の解剖<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経堤のため<em&gt; in vitroで</em&gt;外植片培養又は<em&gt; in vivoで</em&gt;移植

サマリー

このプロトコルは、 アフリカツメガエルの neurulasからpremigratory頭蓋神経堤（NC）を分析する方法について説明します。これらの外植片をin vitroで培養フィブロネクチン上に播種、または宿主胚に戻って移植することができる。この技術は、NC上皮から間葉移行、遊走、および分化の機序を研究することができる。

要約

神経堤（NC）は、神経胚形成の最後に上皮への間充織転換（EMT）を受けて、過渡背側神経管の細胞集団である様々な臓器に向けて広範囲に移動し、誘導体（ニューロン、グリア、多くのタイプに分化する軟骨や骨、色素性および内分泌細胞）。このプロトコルでは、in vivoおよびin vitroでのNC開発を研究するために、 アフリカツメガエル胚からpremigratory頭蓋NCを分析する方法について説明します。カエルモデルは、初期の開発を研究する多くの利点を提供しています。豊富なバッチは、胚がin vivoでのゲインと機能戦略の損失は前供与体および/ ​​またはホスト胚におけるNC郭清に遺伝子発現の操作を可能にする、迅速な開発、提供しています。 NC植片は、フィブロネクチン上に播種し、インビトロ研究のために使用することができる。これらは、無血清培地中で定義された数日間培養することができる。また、背面のNC植片を移植する方法を説明します生体内でのNCの移行および分化を研究するためのホスト胚へ。

概要

神経冠（NC）は、脊椎動物胚における神経胚形成の終了時に神経管から出てくる一過性胚細胞集団である。 NCの仕様を制御するシグナル伝達および遺伝的事象は、早ければ原腸形成として開始します。ノースカロライナ州は、周囲の背側の組織からの信号によって、神経および非神経外胚葉の境界に指定されています。神経胚形成の終了時に、NC細胞が上皮から間葉転換（EMT）を受けると案内手がかりを囲むに応答することによってステレオタイプのルート以下の胚で広く移動する。彼らは彼らの最終的な宛先に到達した後、彼らは誘導体、 例えばニューロン 、グリア、骨、軟骨、および色素性細胞^1-5の広大な配列に分化する。多くの細胞種および胚組織への貢献のために、NC細胞開発のどの段階での欠陥は、誘導から最終分化、neurocristopathies ⁶という先天性の症候群を引き起こす可能性があります。 E様々な段階での開発のNCの新実験操作 - 仕様、EMT、移行、および分化は - neurocristopathiesの我々の理解を向上させ、潜在的な治療戦略の設計ができるようになります。

アフリカツメガエル胚は、NC開発を研究するための最適なモデルです。胚の多数を得るのは容易であり、体外受精は、開発の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にXを操作するために利用可能である胚発生ツメガエル 。機能獲得型と遺伝子ノックダウンは、初期の胞胚の個々のセルをマイクロインジェクションにより実行するのは簡単です。胚組織は、in vitro再アソシエーション^7-11またはバックグラフト^12,13のアッセイのために切断することができる。

このプロトコルでは、Xにpremigratory頭蓋NCを分析する方法を説明します移行前に、後半neurulas ツメガエル 。これらの外植片はフィブロネクチンジンジャーブレッドで培養することができるに移行し、分化を研究するDプレートは、in vitroの実験条件で制御。 NC外植片もまた、インビボでそれらの移動および分化を研究するために、通常の操作または宿主胚に移植することができる。

プロトコル

実験は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する国家および欧州の規制で、交換、削減、洗練された、国際的に確立された原則に準拠しています。

1。フィブロネクチンコートディッシュ¹⁴の調製

1. ピペット標準的なプラスチックシャーレ（φ40×11 mm）の中に1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈した10 mg / mlの培養グレードのフィブロネクチンを500ml。 1時間37℃でインキュベートする。注意：以降のイメージング用ガラス食器やガラス製カバースリップを使用している場合は、100 mg / mlのフィブロネクチン溶液を使用してください。
2. 1X PBSで3回洗浄します。
3. 1XのPBS/0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）の500ミリリットルを含むPBSを交換してください。 30分間37℃でインキュベートする。
4. 1X PBSで3回洗浄します。
5. 1X PBSでいっぱいにして（通常は24〜48時間の場合）使用するまで4℃で保管してください。

2。 NC植片の解剖

1. 調製3/4ノーマル両生類培地（NAM）（110ミリモルのNaCl、2mMのKClを、1のCa（NO _3）2、1のMgSO _4、0.1mMのEDTA、1mMのNaHCO ₃を、0.2×PBS、50 mg / mlのゲンタマイシン^10,15）。 4℃で保存、解剖のために1週間以上保管しないでください年配NAM（下記）は、アガロースでコーティングされた解剖皿を調製するために使用することができる。
2. 3月4日、NAMで2％アガロース10mlでコーティングされた解剖用の60ミリメートルペトリ皿を準備します。
3. 解剖ツールを収集します。プラスチック製パスツールピペットを、最高級の虫ピンがピンホルダー（参考資料の表を参照）、（ガラスパスツールピペット¹⁶の先端にパラフィンに埋め込 ​​まれた眉の毛で作られた）「眉ナイフ」、2罰金に搭載された解剖鉗子、P1000ピペットやヒント、50倍率8-40Xと両眼立体鏡、光ファイバガイドに明るい光源。すべて解剖のツールはきれいに保つ必要があり、各実験の後、蒸留水で二回一回のWiそれらをすすぐ100％エタノールをTH及び乾燥させてください。ほこりから保管してください。
4. ほぼトップに新鮮NAMと解剖皿に記入してください。
5. Xを得る標準的な手順¹⁰と、彼らは（Nieuwkoopとフェーバー発達表¹⁷による）神経胚ステージ16に到達するまで、それらを年齢に応じて胚ツメガエル 。
6. 16胚プラスチックパスツールピペットを用いて解剖皿にステージを配置します。
7. 双眼スコープの下にあるすべての後続のステップを実行します。鉗子の2ペアが卵黄膜を除去します。胚の背側の部分に損傷を与えないように注意してください。
8. 胚は解剖を開始するために、ステージ17に到達するまで待ちます。神経堤が明確に早い段階とは対照的に、神経管から離れて設定されているので、ステージ17が適当である。ステージ17の後、NCは移行して、周囲の間充織と混ざり始まる。
9. 維持するために、胚のためのニッチを作るためにピンセットでアガロースに小さな穴を掘る解剖の間にそれら。 1胚背側を上にして置きます。注：粘土の代わりにアガロース中に穴を掘った胚を維持するために使用することができる。
10. 眉ナイフや虫ピンと前方神経倍の側部に切開する。胚にあまりにも深く行かないように注意してください：2〜3細胞層を切断することを目指し（原腸と同じくらい深く到達することはありません！）。全体の解剖プロセスの間に、 解剖した組織は、X のため、 気液界面に接触して入力できるようにすることはありません ツメガエル胚組織は、表面張力によって溶解される。
11. 神経のより背部分の第2の平行の切開が同じ機器を使用して倍にする。
12. 必要に応じて、90°付近の皿を回す。最初の2切開の後側で、眉ナイフや虫ピンと第三の垂直切開する。 NCは横方向、外胚葉の着色された外側の層の下の細胞の厚い塊である神経管へ。
13. 第三の切開端から始めて、根底にあるノースカロライナ州からの着色された外胚葉層を分離するために眉ナイフの先端を使用してください。
14. 第三の切開から始まるのNC組織を分離するために眉ナイフの側面を使用してください。基礎となる頭部の中胚葉が白色ながらNC組織は、むしろ灰色である。慎重に中胚葉からNCを分離する。
15. 眼胞から前方のNC組織を切り離し、外植片を解放するために、このレベルで切断。最初の実験のための対照として、in situハイブリダイゼーションによって、いくつかの外植片にsnail2式 （正規のNCマーカー）をチェックすることをお勧めします。

3。フィブロネクチン上にプレート外植片

1. フィルインフィブロネクチンコートディッシュ修正Danilchickミディアム（MDM、NaClの53 mMの、のNa 2 CO ₃ 5mmのKグルコン酸4.5 mMの、ナトリウムグルコン酸32 mMの_硫酸マグネシウム1 mMの、 _塩化カルシウム1 mMの、BSA 0.1％、pHを調整1男ビシンと8.3に ^18）。
2. P1000ピペットを用いてフィブロネクチン被覆皿に外植片を移す。外植片を気液界​​面を接触させないでください。まず、一部の液体もう一度、外植して、先端にいくつかの液体をピペット。フィブロネクチン被覆皿に外植片を転送しながら、先端に空気を許可しないでください。先端がフィブロネクチンコートディッシュの液体の中にあると、外植片をゆっくりと重力で下に行かせ、または非常にゆっくりと押します。 速すぎて外植片を排出することは避けてください 。
3. 眉毛のナイフを使用して皿に10から30の外植片を配置します。皿の側面を避けるため、その後の画像化のために十分なされていない。
4. （それは約15〜30分かかります）外植片はフィブロネクチンに付着するまで、お皿を移動しないようにしてください。必要であれば、 非常に慎重に料理を移動します。
5. 冷蔵インキュベータ（温度グラフ15〜20℃の間で^、17を参照）の皿を置きます。 15℃で置かれたとき、細胞は、arはE通常は効率的に移行し、インキュベーションの6時間後に散乱（このタイミングは実験間で異なる場合があります）。

4。ホスト胚に外植片を移植

1. 粗鉗子を使用して非常に小さい部分に微細ガラスカバースリップをカット。作品の大きさは約1.5ミリメートル²でなければなりません。ピンセットを用いて3月4日、NAMまたはPBSを含むペトリ皿にピースを浸します。
2. 宿主胚の調製：卵黄膜を除去して、NCを解剖しながら、宿主胚を傷つけないよう、特に注意して）3で説明したように3月4日、NAMでホストのNCを解剖する。ドナー胚を解剖しながら、宿主胚が部分的に治癒させて：組織の緊張は、焼灼の大きさを増大させる傾向がある。
3. プロトコル3で説明したように、他のアガロースでコーティングされた皿の中で、同じ皿の別の部分では、ドナー胚からのNC植片を解剖する。で説明したように、注意してホストを含​​む皿にNC移植を転送プロトコル3。
4. すぐに鉗子を使用してホストアブレーション領域に、NCの外植片を置く。外植片を部分的に固定してください。所定の位置に移植片を維持するために移植された胚にカバーガラス片を入れてください。それの損傷を防ぐために、胚よりも大きなガラス片を選択します。胚は平らに少しになります。
5. 少なくとも15〜20分間待ってから、静かにカバーガラスを取り外します。胚はさらに10分間回復してみようと注意深くプラスチック製パスツールピペットを用いて、3/4 NAMが充填された清浄な皿にそれをピペット。

結果

フィブロネクチン上にプレーすると、神経堤の外植片が急速に（15〜30分）を取り付けて、外植片は2時間（ 図1A）内でフラットに広がる。 3-6時間の細胞が飛散し始めた後。 15℃で24時間で、多くの細胞が離れて外植片（ 図1Bおよび1C）からの移行を開始しました。卵黄は、位相コントラスト（ 図1B）の下で、細胞が非常に明るくなる。細胞の突起（filopodesとlamellipodes）は、アクチン細胞骨格（ 図1C）のファロイジン染色した後にはっきりと見える。

同所移植実験のために、ドナー胚を非標識宿主胚における移植された細胞を追跡するために、GFP mRNAを注入した。頭蓋のNCは、ホストの片側に切除された。30〜60分、手術後に移植片を切除されたホスト頭蓋NC（ 図1D、移植後2時間）に置き換え、治癒した。数時間後、GFP陽性細胞が移動した外植片から腹頭蓋顔面の位置（

ディスカッション

このプロトコルは、 アフリカツメガエル胚においてpremigratory頭蓋NCを植するための簡単な技術が記載されている。このような実験に使用した胚は、堅牢で、よく治癒する必要があります。不健康な胚のいずれかのバッチを廃棄します。また、後段ではなく、17で神経堤を切除するために、（12〜18〜20℃に）様々な温度で胚を成長する。ステージ17の後に、神経堤は頭部中胚葉と混合してもよいし、完全に除去することはできません。 アフリカツメガエルの組織が ​​迅速に治癒した後、他の組織への接着性を失う。これは、急速に働く時点ですぐにドナーから切除されるように宿主中に神経堤の外植片を配置することが重要です。

試験管内の実験で関わる、フィブロネクチン培養皿は、数日後に細菌または真菌で汚染され得ることができます。多くの場合、可能な限りの抗生物質とクリーンまたは無菌材料とソリューションを使用してください。

この手順は、Fに最適化されていまたは頭蓋神経堤。実際、この細胞集団...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血漿	シグマ	F4759-1MG
ウシ血清アルブミン、フラクションV	メデックス	04-100-811-C	品質グレードは、このアプリケーションに適しているかもしれません
ステンレス鋼昆虫ピン、サイズ000	FST	26001
モン#5鉗子0.05ミリメートル×0.02ミリメートル	FST	11252-20

ユーロからのフィブロネクチン低デュ