蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

サマリー

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。

要約

遺伝子の単一細胞codetectionは、そのRNA産物と細胞調節タンパク質は、遺伝子発現の調節を研究することが重要です。これはウイルス学の分野での課題であり、特に彼らの研究のための動物モデルを伴う核複製永続DNAウイルスのために。単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、末梢神経細胞における生涯潜伏感染を確立します。潜伏ウイルスは再活性化し、新たなヘルペスエピソードを誘導するから貯水池として機能する。 HSV-1の潜伏細胞生物は、動物モデルにおけるin situでの HSV-1ゲノムを検出するための方法の欠如のために部分的には、あまり理解のままである。我々のアプローチは、効率的に感染した動物モデルからの神経組織の切片内の低コピーのウイルスゲノムを検出するin situハイブリダイゼーション （FISH） における DNA-蛍光を記載している。この方法は、熱ベースの抗原アンマスキングに依存しており、直接標識自家製DNAプローブ、または市販のプローブ。我々は、トリプルスタイを開発寧のアプローチは、各染色の要件に対応するために、ペルオキシダーゼベースの信号増幅を用いて、RNA-FISH及び免疫蛍光で、DNA-FISHを組み合わせる。主な改善は、共焦点顕微鏡及び広視野落射蛍光によって、従来の高解像度で画像化することができる10μmの組織切片を、低バックグラウンド信号内に、取得する機能である。さらに、三重染色は、細胞およびウイルスタンパク質に対する抗体の広い範囲で働いていた。完全なプロトコルは、組織の中に抗体およびプローブの侵入に対応するために2.5日かかります。

概要

単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、複製し、普及するために定期的に再活性化する末梢神経系の三叉神経節（TG）のニューロンの長期潜伏感染を確立し、永続的なヒト神経向性ウイルスである。 HSV-1ゲノムは、宿主細胞ゲノム^1,2に統合しない限り多コピーchromatinizedプラスミドを、残っているホストニューロンの核内150キロバイトのdsDNAローカライズです。レイテンシーの間に、HSV-1複製サイクル遺伝的プログラムが強く抑制され、遺伝子発現は、待ち時間設立から再活性化³の開始に潜伏関連転写産物（LAT）遺伝子座に制限されている。 LATは、主要な2キロバイト安定したラリアットに加工ロング8.5キロバイト非コードRNA、およびいくつかのmiRNA ^4-7を生成^します。 HSV-1待ち時間は、このようにウイルスゲノムDNA、RNA LAT、および検出可能な複製サイクルタンパク質の非存在の存在によって特徴付けられる。

「ontent>動物モデル、主にマウスやウサギは、人間における待ち時間のいくつかの機能をrecapitulating実験モデルである。それらのモデルの主な利益の一つは、彼らが免疫担当宿主におけるHSV-1のレイテンシの生理的な側面を研究できることです。過去数十年にわたってこのような遺伝的に改変されたウイルスおよびマウスなどの多くの実験ツールは、動物組織から、生理学、遺伝学、およびHSV-1の潜伏の細胞生物学を研究するために開発されてきた。これまで、ウイルスゲノムDNAをサザンブロットによって検出および定量し、そして解離のTGからのqPCRはあるが、組織切片⁸上のin situハイブリダイゼーションにより、HSV-1ゲノムを検出するために利用可能な方法が現在のところ存在しないため、待ち時間は、日常的にではなく、in situハイブリダイゼーション RNAによるLAT RNAを検出することにより、組織切片上で評価されるウイルスゲノムの検出。それは、ウイルスゲノムの存在に基づいて感染細胞を特徴付けるためにTHIのは不可能であったのでの技術的な限界は、ウイルスゲノムおよび細胞およびウイルス遺伝子発現または宿主細胞性免疫応答^9,10との間の関係のような宿主-ウイルス相互作用の多くの局面の分析の主な欠点となっている。

最も重要なことは、潜伏感染の細胞間不均一性は、比較的未調査のままであり、マウスおよびSCIDマウスに移植したヒト^11-17感覚神経節ニューロンにおける待ち時間の重要な特徴であることが示されている。典型的には、細胞あたりのHSV-1ゲノムのコピー数が5から数百まで変化することをqPCRにより示された。 LATが遅延と再活性化の重要な調節因子として表示されますが、孤立したニューロンと、その場のPCR での定量PCRのデータは、潜在的に感染したニューロンのサブセットのみ、と低く、30％は、LAT遺伝子座^{11,12,18-21を}発現すること^を示した。どのように宿主細胞とウイルス潜伏の確立上の組織への影響内細胞環境とウイルス遺伝子発現は、不明なままである。ここでは、動物の神経組織切片内の低コピーHSV-1のゲノムDNAを効率的に検出する方法（FISH）in situハイブリダイゼーションロバストな蛍光を記載している。この方法は、宿主細胞の核内のコンポーネント²²とウイルスゲノムとの相互作用を検討する必要がある高解像度の顕微鏡イメージングへのアクセスを得るために私達によって設計され、使用されている。さらに、我々は、ウイルス遺伝子発現を調節するウイルス - 宿主相互作用を説明するためのユニークなツールであるRNAおよびタンパク質を有するウイルスDNAの同時検出のための複数の染色法を記載している。この方法はまた、多数のセクションに感染したニューロンを定量としてHSV-1潜伏ゲノムの検出を必要とする分析、広い範囲に適用することができる。重要なステップは、ハイブリダイゼーションのウイルスDNAにアクセスできるように、抗原回復処理を適用することです。このように、このプロトコルは、検出に効果的な場合があります現在、動物組織内で従来のDNA-FISHのアプローチでは検出できない、他の二本鎖DNAウイルスの。

プロトコル

この方法は、以前に発表された研究²²に用いた。 ISH、IFおよび魚を一般的な背景と従来の操作の説明については、以下の利用可能な文献^23をお勧めします。

1。動物の感染症

実験動物に関わるすべての手順は、ビジョンと眼科の研究のための協会の倫理的な問題のために、研究における動物の使用のために（ARVO）ステートメントを適合し、欧州共同体に従い、UPR-3296-CNRSの地域の倫理委員会によって承認された理事会指令86/609/EECで。すべての動物は食料と水への無制限のアクセスを受けた。

後述するHSV-1によるマウス感染の方法は、以前^に発表された研究^24-26で使用されている。

1. 出発前に準備するために以下の手段を準備します。
   
   HSV-1ウイルス原液
   麻酔ソリューション - ケタミンE-100 mg / kgのおよびキシラジン-10 mg / kgの
   
2. 0.1μL/秒を実現マイクロシリンジポンプ装置に接続された5μlのガラスマイクロシリンジへのウイルスの1μL（10 ⁶ PFU）を取る注意：赤色の油との間に制限を表示するには、フェノールレッドを含まない培地中のウイルスストックを再懸濁毛細管およびウイルス溶液中に存在し、ウイルス接種の部位で空気噴射を回避する。
3. その背面を上に（ケタミン100 mg / kgのおよびキシラジン-10 mg / kg）を、麻酔したマウスを置きます。
4. 双眼実体顕微鏡下に麻酔をかけたマウスの頭部を置き、皮膚粘膜国境で左上唇の上皮層に針を挿入します。 5秒ごとに0.5μLの速度で2段階（2回0.5μL）にウイルス液を注入する（注）。注射部位の吸収するウイルス懸濁液を可能にするために、2 0.5μLの注入の間に10秒のポーズを尊重。
5. マウスを置く覚醒するまで、37℃のインキュベーター。
6. 必要な時間のために回復する動物施設でマウスを残し注：マウスモデルでは、HSV-1は、接種部位でとを含むいくつかの神経組織内で10日未満持続する急性感染症と呼ばれる一次感染を誘発するTGは、接種部位に応じて、上頸神経節（SCG）、および後根神経節（DRG）。一次感染の兆候が徐々に消えて、レイテンシは、以降の感染後（DPI）完全に確立さ約28〜30日と考えられている。神経組織は、急性感染症の研究のための4解像度から、とレイテンシ研究のための28 dpiの、通常収穫することができる。

2。マウス灌流修正

1. 生理食塩水緩衝液の50ミリリットルを：開始する前に、以下の溶液を調製する
   
   1X PBSを60ミリリットル
   1×PBS中の新たに調製した4％パラホルムアルデヒド150mlの
   1×PBS中20％スクロース60mlの
   
2. 灌流チューブを準備します。蠕動ポンプに接続している毛細血管に針を接続します。
3. （SREP 1.2）上記のように、マウスを麻酔し、ピンと4足で取り付け解剖トレイに背の上に横たわっていた。
4. 使用してはさみ*喉まで腹から皮膚を切った。臓器を覆う薄い組織層を離れて引き裂く。胸骨の一方の側にリブを切断することにより胸郭を開きます。引きちぎることにより、皮膚を取り除きます。互いに離れる心を明らかに胸郭の左右部分を動かす注：潅流-固定が不可能になります根性、肺や大きな血管（頸動脈と頸静脈）を、切開しないように注意して下さい。
5. *左心室に針を挿入します。ハサミで右心房を切開。心臓を血管内に生理食塩水20ミリリットルを注入することにより放血を進める。トレイ内の血流をしてみましょう。 ありませんTE：この手順の間、心臓の他の側面を通って穴を開けないように注意してください。
6. 15分*中の1X PBS中4％PFA 150mlで灌流（注意：PFAは毒性があり、ヒュームフードの下で操作する）。 6分の間に1×PBS中の20％ショ糖を60mlを灌流。その段階でマウスのTG収穫の準備ができている（注）。10ミリリットル/分にポンプを設定します。良い灌流は、マウスの尾がアップする硬化するとき、顕著になり、その後再び低下持ち上げます。

3。 TGの収穫

1. 開始する前に、以下のソリューションを準備します。
   
   1×PBS中20％スクロース
   
2. 首の高さに頭をカットします。鼻キャビティを明らかにするためにちょうど切歯の後ろの鼻の先端をカットします。はさみで2に口蓋を切開し、口蓋の各側面を離れて移動注：TGSは右側にあり、長さ2〜3 mmで2白と横長の塊のように、ちょうど口蓋の下に表示され、左側と三叉神経に接続されています。
3. 脳幹からのTGを解放するためのTGの各側の三叉神経枝を切った。外科ペンチでのTGを取り外して、24時間注 20％ショ糖滅菌溶液に保管してください。を使用して、左から右のTGのための2つの異なる受信者は、左TG（感染）と右TG（ではないか、との間の混乱を避けるために、弱い）に感染した。埋め込む前24時間1X PBS中20％スクロース中のTGをインキュベートする。
4. -80℃で培地及び凍結を埋め込む凍結切片内の単一のブロックに埋め込むのTG
5. -80℃で保存ブロックの切片までです。

4。凍結切片の準備

1. に10μm切片としてのTGS縦にをカット-20℃の低温保持装置、および、わずかに加熱し（30℃）をSuperfrostスライドをそれらを配置します。 5〜10分間乾燥スライスは、次に使用するまで-80℃で凍結して保存しましょう（注）。4-5の項までPLAすることができます多数のセクションを同時に処理する場合、単一のスライド上のced。私たちは、次の手順に従います。連続切片をというようにA1、B1ラベルスライドの3シリーズの上に堆積し、C1、その後A2、B2、C2とされています。従って、各スライドシリーズ（A、B、およびC）が（ その場 PCR、LCM に、in situハイブリダイゼーション 、FISH に ）異なる染色のために処理することができ、異なる技術を用いて得られたデータは、同じ番号を搬送するスライド対応することを知って比較することができるTGの同じ領域に。

5。 HSV-1プローブ標識

プロトコルが成功したプローブの2種類で使用されているDNA FISHによるHSV-1ゲノムの検出のための、以下を記載している。最初は高倍率蛍光顕微鏡によって、個々の細胞内の核組織の細かい分析に適している自家製のCy3標識蛍光プローブである。二つ目は組み合わせることができ、市販のビオチン化プローブであり、明るいシグナルを提供するために、ペルオキシダーゼベースの信号増幅とD。後者は、全区間で低倍率でのニューロンを含有するウイルスの同定および定量のため、およびHSV-1ゲノムパターンの分析に適している。エンドユーザーは、自分の研究の目標は最高のフィットするアプローチ評価する必要があります。市販のプローブは、試薬の欄に記載されており、自家製のプローブの調製は、以下に説明する。

1. 開始する前に、次の解決策を準備します。
   
   HSV-1ゲノムを含むベクター（ステップ1を参照）
   70％エタノール、分子生物学グレード。
   
2. 準備HSV-1ゲノムの30キロバイト部分を含むコスミドは、（数14、28、そして大きなベクトル専用の精製カラムを用いて基準²⁰で説明した56のコスミド注：このような細菌人工染色体として、HSV-1ゲノムを、べき含むライブラリの他のタイプ限りプローブは、Alをカバーしていたように、同様に動作十分な信号^27〜29を生成するために、HSV-1ゲノムのARGE部分。我々の手では、コスミドベクター骨格から作られたプローブは、任意の信号を生成せず、陰性対照として使用した。このようにしてHSV-1配列を含む全コスミドベクターは、我々の研究で使用した。これは、HSV-1配列を切り出し、プローブを調製し、それを使用することも可能である。
3. ラベル製造業者のガイドラインに従って、ニックトランスレーションキットを使用したCy3-dCTPで各コスミド2μgの注：のみのCy3-dCTPおよび無標識されていないのdCTPを含む反応混合物とラベル付けを行います。
4. 10分間70℃で混合し、加熱中の0.5M EDTAの3μLを添加して反応を停止させます。氷上で冷却する。
5. G50ゲル排除ミニカラムにプローブを精製する。プローブにサケ精子DNA150μgのを追加し、エタノール沈殿によってプローブを沈殿させる。 DNAペレットは、Cy3の取り込みにピンクべきである。 70％エタノールでペレットを洗浄し、できるだけ多くのエタノールを除去ピペットを用いて可能な限り。ペレットを乾燥させないでください。
6. 脱イオン化ホルムアミド100μlでペレットを溶解する（注意：ホルムアミドは有毒であるヒュームフードの下で操作します。）。プローブ濃度を確実にこの時点で測定することができない。テキスト内述べたプローブの量は、プローブを作製するために使用される鋳型DNAの量を参照してください。 DNAテンプレートおよびホルムアミド100μlの2μgのを基準にしているプロトコルは、それが20 NG /μLであると考えられている。 -20℃で保存標識プローブは、大量に調製し、数ヶ月間、凍結保存することができる。

6。 DNA-FISH

図1は、DNA-FISHプロトコル、およびどのようにプロトコル7-9で説明したように、RNAとタンパク質を共に検出するために、複数の染色実験の一環として、DNA-FISHを実行する方法の主なステップの概要を示しています。

1. 開始する前に、次の解決策を準備します。
   
   1×PBS中0.5％トリトンX-100
   2×SSCおよび0.2×SSC緩衝液
   100mMのpH6.0のクエン酸緩衝液（10×ストック溶液）および10mMのpH6.0のクエン酸緩衝液（使用液）
   2×ハイブリダイゼーション緩衝液（プロトコル4を参照のこと）
   
2. 1日目に、室温でスライドホルダーにス​​ライドを置き、セクションでは、10分間乾燥させます。疎水性のペンでセクションをサークル。 10分間1X PBS中のセクションを再水和。組織を透過性にするために、1X PBS中0.5％トリトンX-100でのセクションを20分インキュベートする。洗浄3X 2X SSCで10分、マスク解除バッファが加熱されるまで2×SSCに留めておく（下記参照）。
3. アンマスキングのために、10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）200mlを充填したガラススライドトレイ（20スライド容量）を調製する。蒸留水500ミリリットルで満たされた大きな容器にトレーを置きます。この設定は、加熱パルスのより良好な制御を可能にする。トレイ内のスライドを配置する前に、府まで、電子レンジ内でバッファを予熱ffer（800 Wで8分程度）沸騰に達する。
4. 予熱したクエン酸緩衝液を含むトレイにスライドを置き、それらを完全にバッファに覆われていることを確認します。熱は、約20秒間緩衝液は沸騰に達するまで。注意、組織に損傷を与える可能性があり、これ沸騰の上のバッファをさせてはいけません。 2分間室温で冷却する。加熱サイクルの6X（7加熱サイクル合計）*を繰り返します。 2分を冷却し、5分間、2×SSC中でスライドを移す。
   *注：これは最も重要なステップの1つです。加熱サイクルの最適数および持続時間は経験的に決定されるべきであり、組織のタイプまたは使用されるプローブのタイプに変化し得る。電子レンジ、トレー、コンテナとコンテナ内のトレーや水中での緩衝液の体積は、アンマスキングの再現のために、同一に保つ必要があります。過度の煮沸は、組織の損失や損傷を受けた細胞につながる可能性があります。各加熱パルスの場合は、沸騰の様子を慎重に見て、加熱されているINGは沸騰の最初の兆候で停止する必要があります。一度設定し、非マスクは、堅牢で再現性のある表示されます。 図2（a）は 、HSV-1ゲノムがマスク解除の条件をさらに検討することが可能であることを示す、別のバッファでマスク解除によって検出できることを示している。クエン酸ベースの脱マスキングは一貫して、種々の実験室および動物モデルからの切片で、良好なFISHシグナル、および組織保存を提供することが見出された。
5. メタノール中でスライドをインキュベート：酢酸：PBSミックス（午前3時01分04秒）で15分間、次いで、メタノール中：酢酸混合物（3:1）で15分間（警告：酢酸は腐食性であるヒューム下で操作する。フードと適切な保護を使用します）。使用直前に、この溶液を調製する。
6. 70％の連続した​​10分間のインキュベーションを通る断面を脱水し、次いで、100％エタノール中で10分間の2倍。 10分間室温で乾燥させる。プロービングまでドライに保つ。
7. 以下のようにプロービング·ソリューションを準備し、事前に2XハイブリダイゼーションバッファーCoの20ミリリットルの在庫を準備20％硫酸デキストラン（MW50万）、2×デンハルト溶液、4×SSC *をntaining。 -20℃で、500マイクロチューブ内μL、店舗などの溶液を分取1スライド（X 50ミリメートル22ミリメートルのカバーガラス）の場合は、HSV-1のCy3標識プローブ（各コスミドプローブの30 NG）の90 ngのを混ぜて、ホルムアミドと40μlにボリュームを完了します。 2Xハイブリダイゼーション緩衝液40μlを加える。上下に数回ピペッティングしてよく混ぜます。
   *注：2×ハイブリダイゼーション緩衝液を調製するために、蒸留水10mlに50万MWデキストラン硫酸4gを混合する。これは、70℃で3〜4時間に応じて溶解粘性ミックスを作る溶解を助けるために、定期的に混ぜる。 20X SSC、100Xデンハルト溶液400μLの4ミリリットルを追加します。 20ミリリットルに完了し、ボルテックスを用いてよく混ぜる。
8. 乾燥したセクションで上に溶液をプローブ80μlのドロップします。 22ミリメートル×50ミリメートルカバーガラスで覆い、そしてプロービング·ソリューションが終わっ広がることを確認してくださいカバースリップの全面。注意：気泡があってはならない。気泡の存在は、ハイブリダイゼーション効率が低下する。ゴムセメントを使用したカバースリップをシールし、それが乾燥させます。スライド全体に最適なハイブリダイゼーションシグナルのために少なくとも2時間室温で暗所にスライドしておいてください。
   注：それは速乾性のゴムセメントは便利ですが、防水であり、ハイブリダイゼーション中の乾燥からサ ​​ンプルを保護します。これは、ハイブリダイゼーション後、カバースリップを除去するために剥がすことも容易である。マニキュアは、効率的な代替であるが、あまり便利なオプション。
9. 5分間80℃のスライドインキュベーターにスライドを配置することによって変性を進める。あるいは、金属トレイ上にスライドを配置し、（トレイ浮くはず）80℃の水浴中でトレイを置く。その後すぐに氷上に置いた金属トレイにスライドを移す。 5分間のままにしておきます。一晩ハイブリダイゼーションを37℃（スライドヒーターやインキュベーター）でスライドを転送します。
   注：私たちは、弱いか、無信号になり、より短いハイブリダイゼーションを、お勧めしません。
10. 37℃にて部を維持するためにヒータにスライドを維持しながら、2日目に、鉗子でゴムセメントを除去するメスの刃の先でやさしくカバーガラスを取り外します。
11. 5分間、5分間、37℃で0.2×SSCで3回、37℃で2×SSCで3回洗浄。 5分間、室温で2×SSCで1回洗浄し、DNA染色および取付を進め（以下プロトコル10を参照）。
    注意：この方法では、動原体と動原体周辺のシーケンス²²でパブリッシュとして、HSV-1に特異的なプローブと一緒にプロービング·ソリューションに対応するプローブを使用することにより、細胞のゲノム標的の検出を可能にする。

7。デュアルRNA-DNAのFISH

概要については、図1、緑色のボックスを参照してください。

複数の用RNA-FISH工程を含む手順を染色、それは一般的なターゲットはRNA分解酵素や化学薬品による分解に敏感であるように、第1のRNAの検出を行うことをお勧めします。さらに、DNA-FISH手順は、他の染色の効率を低下させる治療を含む。 RNA-FISHのために、我々は（ビオチン化プローブとペルオキシダーゼ（HRP）結合したストレプトアビジンを使用してチラミドシグナル増幅（TSA））酵素ベースの検出手法を選択しました。 TSAは、共有結合、ペルオキシダーゼ酵素反応によって組織にリンクされた蛍光チラミド基質（詳細については、試薬の表を参照）に基づいている。 RNA-FISHシグナルは、このように、DNA-FISH中に保存されている。

1. 開始する前に、次の解決策を準備します。
   
   ベクターLAT遺伝子座のインビトロ転写のための （pSLAT-2）
   2 mMのRVCを含む1X PBS
   2mMのRVCを含有する1×PBS中0.5％トリトンX-100
   蒸留水中の3％H ₂ 0 _2。
   70％、80％、95％エタノール、分子生物学グレード。
   4倍RNAハイブリダイゼーション溶液（プロトコル4を参照のこと）
   
2. 少なくとも1日のRNA-FISH実験の前に、RNA FISHプローブを準備します。先に参照²⁶で説明したように、HSV-1潜伏関連トランスクリプト（LAT）を検出pSLAT-2ベクター^30、またはLAT遺伝子座のインビトロ転写のための別のベクトルから、ビオチン化リボプローブを作製した。簡単に言うと：HindIIIでpSLAT-210μgのを線形とDNA精製キットで消化したベクターを浄化。 *ビオチン-16-UTPの存在下で、T7 in vitro転写キットを用いて消化pSLAT-2の2μgのからの一本鎖リボプローブを合成。 RNAミニカラムプローブを精製し、分光光度計を用いて260nmで定量する。凍結融解サイクルを避けるために、少量ずつ、-80℃でDNアーゼ/​​ RNアーゼを含まない水や店舗で50 NG /μLでプローブを希釈します。
   注*：ビオチン-16-UTP：UTP比は経験的に決定されなければならない。我Found 40:60比率は、効率的にRNA-FISHによりLAT検出プローブを提供する。
3. 1日目に、室温でスライドホルダーにス​​ライドを置き、セクションでは、10分間乾燥させます。疎水性のペンでセクションをサークル。複雑な2 mMのリボヌクレオシドバナ（RVC）を含む1×PBS中のセクションでは、10分間*水分補給。組織を透過性にするために2 mMのRVCを含む1×PBS中0.5％トリトンX-100で20分間のセクションをインキュベートします。 1X PBS、2 mMのRVCで3回、10分間洗浄します。 、内在性ペルオキシダーゼ活性をクエンチ2×10分間、3％H ₂ O ₂の断面インキュベートし、次いで1×PBS、2mMのRVCで1回洗浄する。
   *注：RNA-FISH手順では、（RVC）リボヌクレオシドバナジル錯体を、RNAの分解を防ぐために緩衝液および溶液に添加する。
4. 70％エタノールで2倍、10分インキュベートします。この段階では、セクションは、数週間、-20℃で70％エタノール中で保存することができる。 80％、95％、および100％エタでのインキュベーションによって切片を脱水サノール、5分ごと。少なくとも10分間のセクションを乾燥してみましょう。
   注：いくつかの場合において、エタノール処理は、他の標的の検出のために有害であることができる。 50％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーション工程を用いて、代替プロトコル - 2×SSCは、（三重染色プロトコルの詳細については9以下を参照）を使用することができる。しかし、エタノール処理は、RNA-FISHのための最も汎用的なアプローチであり、最も低いバックグラウンドを提供しています。
5. 以下のようにプロービング·ソリューションを準備し、事前に8倍のSSC、20Xデンハルト溶液、4のEDTA、40％デキストラン*を含む4倍のRNAのハイブリダイゼーション溶液10ミリリットルの在庫を準備します。 -20℃で、500マイクロチューブ内μL、店舗などの溶液を分取1スライドの20、ビオチン化LATリボプローブのNG、酵母tRNAの40 NG、2 mMのRVC、水で20μLに完全に混合することにより、溶液の80μlの（X 50ミリメートル22ミリメートルのカバーガラス）を準備します。 4X RNAハイブリダイゼーション溶液20μlを追加し、40μLホルムアミド（50％最終濃度）。簡単にピペッティングして混合するためには、75℃で4倍のRNAハイブリダイゼーション溶液を予熱しすることをお勧めします上下に数回ピペッティングしてよく混ぜます。
   *注：4倍RNAハイブリダイゼーション溶液を調製するために、蒸留水3 mlの20×SSC 4mlの硫酸デキストラン（MW50万）4gを混合する。これは、70℃で3〜4時間と溶解する粘性のミックスを作る溶解するために助けるために、定期的に混ぜる。 100Xデンハート溶液2mlを追加し、0.5 M EDTA溶液80μL。水10ミリリットルに完了し、ボルテックスを用いてよく混ぜる。注意：本アーゼ/ DNアーゼフリーの製品を使用しています。
6. 75℃でプローブ10分を変性一方、65℃に設定したスライドインキュベーターにスライドを置くのセクションにプローブ溶液80μLをドロップして、すぐにドロップにカバースリップを配置。注意：気泡があってはならない。気泡の存在は、ハイブリダイゼーションを減少EFFiciency。インキュベーションは、カバースリップが密封されていないので、加湿チャンバー内で行われなければならない。 （材料表を参照）水を保持するか、密閉された箱の中に加湿チャンバーを用意し、65℃のハイブリダイゼーションオーブンでそれを置くことができますスライドインキュベーターのいずれかを使用しています。
7. 65℃で一晩インキュベート注：LAT RNA-FISHを、37℃で観察されたプローブの非特異的結合を防ぐために65℃で行われる。他の多くのRNA-FISHプローブを37℃で良好なシグナルを生じるはずである
8. 2日目に、洗濯を開始する前に、TSA検出キットの製造業者の指示に従って検出試薬を準備します。検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合したストレプトアビジンと緑色または青色蛍光基質を含む、商業TSA検出キットを用いて行われる。
9. 65℃でスライドヒーター上のスライドを保つ慎重にカバースリップを削除して、すぐに2×SSC、50％ホルムアミドの1ミリリットルを加え、温めておいトン、65℃注意は、セクションを乾燥させてください。 65℃で2×SSC、50％ホルムアミド中65℃で2回10分を洗浄し、2×SSC中で2X 10分2×SSCで一回以上の洗浄および37℃のスライドヒーター上にスライドを配置。
10. TSA検出キットメーカーの指示に従って、検出ステップに進みます。 HRP-ストレプトアビジンの濃度は、蛍光基質の濃度および反応時間は、経験的に決定されなければならない*。 1/500に希釈したHRP-ストレプトアビジン、青色蛍光と緑色蛍光のために1/500のための1/100での蛍光試薬、および10分の反応時間：LAT RNA検出のために、我々は日常的に、以下の条件を使用した。信号はすぐに、DNA-FISHに進む前に、マウントせずに、倒立蛍光顕微鏡で確認することができます。
    *注：増幅プロトコルは、実験の主な目的に応じて設計されます。例えば、微細に標的RNAをローカライズし、それが広告である短い反応時間を使用する教師あり。対照的に、迅速に識別し、低倍率での陽性細胞をカウントするために、反応時間は、明信号を生成するように増加させることができる。
11. DNA-FISHについては、アンマスキングステップ（ステップ6.2）から開始し、上に示した手順に従ってください。

8。免疫のDNA FISH

概要については、紫色の箱を、 図1を参照してください。

同様に、RNA-DNA-FISHには、DNA-FISHは、タンパク質を変性させ、その抗体による検出を防止する可能性があるので、最初の免疫蛍光を実行するように助言される。免疫蛍光信号の品質は、抗体の特性に大きく依存し、いくつかの抗体は、可能な限りテストされるべきである。エピトープの脱マスキングは、タンパク質の検出およびDNA-FISHの両方を改善するために免疫蛍光前に一度実行される。 DNA-FISH手順の間に、試料上の免疫蛍光信号を保持するためには、COVすることが必要であるalently組織にリンクします。ここでは私たちの手の中に良い結果を与え二つのアプローチは、抗体後固定し、チラベースの検出（ステップ8.5を参照）を提示する。選択は、各ターゲット/抗体ペアのための予備試験で駆動する必要があります。

1. 開始する前に、次の解決策を準備します。
   
   1×PBS、3％正常ヤギ血清（NGS）を含有する。
   1×PBS中の2％PFA（4％ストック溶液から希釈）
   
2. 1日目に、最初のステップは、アンマスキング段階（6.1から6.2ステップ）まで、DNA-FISHと同じです。
3. マスクを解除した後、1×PBSで1時間、3％NGSを含有するセクションをインキュベートする。
4. 24時間、3％NGSを含有する1×PBSで希釈した一次抗体と共にインキュベートする。我々は一晩のインキュベーションは、通常、強いシグナルを生じることがわかっているが、下部インキュベーション時間は、プロトコルを短縮するために使用することができる。インキュベーションの48〜72時間までのようなIgMなどの低親和性の一次抗体のために必要になることがあります。
5. 当日に2、1×PBSで3回、10分間洗浄します。
6. 抗体後固定したプロトコル ：3％NGSを含む1×PBS中に1/200で、緑色蛍光色素と結合した二次抗体で1時間インキュベートする。 1X PBSで3回、10分間洗浄します。定着後、10分間*のための1×PBS中で2％PFAを用いて行われる。 1X PBSで3回、10分間洗浄します。
   TSA検出したプロトコル ：3％NGSを含む1×PBS中に1/250で、HRP結合二次抗体で1時間インキュベートする。 1X PBSで3回、10分間洗浄します。製造者の指示に従って、チラ検出を進める。 （ステップ7.9）、試薬希釈および反応時間は上に示したように、経験的に決定されなければならない。ほとんどの場合、我々のプロトコルは、蛍光基質の1/500希釈し、10分の反応時間に基づいている。 1X PBSで3回、10分間洗浄します。
   *注：ポスト固定は免疫魚の重要なステップであり、慎重なセットアップを必要とします。後固定強いより良好なIF信号及び低級DNA-FISH効率。
7. メタノール - 酢酸工程（ステップ6.3）からのDNA-FISHを進める。免疫DNA-FISHの期間は、一晩インキュベートし、一次抗体で、通常は3日間です。

9。免疫と相まって、二重のDNA-RNAのFISH

概要については、図1、オレンジ色のボックスを参照してください。

RNA-FISHは、第行わ免疫蛍光が続き、最後にDNA-FISHれる。免疫蛍光はチラ反応によって検出された場合、H ₂ O ₂とのRNA-FISH工程から完全にHRP活性をクエンチし、その消光が効率的であることを確認するためのキーである。これは、「一次抗体なし」対照としてつのスライドを使用して行われる。

エタノールベースの​​脱水には、いくつかの溶剤に敏感なタンパク質のために有害であるため、RNA-FISHのこのステップは、免疫蛍光を阻害することができる。もしそうであれば、RNA-FISHは、Wに行うことができますSTPE 9.3に下記のとおり、代替プロトコル、i番目。

1. 開始する前に、以下のソリューションを準備します。
   
   2 mMのRVCを含む1×PBS中50％ホルムアミド
   
2. 1日目に、RNA-FISHプローブを用意し、H ₂ O ₂急冷工程（ステップ7.2）まで、デュアルRNA-FISHのための手順。
3. ケース1は 、免疫蛍光染色は、エタノール脱水後に動作します。手順7.3から7.9に上記のように、RNA-FISHを進める。その後、下記の9.6に進みます。
4. ケース2は 、免疫蛍光染色は、エタノール処理によって防止される：65°Cに設定し、スライドヒーターに加湿チャンバー内でスライドを置き、50％ホルムアミド、1×PBS、および2mM RVCを含有するプレハイブリダイゼーション溶液中で1.5時間インキュベートする。プレハイブリダイゼーション溶液を排出し、ステップ7.4および7.5に示すようにハイブリダイゼーション溶液80μlのドロップします。 abovが示されているように、その後、RNA-FISHハイブリダイゼーションおよび検出を続行ステップ7.6から7.9（2日目および3）の電子。
5. RNA-FISHが完了した後2日目に、免疫のDNA魚がアンマスキングステップ（ステップ6.2参照）で始まるを進める。その後、ステップ8.2から8.6に上記のように免疫のDNA-FISHプロトコルに従う。

10。スライド取付け·イメージング

1. 開始する前に、以下のソリューションを準備します。
   
   1X PBS中0.5μg/ mlのでヘキスト33342
   
2. DAPIまたはヘキスト33342 * 10分間1X PBS中0.5μg/ mlの時で10分間染色核。 1X PBSで3回、10分間洗浄します。
   注*：。注意の検出システムの一つが蛍光青色色素を使用している場合は、DAPIやヘキストを使用しないでください。その代わりに、このようなTOPRO3など遠赤の波長範囲内の発光スペクトルと蛍光DNA染料を使用しています。
3. スライドからできるだけ多くの液体を排出します。スライドの一端の褪色防止剤を含む封入剤80μlのドロップします。高い光学品質を持つセクションをカバーカバーガラス（nは1.5ガラス°）。カバーガラスに気泡のないセクションの上に封入剤拡散をさせるために、ピンセットで1終了時にそれを維持することにより、ゆっくり行きましょう。
4. ダークスライドボックス中で4℃、マニキュアと店舗とのシール。
5. 潜伏HSV-1ゲノムのDNA FISH信号の直接観察は、40Xまたは高開口数（例えば40倍、NA 1.1、60X-63X NA 1.4、100X、NA 1.3）との励起光源と高倍率油浸対物レンズを必要とし、 100Wの水銀灯と同等以上。我々は（機器の表を参照）、このような過去5年間に製造業者によって提供されるような高効率の透過型顕微鏡を使用して助言する。共焦点顕微鏡は、薄い切片、あるいはスペクトル画像のような組織の自家蛍光による低いバックグラウンドで画像を収集するためのツールが用意されています。

結果

広範なテストの数ヶ月後、私たちは、熱系化学アンマスキングは蛍光in situハイブリダイゼーションのための潜伏HSV-1ゲノムが利用できるようにすることを発見した。プロセスの間に、我々は、様々なマスク解除手続きを試みたが、（ すなわち 、電子レンジでサブ沸騰温度までのセクションを加熱する）だけ熱ベースの治療法は、効率的に見えた。私たちは、その後、定期的に、0.01MのpH6.0のクエン酸緩衝液（我々はすべて我々の研究で使用されていること）、1×PBS、1mMのEDTA、0.1 Mを含むエピトープ^31,32を取得するために、免疫組織化学（IHC）および電子顕微鏡で使用されているいくつかの塩緩衝液をテストしたトリス-HCl pH7.4および蒸留水。 EDTAバッファが組織を損傷する傾向がありますが、他のすべてのバッファは、一部に表示されたニューロンの核内の単一または複数のスポットとして表示されたHSV-1の検出、（ 図2A、これらの組織は非常に自動蛍光性であることに注意してください、に適したサイトップでの均質な信号として画像LASM...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、マウス神経組織切片のニューロン内のHSV-1潜伏ゲノムの検出を可能にする。ウイルス遺伝子発現を調節する経路の我々の理解は、神経組織内でその場で HSV-1ゲノムDNAを検出する方法の欠如によって制限されてきた。感染した神経細胞のゲノムコピー数及び割合に関する情報は、解離したニューロン^11,12上のPCR分析から主になった。 HSV-1の待ち時間に役割を宿主細胞核構造の解明では、潜伏感染したマウスの神経細胞の核内のDNA-FISHにより潜伏HSV-1ゲノムの局在を決定するために設定してください。我々は、DNA-FISHプロトコルや組織の治療の様々なテストし、ウイルスDNA-FISH検出の重要なステップとして、熱ベースの「エピトープアンマスキング」を発見した。このような処理は日常的に、免疫組織化学のためにパラフィン包埋切片内タンパク質エピトープを明らかにするために使用される。それはほぼ普遍的に使用されていますが病理学においては、従来のDNA-FISHでは使用されません。多くの研究は、この技術は、光学顕微鏡のスケールでの組織の形態を保持することをサポートしていますが、エンドユ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Balb / cマウス	Janvier、フランス		週齢の女性
HSV-1株	SC16株(野生型)		Labetoule、M.らInvestを参照してください。眼科。Vis. Sci 44, 217–225 (2003) HSV-1株およびウイルスストック調製の詳細。
塩酸ケタミン	Σ	K2753	ケタミン (100mg/kg) とキシラジン (10mg/kg) を含む溶液の腹腔内注射塩
酸キシラジン	Σ	X1251
パラホルムアルデヒド (PFA)	Σ	158127	90 ml の水に PFA 4 g を懸濁します。50 µ1N NaOHのl、および60°Cで加熱。攪拌しながら水浴中のC。PFAは約30分で溶解します。10x PBSを10ml加えます。この溶液は事前に調製し、-20°Cで保存することができます。5mlチューブのC。注意。ヒュームフードの下で操作します。
生理食塩水	シグマ	07982-100TAB-F
1x PBS、pH 7.4 (無菌)	Life Technologies	10010-015
スクロース	シグマ	84100	1x PBSに20%スクロース溶液を調製します。
クライオセクショニング包埋培地 - Tissue-Tek OCT Compound	SAKURA	4583
大型ベクターDNA精製キット	Qiagen	12462	HSV-1ゲノムを含むCosmidまたはBACベクターを精製し、-20°Cで保存します。C
Nick 翻訳キット	Roche Applied Sciences	10 976 776 001
Cy3-dCTP	GEヘルスケア	PA53021
0.5 M EDTA	Sigma	E6758
G50ミニスピンカラム	GEヘルスケア	27-5330-01
サケ精子DNA 10 mg/ml	Invitrogen Life Technologies	15632-011
エタノール分子生物学グレード	シグマ
Formamid 分子生物学グレード	シグマ	F9037	注意。ヒュームフードの下で操作します。
HSV-1ビオチン化商用プローブ	エンツォライフサイエンス	ENZ-40838
ImmEdge疎水性ペン	Vector Laboratories	H-4000
20x 生理食塩水 クエン酸ナトリウム (SSC)	Sigma	S6639	ddH20 で 2x SSC 溶液を調製します。
Triton X-100	Sigma	T8787	10%原液を水に溶かし、+4°Cで保存します。使用直前に1x PBSに0.5%溶液を調製してください。
10 mM クエン酸ナトリウム pH 6.0	Sigma	S1804	100 mM ストック溶液 (10x) を調製します。10.5 gのクエン酸(MW 210.14)を秤量します。注意、刺激性および有毒、適切なマスクと手袋を着用してください)、400mlの水に溶解します。1 N NaOHでpHを6.0に調整します(注意、刺激性、手袋を着用してください)。蒸留水で500mlに調整します。使用前に蒸留水で10倍に希釈してください。
酢酸	シグマ	320099
メタノール、分子生物学グレード	Sigma	322415
デキストラン硫酸塩 - MW 500,000	Euromedex	EU0606-A
デンハルトの解法(100x)	Euromedex	1020-A
ゴムセメント「フィクソガム」	マラバット	290110000
DNA精製キット  - Qiaquick PCR精製キット	Qiagen	28104
T7 in vitro転写キット	Ambion Life Technologies	AM1314
ビオチン-16-UTP	ロシュ・アプライド・サイエンス	11388908910
RNA精製ミニカラム	Qiagen	73404
リボヌクレオシドバナジルコンプレックス	ニューイングランドバイオラボ	S1402S
H2O2	Sigma	H3410	蒸留水に3%溶液を調製します。+4 °Cと光から保護します。
酵母tRNA	Invitrogen	15401011	RNAseフリー水に10 mg/ml溶液を調製
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000
一次抗体	任意のサプライヤー		結果セクションでは、以下の一次抗体を使用しました: 抗マウス CENP-A (ウサギ mAb C51A7、細胞シグナル伝達技術)、および抗 ATRX H-300 (Santa Cruz バイオテクノロジー)
二次蛍光抗体	Invitrogen Life Technologies		私たちのプロトコルで日常的に使用されている蛍光二次抗体は、Alexa Fluor 標識ヤギ抗体 (IgG H+L) です。結果セクションで使用した抗体は、Alexa Fluor 488 (参照 A11001) でラボル処理した抗ウサギヤギ抗体です。
チラミドシグナル増幅 (TSA) キット - ストレプトアビジン + Alexa Fluor 350 (青色蛍光)	Invitrogen Life Technologies	#T20937	TSA キットは、Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen Life Technologies	H3570	0.5 & micro;使用直前に1x PBS中のg / ml溶液。残りの解決策を破棄します。
22 mm x 50 mm カバースリップ。1.5ガラス	電子顕微鏡科学	72204-04
退色防止剤を含む封入剤 - VECASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	もう一つの従来製品は、Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides	FisherScientific	12-550-15
機器/材料	会社	リファレンス	ノート
感染			ガラスマイクロピペット ホットドロー。カスタムメイド。
解剖機器	モリア、フランス		顕微手術用ハサミと鉗子
蠕動ポンプ	コール・パーマー・インスツルメンツ		Easyload Masterflex
マイクロシリンジポンプ装置 (ナノポンプ)	kdScientific	KDS310
クライオスタット	ライカフランス	CM 1510-1
-80度;C冷凍庫	Sanyo		Ultra Low -80 °C
国産電子レンジ
ドライブロックヒーター	Eppendorf	022670204
インキュベータースライドモート	Boekel Scientific	240000
コプリンジャー	ドミニクダッ	チャー68512
ステンドグラス容器	Dominique Dutscher	68506
蛍光顕微鏡	ツァイス		結果セクションで紹介されている画像は、対物レンズ 40X LD NeoFluor N.A 0.6 と 100X PlanApochromat N.A 1.3 を搭載した Zeiss AxioObserver で収集されました。フィルター セット #38、#43、および #43。HXP 120蛍光光源。フォトメトリクスCoolSNAP HQ2 CCDカメラ。信号は、Zeiss AxioImager/AxioObserverシリーズ、Nikon Ti-E/Ni-Eシリーズ、Leica DM/DMI6000シリーズなどの最近の高効率顕微鏡でより簡単に観察できます