マウスにおける恐怖条件付けをトレース

サマリー

以下の実験では、マウスでの痕跡恐怖条件付けのためのプロトコルを記述します。連想記憶のこのタイプは、中立的な刺激と無条件刺激を分離し、トレース期間を含む。

要約

この実験において、我々は、学習及び記憶を測定するための手法を提示する。ここで紹介する痕跡恐怖条件プロトコルでは中性刺激と無条件刺激の間に5ペアがあります。各空調トライアルを分離20秒トレース期間があります。翌日の凍結を条件刺激（CS）と、トレース期間のプレゼンテーション中に測定される。三日目に文脈記憶を測定するために、8分間の試験があります。代表的な結果は、無条件刺激することなく、音のプレゼンテーションを受けたマウスと比較して嫌悪無条件刺激（ショック）で発表されたマウスからである。痕跡恐怖条件付けに成功し、他の恐怖条件付けの方法で見つからないマウスでは微妙な学習と記憶の欠損や機能強化を検出するために使用されています。恐怖条件付けこのタイプの内側前頭前皮質及び海馬の間の接続に依存すると考えられている。一つは、現在の論争は、このメソッドは扁桃体に依存しないように考えられているかどうかである。そのため、他の恐怖条件付け試験は、このような遅延の恐怖条件付けを介するなど扁桃体依存学習と記憶の効果を調べるために必要とされる。

概要

恐怖条件付けでは中性刺激（NS）は、嫌悪無条件刺激（米国）と対になっている。 NSは普通のトーンであり、米国での反復のペアリングを通じて条件刺激（CS）となります。 CSは次に嫌悪米国の非存在下で、例えば凍結などの馴化応答（CR）を誘発することができる。一般的に使用される恐怖条件プロトコルは遅延条件付けである。このプロトコルでは、NSと米国の発症は、連続または刺激提示中に一部重複しています。同時エアコン、後方コンディショニング、および痕跡条件^1：遅延恐怖条件が時間的連想コンディショニングの最も一般的に使用されるタイプの一つであっても、連想コンディショニング時間的配置の他のいくつかの種類があります。痕跡恐怖条件付けでは「トレース」の期間に生じた数秒のNSと米国の間で刺激のない区間があります。

いくつかの研究では、財政赤字を報告している痕跡恐怖条件におけるS神経毒性病変は構造で生産されていたときに海馬^2-5または薬理学的薬剤は、海馬内受容体機能をブロックするために使用されているに入力。海馬の病変は痕跡条件と文脈条件における赤字になりますが、遅延恐怖条件^8を損なわない。痕跡恐怖条件付けを使用するいくつかの利点があります。恐怖条件付けプロトコルは、三日間の試験期間にわたって達成かつ空間依存しない海馬依存性記憶を可能にすることができる。トレース恐怖条件付けは、モリス水迷路、新規物体認識試験、または海馬依存性記憶を調査中の他の迷路試験に相補的試験として使用することができる。

プロトコル

以下の実験で使用したマウスは、14時間の明および10時間の暗時（6時00分時間20:00）日周サイクル、22℃の周囲温度でベイラー大学で生成され、収容した。マウスは食餌および水を自由摂取のアクセス権が与えられた。マウスへのすべての手順は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドラインの国立研究所を遵守していた動物のプロトコルは、ベイラー大学動物実験委員会によって承認された。

概要

トレース付きの恐怖タスクがWiltgenと同僚⁹で説明した手順に基づいています。

1。機材の準備

恐怖条件付け装置室（26センチ×22センチ×18センチメートル）はアクリル2辺、金属である2辺と穏やかなフットショックを配信するために使用されている格子床底から構成されています。検査室は、家です音減衰されたチャンバー内のD。チャンバはまた、動き検出ソフトウェアに影響を与える外光を防止するための遮光ある。

1. 検査室用の衝撃レベル、光レベル、音の強さのレベルを校正します。検査室のバックグラウンドレベルを測定します。このチャンバー内のバックグラウンドノイズは65デシベルです。このレベルを測定するために、サウンドメーターを使用してください。メーターは、70デシベルに設定され、Cに、そしてゆっくりと設定検出に設定する必要があります。
   1. 0.5ミリアンペアに衝撃レベルを校正します。正しく衝撃レベル（材料表を参照）を校正するために外部校正装置を使用してください。ショック発生器の内部の測定は正確ではない。ショック発生器は、正確に標準電流計により測定することができないスクランブルショックを投与する。
   2. グリッドバーのいずれか1のリードを配置し、他方のリード3または4のバーの上に置きます。ショックを管理する衝撃波発生装置を使用してください。正しいレベルが達成されるまで、ショックレベルを調整します。 EAのためにこれを行うCH調整チャンバーを恐れている。
   3. 室内の光レベルを測定する際室にドアを閉めます。約1.0への光レベルを校正します。これは、この実験で使用FreezeFrameソフトウェアに固有の番号である。外光計は2ルクスとしてこれを読みます。光レベルはハウスライトの位置を移動させることにより、レンズの凝縮器を調整することによって調整することができる。調整後のレンズのための調整ネジはしっかり締めてください。
   4. 85デシベルにサウンドデシベルレベルのキャリブレーションを行います。デシベルレベル（材料表を参照）を校正するためにテストケージの中に外部デシベルメーターを使用してください。提示音が2,700 Hzのトーンになります。注：6ヶ月よりも古いマウスを用いた場合は、それ以上の年齢のマウスが赤字を聞いて持つことができるので、ホワイトノイズを使用する方がよい場合があります。
2. この装置は、別々の保持室に科目を取る準備ができていた後。注：試験室と同じ部屋にマウスを収納しないでください。
3. ラベル番目テストのためにテストされたマウスのE尾。それは、テストの前に、過剰な処理を減らすことが最善です。代替的に、尾部は、実験前日には、ストレスを扱う低減するために標識することができる。マウスは、それらを30分間室温に順応することを可能に標識された後。テストが完了した後のマウスを収容するための余分なきれいなケージを持っています。

2。エアコンデイ1トレース

1. ケージから各マウスを削除し、恐怖条件付け室に輸送するための個々のケージに入れます。各ケージのためのクリーンな寝具を使用してください。正しいテストをマウスの秩序を維持するために、転送ケージに付箋紙を置きます。注：マウスを単独で収容されている場合、それらはそれらのホームケージに搬送することができる。
2. 試験チャンバー内にマウスを置き、ドアを閉めます。ソフトウェア·プログラムを起動します。
3. 訓練日に、マウスに3分間チャンバを探索することを可能にする。ソフトウェアは、20秒の音（85デシベル、2700ヘルツ）Tを提示動物O。 20秒の痕跡期間の後、軽度の衝撃（2秒、0.5ミリアンペア）が、動物に投与される。
4. 彼らはビデオを見ることで、嫌悪刺激を受けたことを確認するために、被験者の反応を記録します。 200秒試行間の間隔は5コンディショニング試験を分離している。各試験は、20秒遅れの衝撃に続いて20秒のトーンで構成されています。
5. テストが完了した後に動物は、試験ケージから取り外す前に、1分間の試験室に残ることができます。
6. バック転送ケージに動物を配置し、そのホームケージに戻します。追加のマウスは彼らのホームケージに存在する場合は、個別にすべてのマウス完全なテストするまで、マウスを収容する。これはテストされていない他のマウスにストレスを軽減します。別の解決策は、単独で連続的に1ケージからマウスを除去する影響を低減するために、試験前1週間、すべてのマウスを収容するであろう。
7. EAC後、30％イソプロパノールで検査室を清掃してくださいH動物は、テストされています。
8. 繰り返します、試験コホートにおけるすべてのマウスのための2.2から2.7を繰り返します。
9. コホート内の最後のマウスがテストされた後に、そのコロニーの部屋にすべてのマウスを返します。

3。トレース恐怖条件付け2日目：トレースメモリテスト

1. トレースメモリテストは2日目に行われます。このプロトコルでは3トーンの発表があります。トレース条件付け試験のための新しいコンテキストにマウスを置きます。
2. 3 20秒トーンのプレゼンテーションに続いて2分のベースライン期間でプログラムを実行するためのソフトウェアを準備します。各トーン·プレゼンテーションの間にSA 220秒のITIがあります。
3. 新しいコンテキスト条件については、形状、質感、および空調室の色を変更するために、チャンバの床の上に透明なアクリルインサートを配置します。
4. 床の下に挿入量るボートにバニラエッセンスを配置することによって、チャンバー内の臭気を変更します。
5. 70％エタノールの代わりに30％イソプロパノールで室内を清掃します。注：これは役立ちます小説コンテキストを作成する。
6. 保持室にマウスを持って、必要に応じてテストのために自分の尾を再ラベル。
7. シュレッダー紙でベッドを置き換えることにより、新たなコンテキスト転送ケージを準備します。注意：これは小説コンテキストを作成するのに役立つだろう。
8. プログラムを起動して、試験チャンバー内にマウスを置きます。テストが完了した後、70％エタノールでチャンバーを清掃します。
9. 痕跡条件が完了した後にホームケージにマウスを返します。すべてのマウスがテストされたとき、そのコロニーの部屋にすべてのマウスを返します。

4。トレース恐怖条件3日目：コンテキストメモリテスト

1. 三日目に文脈条件付けが行われる。 8分間の凍結挙動を記録するプログラムを実行するためのソフトウェアを準備します。
2. テストする前に、各マウスをテストした後、30％イソプロパノールで室内を清掃します。コンテキストは、1日目のものと同一である必要があります。転送ケージは1日目と同じでなければなりません。
3. 保持の部屋にマウスを持参し、テストのために彼らの尾にラベルを付ける。
4. プログラムを起動して、試験室において、各マウスを置きます。テストが完了した後、30％イソプロパノールで室内を清掃します。
5. 完成したときに彼らのコロニーの部屋にすべてのマウスを返します。

結果

代表的な結果のために我々は中立的な刺激を受けたが、無条件刺激（無ショック状態）を受信しなかったマウスと比較して無条件刺激（ショック状態）と中性刺激のペアを受信した制御のC57BL/6J成体マウスからのデータを提示。それは、第1のプロトコルが正しく行われたか否かを決定するために、この行動試験をセットアップするとき、この条件を実行することが重要である。

図1のデータは、痕跡恐怖条件付け試験において、C57BL/6Jマウスの訓練の日を表しています。それはトレーニングの日中にすべての条件にわたってグループを比較する必要はない。しかしながら、ベースライン内の初期差異があるかどうかを評価するためにベースライン期間を調べるために有用である。我々は、ベースライン条件T（1,10）における凍結のレベルの違いは観察されなかった= 0.6、P = 0.56。これは、凍結には初期差異がないことを実証しているルVELS。一般的に低凝固レベルは初期の学習トライアル、ありますが、空調ペアリング試験上の凍結挙動の増加がある。私たちは、グループF（1,10）の主な効果を発見した1...

ディスカッション

痕跡恐怖条件付けの基礎となる神経回路を解明したいくつかの研究が行われている。トレース恐怖条件付けは、海馬CA1 ^12月14日のに関与すると考えられている。証拠は、内側前頭前皮質（のmPFC）は、トレースまばたき空調¹⁵に大きな役割を果たし、のmPFCを痕跡恐怖条件付けに関与することが見出されていることもある。ある研究では、このようにトレース期間¹⁷中にメモリを維持することができる構造を提供する、のmPFCニューロンは、トレース期間の間に持続的な活性を提供することを見出した。

のmPFCの役割を調べることにより、連想記憶の形成における分子事象のタイムラインを検査することができる。ラニアンら ¹⁶のmPFCで細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）を阻害すると、記憶保持に干渉ことがわかったが、メモリのエンコーディングを妨害しなかった。 phospにおいてさらに増加前頭前皮質のhorylated ERKは、以前の海馬においてより報告された。 ERKは、長期記憶に関与すると考えられているの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
FreezeFrame	Coulbourn
30% イソプロパノール			90% イソプロパノールを購入し、30%に希釈します
70% エタノール
Amp-Meter	Med-Associates	ENV-420	Windows XP, Vista, and 7 Compatible (32-bit only)
デジタルサウンドレベルメーター		33-2055
バニラエッセンス	マコーミックピュアバニラエッセンス
付箋ポスト	イット		3インチx3インチ