蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

サマリー

不凍タンパク質(AFP)は、氷の特定の平面に結合して、氷の成長を防ぐか、または遅くします。蛍光ベースの氷面親和性(FIPA)分析は、AFP結合した氷面の決定のためのオリジナルの氷エッチング法の改変である。AFPは蛍光標識され、巨視的な単氷結晶に組み込まれ、UV光下で可視化されます。

要約

不凍タンパク質(AFP)は、内部の氷の成長を防ぐか、または遅くするために、様々な冷たい硬い生物で発現されています。AFPは、氷結合表面を通して特定の氷の平面に結合する。蛍光ベースの氷面アフィニティー(FIPA)解析は、AfPが結合する氷面を決定するために使用される修正技術です。FIPAは、AFP結合の氷面を決定するための元の氷エッチング方法に基づいています。それは短い実験の時間でより明確なイメージを作り出す。FIPA分析では、AfPSはキメラタグまたは共有色素で蛍光標識され、その後ゆっくりと巨視的な単氷結晶に組み込まれ、半球に予知され 、a軸 と c軸を決定するように配向されています。AFPバウンド氷半球はUV光の下で画像化され、非特異光を遮断するフィルターを使用してAFPバウンド平面を視覚化する。AfPsの蛍光標識により、AFPの氷への吸着をリアルタイムに監視できます。ラベルは、AMP がバインドする平面に影響を与えないことが判明しました。FIPA分析では、同じ単氷結晶上で複数の異なるタグ付きAFPを結合し、結合面を区別するオプションも導入されています。FIPAのこれらのアプリケーションは、AAFPがその成長を止めるために氷に結合する方法と、多くのAFP生産生物が複数のAFPアイソフォームを発現する理由についての理解を深めるのに役立っています。

概要

不凍タンパク質(AMP)の生産は、氷を含んだ環境に生息する一部の生物の重要な生存メカニズムです。最近まで、AMPの唯一の機能は、循環を妨げ、組織損傷、浸透ストレスを引き起こす内部氷結晶の成長を予防または遅くすることであると考えられていた。魚のようないかなる程度の凍結を許容できない生物は、氷晶成長を完全に阻害するAMPを発現する^1。草などの他の人は、凍結耐性であり、それらの組織中の大きな氷の結晶の形成を減少させる氷再結晶を阻害するAMPを発現する^2。低温での膜の安定化は、AfPS3に対して提案されたもう一つの機能です。最近、氷に覆われた汽水湖⁴から南極細菌マリノモナスプリモレンシスのAFPに新しい役割が示唆された。このAFPは、酸素と栄養素へのより良いアクセスのために細菌を氷に付着すると考えられているはるかに大きなアフェシンタンパク質⁵の一部である^6。他の微生物は、彼らが住んでいる氷の構造を変更する可能性があるAMPを分泌することが知られています⁷.

AMPは、いくつかの魚、昆虫、植物、藻類、細菌、珪藻類、および真菌で発見されています。彼らは様々な機会に異なる前駆者からの進化と一致する著しく発散的な配列と構造を有する。しかし、それらはすべて氷に結合し、吸着阻害メカニズム⁸によってその成長を阻害する。AfP はそれぞれ、氷結合部位(IBS)として機能する特定のサーフェスを持っています。これらは、典型的には^、9-11の表面残基の部位特異的突然変異誘発によって同定された。IBSは、氷の特定の平面に一致する氷のようなパターンで水分子を配置するために仮説されています。したがって、AFPは^5,12に結合する前にリガンドを形成する。氷面はミラーインデックスによって定義することができ、異なるAMPは異なる平面に結合することができます。したがって、冬のヒラメからのタイプI AFPは20-21錐形の平面¹³に結合し、III型AFPは複合氷結合表面^11,14を使用して一次プリズムとピラミッド面の両方を結合し、スプルース・ブドワームAFPは多動性AFPである一次面と基礎面^15,16の両方に同時に結合する。 MPAFPなどの他の多動性AfPは、単一の氷結晶半球^5,17の完全なカバレッジによって示されるように、複数の氷面に結合する。これは、多動性AMPが基底面を結合する能力と他の平面が、適度に活動的なAMP¹⁸に対する10倍の高い活性を占める可能性があると仮定されている。多動性AMPの効率は十分に文書化されていますが、複数の氷面に結合する能力はまだ理解されていません。

AFPに結合した氷面を決定するための元の方法は、チャールズナイト^13,19によって開発されました。この方法では、マクロ的な単一の氷の結晶を中空の金属棒(冷指)に取り付け、脱気水で満たされた半球カップに水没させることによって半球に形成される。その後、半球はAFPsの希薄溶液に沈め、氷の層はAFP溶液から氷結晶半球に数時間にわたって成長し、冷たい指を循環するエチレングリコールの温度によって制御される。氷の結晶を溶液から取り出し、冷たい指から取り外し、-10〜-15°Cの冷凍室に入れた。表面を鋭い刃で削り取って不凍タンパク質溶液の凍結表面膜を除去し、氷晶を少なくとも3時間昇華させた。昇華後、AFPによって結合された氷面は、残留タンパク質に由来する白色のエッチングパターンと見なすことができる。氷半球は、そのc軸と-軸に向けて、氷の基底面およびプリズム平面を見つけ、エッチングされたパッチのミラー指数を決定することができます。

ここでは、AFP結合した氷の平面を決定するための元の方法の改変について述べているが、我々は蛍光ベースの氷面親和性^(FIPA)11と呼ぶ方法である。このAFPは、緑色蛍光タンパク質^{(GFP)11、16、17、20}などのキメラタグで蛍光標識されるか、またはAFP^5,21に共有結合した蛍光色素を有する。蛍光標識されたAFPは、単一の氷結晶に吸着され、元の氷エッチング実験と同じ実験手順を使用して生い茂る。成長する氷半球に対するAFP結合の程度は、紫外線(UV)ランプを使用して実験全体を通して監視することができる。実験が完了した後、半球は冷たい指から直接取り除かれ、昇華することなく画像化することができます。しかし、必要に応じて、半球を昇合したままにして、伝統的な氷のエッチングを視覚化することができます。FIPAの方法論に導入された変更は、従来の氷エッチングプロトコルを数時間短縮する。さらに、それぞれ異なる蛍光標識を持つ複数のAfPsを同時にイメージングして、AFP結合した氷面の重複するパターンを視覚化する可能性があります。

プロトコル

1. 単一の氷の結晶を成長

1. エチレングリコール冷却浴に収まり、浮遊できるきれいな金属鍋(直径15cm、高さ4.5cm)を取ります。
2. ポリ塩化ビニル(PVC)円筒形金型(直径4.5cm、高さ3〜4cm、厚さ4mm)をパイプから鋸で準備します。
   1. 片方(図1A)のノッチ(幅1mm、高さ2mm)を切ります。
   2. 鍋に快適に収まる金型を多く準備します(図1B)。
      注: 研究は、ポリビニルアルコール(PVA)が氷の核化²²に影響を与えることができることを示しました。しかし、私たちのオープンモールドPVCシステムでは、非定型の氷形成の問題に遭遇していません。
3. 各金型の底面リングに真空グリースの光フィルムを塗布し、ノッチを切り取った表面です。このグリースを塗ったノッチサーフェスを、フライパンの中央から離れた位置に向けたノッチを持つ金属鍋にシールします。油を塗ったり、グリスでノッチを妨げないように注意してください。
4. 0.22 μmを濾過・脱気/脱イオン水を鍋の中心に加え、金型の外側に加え、ノッチを通してゆっくりと金型に入るようにします。気泡を導入しないように注意してください。水層は約5mmの深さでなければなりません。
5. 鍋を温度制御エチレングリコール浴槽に入れ、-0.5°Cに冷却します。 鍋は完全にレベルでなければなりません。必要に応じて、鍋の側面にバラストウェイトを追加します。
6. 鍋と水が-0.5 °Cに達した後、鍋の真ん中に小さな氷を、型の外側に加えます。
   1. これは鍋を横切って型に過冷却水の氷の成長を有核します。各金型の底部にある小さなノッチは、1つの氷の結晶だけが伝播し、各金型に単一の氷の結晶をもたらします。
   2. 一晩インキュベートして氷の層を形成する。
7. 次の3日間で、1日1回、各金型に4°C脱気/脱イオン水の13mlを加え、1日目に-0.8°C、2日目に-1.1°C、3日目に-1.5°Cに添加した後、エチレングリコール浴の温度を低下させます。
   1. これらの温度で一晩インキュベートします。
   2. 4日目までに、金型は完全に氷で満たされるべきです。
8. 鍋から金型を引き出し、氷の結晶を金型から押し出し、計量ボートなどのきれいな表面に約1時間-20°Cの冷凍庫で保管してから取り扱います。
9. 多くの小さな単氷結晶を調製するのではなく、数リットルの体積の大きな単一氷結晶を、ナイト²³で説明したように一定温度インキュベーターで調製することができる。大きな氷の結晶は、-15〜-20°Cの冷凍庫で覆われておけば1年以上保存することができます。単結晶の一部は、必要に応じて鋸で氷ブロックから切断することができます。

2. 氷結晶の特異点と配向の決定

1. 金型から排出された氷が、2つの交差したポラロイドの間のフリーザールームで観察することによって単結晶であるかどうかを判断する(図1D)。
   1. 氷の結晶が単一の場合、亀裂や不連続性は見られないので、氷の結晶の中で光の方向が変化してはいけません。
      注: 冷凍室が利用できない場合は、必要なすべての手順で冷たい部屋を使用することができ、迅速に作業し、氷を控えめに扱う際に注意が必要です。
2. 氷の複屈折のために 、c軸の向きを同時に決定することがあります。次の情報を使用して、向きを決定します。
   1. c軸が入射光と正確に平行である場合、理論的には、交差したポラロイドを通過する光はありません。入射光がc軸と平行からわずかにタイトルが付けられている場合、交差したポラロイド間で回転すると、均一な多色スペクトルの光が結晶を透過します。この均一な透過率は、そのc軸²⁴に沿った氷_Ihの光学的不活性から生じる。氷の結晶の基底面は、c軸に垂直である。
   2. c軸が入射光と平行から離れ、氷の結晶が交差したポラロイド間で回転すると、透過光は結晶の90°回転ごとに0-100%の透過率の間で交互になります。
   3. 最も一般的には 、c軸は円筒状の氷の結晶の円形平面に垂直になります。
3. 氷の結晶をアルミニウム箔でしっかりと包み、小さな穴をホイルを通して基底面の氷に突き刺し(c軸に垂直)、20分間真空下に置くことによって行われる氷の穴²⁵によって軸の向きを決定する。
   1. この処理は、基底面に六角形対称のエッチングを生成し、-axesが6面の星の頂点を通って走る(図2A)。
   2. 必要であれば、氷結晶は、それぞれ冷たい指に垂直な一次または二次プリズム面とそれを取り付けるために六角形の一方の側に平行または垂直の鋸で切断することができる(図3)。

3. 蛍光標識不凍タンパク質の単一氷結晶への吸着

1. 冷たい指 (図1C)に、最初にキャビティを結晶の上部にボーリングして、単一の氷の結晶を取り付けます。これを行うには、わずかに異なる直径の2つのアルミニウム棒で氷を交互に融解し、冷たい指の直径に似ているが、冷たい指が合うことができる空洞を形成する。
2. 冷たい指を-0.5°Cに冷却し、氷の空洞に入れ、氷の結晶が金属に凍るまで所定の位置に保持します(図2B)。水晶を指に取り付ける際は、指からロッドへの熱の効率的な伝達を妨げるため、気泡を避けてください。
3. 氷晶の直径の約2倍の半球状のカップを、濾過された脱イオン水または緩衝液で満たし、約4°Cに冷却する。 冷たい指に結合した氷の結晶をカップに浸し、氷の結晶の上部が液体層とほぼ同じレベルで、氷がカップの壁に触れていないような余分な水または緩衝液を取り除きます。
   1. カップを断熱材で覆い、温度を-5 °Cに下げます。
   2. 氷の結晶が半球になるまで約1時間待ち、約20分ごとにその状態を確認します(図2C)。
   3. 氷は氷の結晶を溶かして成長させることによって半球形のカップの形を取りますが、カップの壁に触れて成長してはいけません。壁と半球の間に少なくとも1cmの隙間があり、冷たい指が氷から突き出てはいけない。
4. 氷の結晶からカップを取り出し、蛍光タンパク質溶液を25〜30mlの最終体積と所望の分析濃度に加え、カップ中の全液量を変えない所見に注意してください。典型的な AFP 濃度は 0.1 mg/ml です。
   1. 氷の結晶の上部が液体と同じレベルにあり、氷の結晶がカップの壁に触れていないように、カップに氷の結晶を再結合します(図2D)。
   2. 冷たい指の温度を-8°Cに落とし、タンパク質溶液を氷晶中に2〜3時間凍結させ、溶液を頻繁に攪拌する。タンパク質溶液から形成された氷は、氷の成長を止める前に少なくとも5mmでなければなりません。
5. 冷たい指に取り付けながら、カップから氷の結晶を取り除きます。冷たい指を通して冷媒を0°Cのすぐ上に温めて後者から氷を取り外し、氷の結晶が溶けるまで待ちます。
6. 水晶平らな面を計量皿などのきれいな表面に下ろし、新たに氷を形成しないように注意し、手渡す前に少なくとも20分間-20°Cで保存してください。

4. 不凍タンパク質結合氷の平面の可視化

1. 蛍光の可視化は、暗くなった冷凍庫または冷たい部屋で行われ、氷結晶を波長特異的な励起フィルタ付きランプの下に置き、蛍光標識とカメラエミッションフィルタを励起して他の非特異的光を遮断する。パターンに基づいて、AMP によって結合された氷面を推定することができます(図4)。
2. 波長固有のライトが使用できない場合は、代わりに UV ライト ボックスを使用できます。
3. 従来の氷のエッチングは、氷半球が-20°Cで少なくとも3時間昇華するようにすることで、氷表面に残留タンパク質粉末が見えるようにすることによっても行うことができる(図5)。
4. ステップ 2.3 を繰り返して、完成した氷半球の -軸の方向を決定できます。

結果

単一の氷の結晶の準備および取付けは、エラーが最も一般的に行われるFIPA手順の2つのステップである。プロトコルセクションのステップ2.1で概説したように、調製された氷結晶が単一であるかどうかを調べることによって、交差したポラロイド(図1D)を調べることによって決定する。多結晶性の氷結晶がFIPA分析に使用される場合、結果は、コヒーレント結合パターンなしで半球上のAfPSの不連続結合となります (図6B)。氷の結晶インターフェースが、AFPが最終的な結果を結合する氷面の周りに配置されている場合、解釈できない可能性があります。このため、氷の結晶は、次のステップに進む前に、特異性を慎重にチェックする必要があります。FIPA分析のために単氷結晶を有する確率を高めるために、同時にいくつか作るべきである。

もう一つの一般的なエラーは、マウント中にクリスタルの顔を冷たい指に正しく合わせなくてすみます。冷たい指に垂直な一次または二次のプリズム面を取り付けるには、プロトコルセクションのステップ2.3で概説したように、単一の氷の結晶は...

ディスカッション

AFP結合した氷面の決定のためのチャールズ・ナイトによる氷エッチング法の開発は、AfPによる氷結合のメカニズムに関する研究を大幅に進めた。AMPの構造はX線結晶学^26,27 によって解決できるのに対し、AFPが結合した氷上の相補表面を推測する明白な方法はなかった。冬ヒラメからのタイプI AFPが最初に特徴づけられたとき、それは氷²⁸の主要プリズム面に結合すると仮定された。しかし、ナイトのI型AFPの画期的な氷エッチング実験は、彼らが氷¹³のピラミッド面に結合することを示した。この結果は、AFPの研究コミュニティにAFPアイスバインディングのメカニズムを再考させ、AMP⁹の氷結合面をより正確に決定することを刺激した。ナイトのオリジナルの氷エッチング実験は、AFP生産生物から精製されたネイティブのAMPを使用して行われました。組換え AMP の開発と GFP タグの使用の増加に伴い、これらの研究を他の多くの AMP²⁹に拡大する機会がありました。

テトラメチルローダミン-5(お...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NESLAB RTE 冷蔵バス/サーキュレーター	Thermo Scientific	RTE7
エチレングリコール、予混合不凍液/クーラント	認定	29-3037-0	一般的な自動車用不凍液
コールドフィンガー	利用不可		真鍮製カスタムメイド(長さ9cm、外径1.5cm)
半球カップ	利用不可		樹脂製カスタムメイド(外径8cm、内径6cm)
高デュアル出力照明システム	Lightools Research	LT-99D2、Illumatools DLS 120ボルトAC、LT-9470FX、LT-9549FX	Lightoolsリサーチ
カメラ	Canon	EOS 50D
発光フィルター	Lightoolsリサーチ	LT-9EFPVG、LT-9GFPVG、LT-9RFPVG	フィルターをカメラのレンズに取り付けるには、フィルターリングアダプターが必要になる場合があります