デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

サマリー

ここでは、2色STEDナノスによってガラス上で要約NK細胞の細胞傷害性免疫シナプスを撮像するためのプロトコルを示す。この方法を用いて、我々は、サブ100nmシナプスタンパク質の分解能と細胞骨格を得た。

要約

ナチュラルキラー細胞は、ウイルス感染や腫瘍形成性細胞を溶解するために厳密に調節、細かく調整された免疫学的シナプス（IS）を形成する。動的なアクチンの再編成がNK細胞の機能と、ISの形成に重要である。シナプスにおけるF-アクチンのイメージングは​​、伝統しかしながら、光の回折限界は、約200nmで、共焦点含む、蛍光顕微鏡の解像度を制限する、共焦点顕微鏡を利用している。イメージング技術の最近の進歩により、subdiffraction限定された超解像イメージングの開発を可能にした。 ISにおけるF-アクチンのアーキテクチャを可視化するために、我々は、ガラス上の受容体を活性化するNK細胞を接着することによってNK細胞の細胞傷害性シナプスを再現。私たちは、2つの色の誘導放出の枯渇顕微鏡（STED）を使用して、関心のある画像タンパク質。これは、シナプスで<80 nmの分解能をもたらす。本明細書で我々は、試料調製及びデュアル欄を使用して画像の取得の手順を説明しまたはNKのF-アクチンを可視化するSTEDナノスです。また、ライカSP8ソフトウェア、タイム·ゲートSTEDを使用してサンプル取得の最適化を示している。最後に、我々は、画像の後処理用のホイヘンスデコンボリューションソフトウェアを利用する。

概要

免疫学的シナプスは、タンパク質と細胞骨格要素シグナリングの複雑な環境である。細胞溶解性シナプスは、もともと中央分泌ドメイン^1-4を取り巻くアクチンとの接着分子の環を有する構造のような「ブルズアイ」を有すると記述されていた。しかし、我々は今、関数^5月11日のための継続的な動的な細胞骨格の再編成を必要とするアクティブなシグナリングの微視的なドメインで構成されていることを知っている。シナプスについて私たちが今持っている情報の多くは、顕微鏡観察に由来しており、免疫学者は、最先端のイメージング技術の早期導入している。

一、このような新規技術が超解像顕微鏡法である。従来の光学顕微鏡は、空間的に約200 nmで、共焦点含め、すべての蛍光顕微鏡の解像度の下限値を設定すると、光の回折限界によって制限される。近年、いくつかの技術が発達されている回折障壁以下の解像度を可能にするD。これらは、刺激放出の枯渇顕微鏡（STED）、構造化照明顕微鏡（SIM）、確率的に解決顕微鏡（STORM）、及び光活性化光顕微鏡（PALM）が挙げられる。これらの技術は、他の場所で詳細に^{12から15日}されているが、以下のとおりです。 Subdiffraction限られた解像度は、各システム内でユニークな方法で生成されます。超解像技術の選択は、従って、関心対象の実験と実験系によって決定されるべきである。

STED超解像度が制限されたsubdiffraction蛍光顕微鏡^16-18その結果、励起後の関心のある各フルオロフォアの周りに選択的に「沈黙」蛍光、高輝度トロイダル枯渇ビームを用いて達成される。 STEDの一つの利点は、画像取得が迅速であり、比較的少ない事後処理を必要とすることである。染料の選択は、仕様で規定されている間市販されているシステムでは592 nmで位置して枯渇ビームの最大スペクトル位置は、いくつかの市販の染料は2蛍光体の組み合わせを可能にすることが可能です。また、このようなGFPのような一般的に使用される蛍光レポーターは^19,20生細胞の実験を可能にし、画像化することができる。

我々は以前に、脱顆粒^21,22のためのNK細胞によって利用されるF-アクチンhypodensityの領域を同定し、定量化するSTEDを使用している。私たちは、STEDがフルオロフォアの比較的柔軟な可用性とXY軸の分解能に優れた改善のために免疫シナプスを画像化するための良い選択であることを提案する。また、これらの実験のために利用市販のSTEDシステムでは、高速（12,000 Hz）の共鳴スキャナの使用は、サンプルへの最小の損傷を有する画像の迅速な獲得を可能にする。染料の選択の限られた柔軟性は、STED ¹²の欠点と考えられているしかしデュアルカラーSTEDは、いくつかの市販の蛍光プローブは比較的簡単です。 STED 2つのチャネルに制限されている間、追加の構造は、約200nm（E.メイス、未発表の観察の分解能で共焦点で撮像することができるので、レーザ走査共焦点顕微鏡とSTEDの統合はまた、STEDと組み合わせて、付加的な共焦点イメージングを可能にする）。我々は、免疫細胞を画像化するためのSTEDの使用を記載しているが、この技術は、神経細胞を含む、種々の細胞型に適用され、セル構造^23-26の様々な可視化する。

SIMはsubdiffraction制限画像を生成するために異なるアプローチを使用しています。既知の周期的な励起パターンを可視化することによって、情報は、数学的変換²⁷以下研究されて未知の構造についての情報を得ることができる。これは、横方向に^28,29〜100 nmの分解能の増加をもたらす。 SIMの利点は、それは私sのすべての標準的な共焦点染料およびプローブと互換性が、しかしながら欠点は、画像を取得することが非常に遅いと、これらは長い後処理^12を必要とすることである。これも、生細胞イメージングのためのその使用を制限する。

最後に、超解像は、フルオロフォアの確率論的な光スイッチングによって生成することができる。このアプローチは、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）と確率的光学再構築顕微鏡（STORM）で利用されている。複数のカメラのフレームを走査し、経時的におよび「オフ」「オン」にされ、ランダムに活性化された分子を局在化することにより、20〜30 nmの解像度を有する画像が蓄積されたフレーム^30-32から生成される。この解決のためのトレードオフは、画像を取得するのに必要な時間である。

ここでは、詳細には、STEDデュアルカラーサンプルを調製し、画像化するためのプロトコルを示す。このシステムでは、励起は、パルス、調整可能な白色光レーザである。性質上パルス状の励起ビームを、検出の時間ゲーティングは可能であり、さらに増加する分解能行われる。加えて、システムは、このように低いレーザーパワー要件を可能にする、ガドリニウムハイブリッド従来の光電子増倍管よりも敏感である（HYD）検出器を備えている。 STED用枯渇ビームが連続的に印加されると2つの色STEDに利用可能な染料の選択を決定することになる592 nmのに同調される。一般的に使用される染料の組み合わせは、一般に、（このようなアレクサフルーア488、オレゴングリーン、緑DyLights、またはChromeoの488など）を488nmによって励起1と（例えば太平洋オレンジやホライゾンV500など）458ナノメートルによって励起1が含まれています。つの色素の検出が同様の範囲であろう（そして、両方が空乏レーザによってアクセス可能である）ものの、その励起は、異なる波長で起こる。調整可能な白色光レーザーと波長可変検出器を、スペクトルの重複を排除し、信号を最大化することが非常に簡単になります。このように、我々は、コンビナートとの良好な成功を収めているこのような太平洋のオレンジと（ここで使用）のAlexa®488などの市販の染料のイオンが、。我々のプロトコルは、の方に合わせた、それは我々の研究室の歴史的な焦点を表わすようなヒトNK細胞の評価について述べるれている。それは我々が定期的に実験的な作品^21,33に適用されている1つである私たちは、特にこの例では、NK92細胞株を利用している。

プロトコル

1。抗体でコーティングしたカバー

1. 予熱し（37℃）RPMI 10％FCS培地30ml及びBDのCytofix / Cytopermを1ml。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の精製された抗体の5μg/ mlの溶液を調製する。 NK92細胞株の活性化のために、抗CD18および抗NKp30のの使用が推奨されます。
   1. PAPペンを使用して＃1.5カバースリップ上の条件ごとにマーク1の約ダイムサイズのサークル。無染色、染色し、デュアル、および2つのステンド条件：デュアルカラー実験のために、四つの条件があるはずです。各領域における抗体溶液200μlを分注し、37℃で30分間インキュベートする。
   2. 静かに、室温で50ミリリットルコニカルチューブにPBSを各1 50ミリリットルを浸漬することによってカバースリップを洗ってください。洗浄は、カバーガラス上の抗体の乾燥を避けるために注意すべきである前に、細胞やケアのほかにすぐに発生する必要があります。

2。表紙にNK細胞を活性化スリップ、修正して透過処理

1. 条件ごとに5×10 ⁵ NK92細胞を分離。遠心分離機とデカント上清。ステップ1.1から10ミリリットル予め温めメディアで1回洗浄する。遠心分離機とデカント上清。
   1. 2.5×10 ⁶ / mlの濃度でステップ1.1から温めておいた培地中の細胞を再懸濁。
   2. 優しく1.2.1項で作成した領域の中心に200μLをデカントします。 5％CO ₂で20分間37℃でインキュベートする。 （注：この時間は、関心対象の生物学的機能に応じて拡張または減少させることができるNK細胞の顆粒偏光の場合、20分で十分である。）。
2. 細胞のインキュベーション後、穏やかに50mlコニカルチューブ中で室温PBS 50ml中に浸漬することにより、各カバースリップを洗浄する。
3. 徹底的にステップ1.1と渦から温めておいたFIX /パーマ液1mlにトリトンX-100の1を添加する。細胞へのFIX /パーマ液（ステップ2.3）を200μlを加えることによって修正し、透過性に。 10メートルインキュベート室温で暗所での中。

3。染色細胞

1. バッファ染色調製：リン酸生理食塩水（PBS）、1％BSA、0.1％サポニン緩衝。
   1. 一次抗体の溶液を調製 200μL 染色緩衝液（ステップ3.1を参照）。 （注：抗体は、使用前に滴定されるべきである）。コー​​ティングするためにカバースリップ（ステップ1.2）を使用したのと同じ種で上昇する一次抗体の使用は避けてください。また、STEDイメージングにStrepatividin - ビオチン結合を避ける。
   2. セクション2.3.1に続いて、優しくバッファを染色50ミリリットル中にカバースリップを洗う。過剰の緩衝液を除去するために綿棒でPAPペン領域のエッジをDAB。セクション3.1.1で作成した抗体溶液を適用します。室温で暗所で30分間インキュベートする。 （推奨：湿度を維持するために、湿ったペーパータオルでスライドボックス内のカバースリップをインキュベート）。
2. 二次抗体の溶液を調製します 200μL 染色バッファ。推奨されるフルオロフォアは、アレクサフルーア488、パシフィックオレンジ、V500です。一般に、1:200希釈のSTEDイメージングに適している。
   1. 静かに50ミリリットルの染色バッファにカバースリップを洗う。過剰の緩衝液を除去するために綿棒でPAPペン領域のエッジをDAB。二次抗体溶液を適用する。室温で暗所で30分間インキュベートする。
3. その他の近隣のタンパク質について、洗浄および染色を繰り返します。ファロイジンでF-アクチンを検出する場合、これは一般に、1:200希釈で、二次抗体に含めることができる。

4。スライド上のマウントカバースリップ

1. 封入剤を準備します。注：延長または延長するゴールドが好ましい。それはSTEDと互換性がありませんようにVECTASHIELDは、避けなければならない。ファロイジンを使用する場合は、2,2 - thiodioethanolは避けなければならない。 MOWIOLは許容される。
2. スライド上のメディアを搭載する約10〜20μLを配置します。反転カバースリップ（セルサイドダウン）とに注意しながら、静かにカバースリップをマウント気泡の導入を避ける。画像化の前に（上カバースリップ）24時間スライドをインキュベートします。
3. マニキュアでカバースリップの端をシールします。

5。実験セットアップ

1. 必要なレーザーとソフトウェアを開始します。 100％パワーでSTED枯渇レーザーを開始する。商用システムの場合には、多くの場合、自動化された手順であるSTEDレーザーを合わせます。
2. 接眼レンズを用いた顕微鏡で、単一のステンド制御をはじめ、サンプルを集中する。

6。設定の最適化

1. 第一のチャネルをスキャンし、レーザパワー、励起ビーム位置及び検出レンジを最適化。可能な場合は、> 100の利得を避ける。設定を最適化するために、共焦点画像をキャプチャします。行及び/又はフレーム平均化は、解像度を増加させる。ピクセル飽和を確認してください。注：一部の飽和がSTEDのアプリケーションとして、共焦点に許容される発光の強度が低下します。 STEDのために、最適な画素サイズは30 nm以下のものになるかどうかこれまで良好な分解能は、より小さなピクセルサイズで得られる。撮像される関心領域のサイズは、ピクセルサイズの下限が決まる。小さいピクセルサイズは、光退色を増加させることができる。
   1. 50％の枯渇レーザパワーで始まる、STED枯渇ビームとキャプチャイメージを適用する。解像度の向上が見られる場合、より多くの空乏レーザパワーを適用することができる。この段階では、励起用レーザパワー、ライン平均値、および/またはゲインを調整することが必要であり得る。
   2. 背景（最小0.3ナノ秒）を低減するためにタイム·ゲーティングを適用します。共焦点上の解像度の向上が見られるまで、設定を調整します。分解能は、半値全幅（FWHM）を推定することによって近似することができる。これは、関心構造を横切ってラインプロファイルを描くことによって作成されたガウスピークの半最大強度での距離を表しており、解像度の推定に広く用いられる方法である。
   3. 最初のチャンネルが満足されると、SEの第二のシーケンスを開始シーケンシャルスキャン。一般的には、最初の長波長蛍光団をスキャンすることをお勧めします。第二のチャネル上でのステップ6.1を繰り返します。
2. 両方のスキャンシーケンスで、単一のステンドコントロールを撮像することによりスペクトルの重複がないことを確認してください。軽度のスペクトルの重なりは、可能な限り避けるべきであるが、ソフトウェアでのスペクトル非混合の機能を用いて補正することができる。

7。画像収集

1. 画像を取得する。定量的画像化のためには、少なくとも20枚/条件を得ることをお勧めします。正確な数は、しかしながら、そのようなサンプルサイズの計算などの統計的手法と合わせて実験的質問に応じて定義されるべきである。実験を保存します。

8。デコンボリューション

1. デコンボリューションソフトウェアまたはバッチプロセッサを搭載し、開いているファイル。ソフトウェアを使用して、各チャンネルのパラメータを確認してください。各チャネルの励起および発光スペクトル、STED枯渇放出、及び撮像方向を確認たTiON（アップまたはダウン、画像が3次元の場合）特に。
2. デコンボリューションウィザードを使用してデコンボリューション。デフォルト設定では、しかし、雑音比（SNTR）に信号が蛍光団からの蛍光団に変化し、各チャンネルごとに個別の実験のために決定される必要がある、一般的には十分である。

結果

明らかに、超解像イメージングの主な目的は、従来の共焦点顕微鏡に比べて改善されます。しかし、次善の解決につながる可能性があり、いくつかの一般的な落とし穴があります。これらは、それぞれの実験を個別に最適化されている必要があります。我々の代表的な実験では、ガラスに結合した抗体によって活性化NK細胞におけるF-アクチンネットワークを撮像している。以下のように共通の原因（との補正）、共焦点上のSTEDの改善された解像度の不足は、次のとおりです。

1. F-アクチンフィラメントの貧弱な解像度により示されるようにアンダーサンプリング（図1a）。これは、粒状性および画素情報の損失につながることができる。増加線やフレーム平均は、多くの場合、これを修正することができます。
2. 漂白および/ ​​またはオーバーサンプリング（図1b）、これは過度のライン平均化の結果として、長い画素滞留時間によって引き起こされ得る。あるいは、過剰使用を含む従来の取得、画像のオーバー走査の結果であってもよい空乏レーザー。これは、一般的にかすんまたはファジー画像が得られる。これは、取得する前に、最小限にしか関心のあるフィールドを走査するか、可能であれば、レーザスキャン速度を増加させることによって補正することができる。問題が解決しない場合は、空乏レーザーパワーを低減することができる。

正しいピクセル滞留時間のバランス、励起レーザパワー、及び空乏レーザパワー、解像度向上と十分な情報を有する画像を達成することにより（ 図1c）を生成することができる。解像度は、さらにデコンボリューション（ 図1d）を使用することによって改善することができる。取得が最適化されると、デコンボリューションは、定性的かつ定量的に解像度を改善し、サブ100nmの分解能は、日常的に達成可能である必要があります。

取得とSTEDイメージングの一般的な落とし穴の図1。 最適化。NK92細胞を、固定20分間抗CD18および-NKp30のコーティングされたガラス上で活性化透過処理し、ファロイジンアレクサフルーア488とF-アクチンを染色した。A）の例の原因アンダーサンプリング。B）により最適化された条件は、デコンボリューションと解像度で大きな改善につながる漂白/オーバーサンプリングC）の条件最適化されたd）の解像度の損失の例への画像情報の損失。スケールバー=5μmである。

ディスカッション

共焦点超える解像度の向上が制御できない要因に多少依存するであろう。これらの要因は、カバーガラスの厚さと封入剤に不整合の軽微な収差が含まれています。それは、可能な限り一貫として撮影室の温度と湿度を保つことが重要であり、STEDビームは約60分毎に再調整する必要があります。手順で説明したように、これはSTEDと互換性がありませんように、VECTASHIELD封入剤の使用は、避けなければならない。に加えて、1は常に＃1.5カバーガラスを使用する必要があり、利用可能な場合には、特定の厚さまで確認されているものを使用しています。

ここで説明するアプローチの一つの変更は、STEDビームよりも長い波長で発光する蛍光プローブを使用して、共焦点画像追加のチャネルです。このように、4つのチャンネル（共焦点における2、STED中2）までの1缶のイメージ。このアプローチを取っている場合は、しかし、フルオロフォアのチャネルは、ESTEDビームのアプリケーションはこれらのチャネルでの光子を枯渇されるように、STED欠乏レーザー上記mittingは、最初に画像化される必要があります。この技術の一つの利点はまた、短い寿命を有する光子³⁴からの発光を排除することによって、共焦点における分解能を向上させるであろう、時間ゲートの適用である。それに近い撮影する場合に特に、タイム·ゲーティング、パルス励起STEDに対応するように、発光検出器のタイミングを使用すると、反射オフカバーガラスガラスからバックグラウンド蛍光を減少します。でも、STEDには適していない実験では、パルス励起源を使用している場合、タイム·ゲーティングは、共焦点で解像度を改善するのに有用なツールとなります。

STEDの解像度を向上させるために利用され得る種々の変形がある。誰もこの、サンプル達する光量を減らすますが、standard 1エアリーユニットからピンホールサイズを小さくです。これは、スを増加させることによって補償することができるERパワーまたはゲイン。別の解像度を向上させる、各光子のために収集された情報の量を増加させるであろう、ライン平均を増加させることである。再度、しかしながら、これは試料の退色を犠牲にしてもよいので、バランスが解像度と漂白との間に打たれる必要がある。同様に、GFPなどの蛍光タンパク質の使用は、漂白を避けるために、慎重な最適化が必要になります。これにより、必要に応じてSTEDレーザパワーを減少させることによって達成することができる。長い時間点も大きな光子の回復を可能にし、漂白を減らすことができます。光退色の補正は、ライブSTEDを分析する際に考慮されるべきである。

もちろん、STEDにおける3次元の画像化も可能であり、また、従来の共焦点イメージングを超える改善を与える。ケアは、z軸に複数の平面を画像化中に生じるドリフトを補正するために取られるべきであるが、これは、それがデコンボリューションと組み合わせて行われる場合は特にそうである。もしホイヘンスソフトウェアを使用してデコンボリューションするには、この補正は、「画像を安定させる」機能を使用して得られる。このアプローチを使用して、z軸の分解能は向上する。これはまた、比較的乏しいz軸の解像度を有する乏しい距離分解能を有し、さらに上だけでそれ自体をSTED従来の共焦点イメージング、上大きな改善である。 STED内の複数のスタックを取得しながら、ケアは、試料の退色を避けるために注意する必要があり、必要に応じて、一方がそうするために、ライン平均又はレーザーパワー強度を低減することができる。ここでも、STEDには適していない他のフルオロフォアを撮像する場合には、第1の連続走査における空乏層ビームの適用はこれらのチャネルからの発光を妨げることに留意すべきである。したがって、（592 nmより長い波長で発光するチャンネル共焦点スキャンを使用して）混合STED /共焦点アプローチは、残念ながら、3Dには適していないでしょう。

要約すると、我々は、アプリの相対的な容易さのアプローチとしてSTEDを選んだ標準共焦点イメージング以上の解像度でのい致し改善。免疫シナプスを画像化するための、それは私たちが200nm以上の解像度では不可能で、F-アクチンのアーキテクチャの詳細を確認することができ、効果的かつ貴重な技術を証明しています。これらの詳細の多くは微妙なように見えるが、それらはNK細胞の機能に大きな影響を有することができる。したがって、我々は、ヒトの健康を維持するために重要である情報を導出し、最新のナノスコピックイメージング技術を適用している。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#1.5カバースリップ		VWR48393-172
BDサイトフィックス/サイトペルム	BDバイオサイエンス	554722
ウシ血清アルブミン	シグマ	A2153
コットンチップアプリケーター	フィッシャーサイエンティフィ	S450941
ファルコン遠心チューブ(50 ml)	VWR	352070
子牛胎児血清(FCS)(500 ml)	Atlantic Biologicals	S11050
ヤギ抗ウサギ Pacific Orange	Life Technologies	P31584
実験用組織ワイパー	VWR	82003-820
マニキュア	VWR	100491-940
NK-92 細胞	ATCC	CRL-2407
ファロイジン アレクサ フルーア 488	ライフ テクノロジー	ズ A12379
リン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジー	14190250
Prolong退色防止試薬	ライフテクノロジー	ズ P7481
精製抗CD18	バイオレジェンド	301202
精製抗NKp30	バイオレジェンド	325202
抗パーフォリン	レジェンド	308102
RPMI 1640培地 (500 ml)	Life Technologies	11875-093
Saponin from Quillaja bark	Sigma	S4521
Super PAP pen	Life Technologies	008899
Triton X-100	Electron Microscopy Sciences	22142
Huygens deconvolution software	SVI	お問い合わせ会社
ライカ SP8 TCS STED 顕微鏡	ライカMicrosystems	の連絡先会社