縦MRIが続く乳がんの脳転移のマウスモデルを開発するために、超音波画像誘導心臓内注射

サマリー

乳癌脳転移マウスモデルをMDA-MB231/Br-GFP細胞の超音波画像誘導の心臓内注射で確立される。多焦点頭蓋内転移の発生は、高解像度の9.4 T MRIを用いて長手方向にモニタされた。

要約

乳癌脳転移は、ステージIVで乳癌患者の30％で生じる、高い死亡率と関連している。生存期間の中央値は6ヶ月です。それは、臨床シナリオにおける転移細胞の広がり血行動態を模倣するために適切な動物モデルを有することが重要である。ここでは、無胸腺ヌードマウスの左心室に脳熱帯乳癌細胞の正確な注入を案内する小動物超音波イメージングの使用を導入している。縦方向のMRIは、脳転移の頭蓋内の開始と成長性を評価するために使用されます。超音波ガイド下心臓内注入は、正確な注入とここに高い成功率だけでなく、確実にだけでなく、大幅に我々の以前の手作業に比べて、死亡率を減少させた。 インビボ高解像度MRIは310程度と小さいように、高信号多発性病変の可視化を可能にする3週間のT ₂強調画像上の直径で注射後。 FollowはアップMRIは頭蓋内腫瘍の増殖および脳全体にわたって分配する転移の数の増加を明らかにする。

概要

脳転移は、成人において最も一般的な頭蓋内悪性腫瘍である。予後はさらに積極的な治療と4〜6ヶ月の生存期間の中央値で、非常に悪い。乳がんは脳転移^1〜3の高い罹患率との三大原発性癌の一つです。いくつかの脳指向性乳癌株は、心臓内又は頚動脈内注射後⁴脳転移を発症することが可能である。左心室への腫瘍細胞の直接注入は、肺毛細血管床を迂回し、従って、内臓転移を最小限に抑えながら、脳転移の形成の発生率を増加させることができる。 MDA-MB231Brラインは、げっ歯類モデル^5,6の脳転移を開発するために最も広く使用されているヒト乳癌株の一つである。

他の多くの研究^4,7と同様に、我々は我々の以前の研究で、心臓内注射の手動手順を実行した。しかしながら、50％しか成功率は、手動で得られた前臨床試験が失敗した場合、注入し、マウスの割合を繰り返し侵襲的処置で死亡した。ここでは、無胸腺マウスの左心室に脳探索乳癌細胞の注射を確保するために画像誘導の手順の使用を導入している。縦方向の高解像度のMRIは、脳転移の頭蓋開発に追従するために適用される。

プロトコル

全ての動物手順は、テキサス大学南西医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1。 MDA-MB231/Br-GFP細胞の調製

1. 10％FBS、1％グルタミンおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地（親切に博士パルミエおよびSteegの、NCIによって提供される）MDA-MB231/Br-GFP細胞を取り出し、培養物。
2. 細胞と培地の色の状態を観察し、2〜3日ごとに培地を交換してください。
3. トリプシン処理およびステップ1.3.1-1.3.5に概説されるように80％のコンフルエンスに達したときに細胞を回収する。
   1. 完全に古い培地を除去し、穏やかに細胞を洗浄するために5ミリリットルのPBS（1X）を追加します。皿からPBSを削除します。
   2. 皿に1.5ミリリットルのトリプシンを追加します。すべての細胞をトリプシンで覆われていることを確認するために静かにお皿を傾けてください。バックセルインキュベーターに料理を入れて、1分間37℃で保管してください。
   3. インキュベーターからお皿を取り出し、観察する細胞を確保するために、光学顕微鏡下で細胞が皿から外します。
   4. トリプシンの効果を停止する培地3ミリリットルを追加します。遠心管中の細胞の混合物を回収します。 5分間2000rpmで混合を遠心分離する。
   5. 慎重に培地を除去し、均一になるまで5ミリリットルの無血清培地中で細胞を再懸濁。
4. 適切な数の細胞をカウントし、100μl量の1.75×10 ⁵細胞の最終濃度で無血清DMEM培地で再懸濁します。
   1. 50μlの細胞混合物を取り、50μlのトリパンブルーを追加。混合した後、10μlの混合物を取り、慎重に細胞計数スライドに追加します。正確な細胞数の推定を確実にするために複数のサンプルを使用してください。
   2. 細胞計数スライドを1つずつ終了し、細胞計数器で固執すると、自動的にカウントを開始します。すべてのカウント結果の平均を取ると、総細胞数を計算します。
   3. 再び細胞を遠心分離し、それらを再懸濁ボリュームμL1.75×10 ⁵ cells/100の最終濃度になるように無血清培地の適切なボリューム。
5. 前心臓内注射に氷上で場所細胞。

2。超音波画像誘導心臓内注射

1. 6〜8週齢の間の雌ヌードマウス（BALB / C NU / NU）を使用します。
2. イメージング·システムにログインします。トランスデューサー704（40 MHz）を初期化します。
3. 新たな研究を開始し、情報を入力します。
4. 麻酔（誘導室中の3％isoflurane/100％のO _2）とノーズコーンを介して全体の手順の間に、100％O _2（1 dm ³の/分）にイソフルラン（2％）を有する動物を維持する。まだ引っ込め反射はつま先のピンチで観察されていない場合に麻酔が確認された。
5. 37℃に撮影台の温度を設定する仰臥位での加熱された撮影台に、麻酔したマウスをテープで固定します。
6. イムの前​​に、37℃での超音波ゲルを保つ高齢化。マウスの胸部にゲルを適用します。
7. ホルダーにトランスデューサを取り付けます。希望の撮像深度に達するまでトランスデューサを下げます。左心室は、ランドマークとして上行大動脈（ 図1A）で識別されるまで、ステージを移動します。左心室のクリアな視界が可視化される段階をロックします。
8. 22 Gの針を1ミリリットルのシリンジに細胞混合物100μlを描画します。マウント注射器の注射器を配置し、固定します。
9. マウスの胸に向けて前進注射器を移動して、慎重に針の先端が（マウスに入る前に）撮像視野に入るまでなるので、横に移動します。
10. 左心室ダウン目指して針の高さと角度を調整します。
11. 超音波イメージングの指導の下で左心室に速やかに皮膚や筋肉層を通ってインターコース空間に注射針を貫通している。
    左ventriに針の挿入が成功の指標CLEは、注射器に新鮮な動脈血（暗赤色の静脈血とは対照的にピンク色）の還流である
12. （ 図1B）を徐々に細胞混合物を注入する。
13. 完了すると、針を撤回変換器を持ち上げ、湿らせたガーゼで超音波ゲルをきれいにし、テープを取り外します。
14. 予熱したパッドできれいなケージを準備します。
15. パッドの上に動物を置き、完全に回復するまで動物を観察します。
16. 動物の行動2日間、24時間毎に監視します。
17. 一般的な条件や実験マウスにおける合併症の神経学的徴候が日常監視されています。

3。頭蓋内腫瘍発生のMRIモニタリング

1. 脳転移の頭蓋内開発を監視するために9.4テスラの磁石を使用してください。
2. 2週間腫瘍移植後のMRIを開始し、最長3週間週1回繰り返します。
3. 3％のイソフルランを動物に落ち着いたし、遺伝子の下でそれらを維持するRAL麻酔（1.5％イソフルラン）。
4. 監視および実験を通して、動物の体温および呼吸を一定に保つ。
5. 高解像度マルチスライス（1ミリメートルと14スライス厚の隙間）のT ₁ -とT ₂強調冠状後頭蓋窩に前頭葉までの領域をカバーする画像は、次のパラメータを使用して取得されたT ₁強調画像を。複数のスライス（SEMS）エコースピン、TR / TE = 400 msec/20ミリ、マトリックス：X 256 256、平面解像度のFOV 20×20ミリメートル、：X 78 78ミクロン^2。 T ₂強調画像：複数のスライスエコー高速スピン（FSEMS）シーケンス、TR / TE = 2500 msec/48ミリ、8エコートレイン、マトリックス：256×256、FOV 20×20ミリメートル、平面解像度：78 X 78ミクロン^28,9。
   腫瘍病変は、T ₂強調画像上の正常な脳組織よりも明るく表示されます。
6. 腫瘍の大きさを手動enhanのを概説することによってT ₂ -重み付け画像について決定されるボランティア⁸によって書き込まMATLABプログラムを用いて、各画像上での質量の一部をcing。
   所与の腫瘍直径の大部分はスライス厚さ（1mm）よりも小さい、腫瘍の大きさは、平面領域ではなく、容積として提示される。

4。 H＆E染色は、転移の確認

1. 担癌脳を解剖、すぐに最後のMRスキャン後のマウスを犠牲にして、OCT媒体でそれを埋め込み、-80℃で凍結させ
2. セクションクライオスタットで厚さ10μmの冠状脳標本のシリーズ。
3. 脳切片にH＆E染色を行う。

結果

MRI（平面解像度78ミクロン）の高空間分解能で、高信号病変は、直径が310ミクロン（ 図2）のように小さいとして同定することができる。本研究では転移は非常に小さく、壊死や浮腫の開発が最小限であることから、T ₂強調画像上の高信号病変は真に腫瘍塊を表していた。

長手MRI研究は、腫瘍成長のインビボで非侵襲的評価を可能にする。 図3に示すように、高解像度MRIを3週間心臓内注射（ 図3A）の後にいくつかの小さな病変を検出することができた。週4日、前回のスキャンすべてに見られた病変は大きくなった。より多くの新たな病変は、T ₂強調画像（ 図3B）に登場した。

H＆E染色は、拡散またはクラスタのどちらのタイプの転移性病変（ 図4）を明らかにした。拡大された血管は、多くの場合、nonsprouting血...

ディスカッション

本研究では、この研究におけるすべての動物は、脳転移を発症しない動物の死亡が観察されないように、超音波画像誘導左心室注入は、正確さを保証することを実証した。画像誘導注射の美しさは最終的に左心室に皮膚の針貫通のパスとは従って、厳密な解剖学的ランドマークを必要とする手動の手順とは区別され、画像の下に監視し、調整することができるということである。

脳転移の頭蓋内開発の現在の理解は、主に動物モデル^4,10上の組織学的研究に基づいています。しかしながら、組織学的研究は、通常は腫瘍移植後の異なる時点で殺されたマウスの大多数を必要とする。さらに重要なことは、個々の病変の時間的な開発についての情報は組織学的研究から、不足している。

in vivoイメージングでよりEを約束fficiency各動物はそれ自身の制御及び複数の時点となるため、順次^7,11調べることができる。高解像度のT ₂強調画像（310ミクロンが表示されていると小さく、直径病変）非常に早い段階で多...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	ハイクローン	SH30022.01
トリプシン	メディアテック	25-051-C1
自動セルカウンター	BioRad	TC10
イソフルランバ	クスターインターナショナル株式会社	1001936060
VisualSonics Vevo 770 高解像度イメージングシステム	株式会社ビジュアルソニックス
9.4 T 水平ボア磁石と Varian INOVA Unity システム	アジレント
O.C.Tコンパウンド	Sakura Finetek USA	4583