRGとMPニューロンの単離および培養に十分な経験を得ていたら、容易に適用することができる3日間の手順を必要とする。さらに、膵臓微小環境の成分に腸およびDRG関連グリアの付随反応を研究するための貴重なツールを表します。

我々の意見では、このアッセイの最も興味深い特徴の一つは、in vitroで単純化設定でPCAおよびCP（ すなわち神経発芽および肥大）中に発生する変化を検出し、シミュレートする機能です。実際、W神経細胞形態の変化における組織抽出物または細胞上清の結果を適用するHICH系統的形態計測分析によって十分な感度で検出することができる。最近、我々はまた、このアッセイはまた、同時比較していくつかの癌のエンティティの神経電位の差を検出するのに...

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開示事項

著者らは、競合する利害や金銭的な開示がない。

謝辞

すべての著者は、提示アッセイの確立と検証に向けて、論文の草稿に貢献した。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩Sigma-AldrichP1149
オルニチン/ラミニンSigma-AldrichP2533/L4544
13 mm カバースリップメルク24ウェルプレート用
ディスメンブラネーター Sザルトリウス
抗β-III-チューブリン抗体ミリポアMAB16371:200 濃度
抗GFAP抗体DAKOM07611:400 濃度
RIPA 緩衝液 + プロテアーゼ阻害剤任意のサプライヤー
神経基礎培地Gibco/Life Sciences21103-049
B-27 サプリメントGibco/Life Sciences17504044B-27 の品質はロット番号に依存することが知られています
ゲンタマイシン/メトロニダゾール任意サプライヤー
Minimal essential mediumGibco/Life Sciences31095-029
Hank'Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco/Life Sciences24020133
4% Paraformaldehyde任意のサプライヤー
analySIS docu を含有すると、コラゲナーゼ活性が向上します。ソフトウェアOlympus
Ca/Mg Collagenase Type II Worthington Biochemical CLS-2 Trypsin-EDTA 0.25%Gibco/Life Sciences 25200056

参考文献

  1. Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
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