ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化

サマリー

ストレス顆粒（SGSは）失速リボ核タンパク質粒子（RNPは）、および様々なストレスに対する細胞応答において重要なを含む細胞質RNAの顆粒である。のSGのダイナミクスは、ストレス後のトランスフェクションした一次細胞内のSGのタグ付けされたコンポーネントの局在を可視化することにより、生細胞で追跡することができます。

要約

のSGは、特定のタンパク質成分またはポリA + mRNAの免疫染色により、細胞内で可視化することができる。 SGSは非常に動的であり、そのアセンブリと運命の研究では、ストレスに対する細胞の応答を理解することが重要です。 G3BP様のSGの重要な要素の欠乏は（に、RasGAP SH3ドメイン結合タンパク質）は、中枢神経系のマウス及び変更における発達障害につながる。生物、1缶培養一次細胞から細胞内のSGのダイナミクスを研究し、SGSにはトランスフェクトタグ付けされたコンポーネントのローカライズに従ってください。私たちは、マウス胚線維芽細胞におけるG3BP1含有のSG細胞（MEF）を観察するためにコマ撮り実験について説明します。この技術はまた、最近、これらのSGは、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発症に形成されていることが示されたように非常に重要である、生きたニューロンにおけるG3BP含有のSGを研究するために使用することができる。このアプローチは、任意の他の細胞体及び顆粒タンパク質成分に適合し、かつ実施することができるトランスジェニック動物によると、これらの顆粒の具体的な因子の非存在下で、例えば顆粒動態のライブの研究を可能にする。

概要

ストレス顆粒（のSG）は、高温、酸化ストレス、低酸素症、浸透圧ショック、UV照射、グルコース欠乏、またはウイルス感染のような¹環境ストレスに対する細胞防御応答として形成された非細胞質の膜状の病巣である。それらは、酸化的ストレスをトリガ亜砒酸ナトリウムのような化合物で処理することにより化学的に誘導することができる。 SGSは失速翻訳メッセンジャーリボ核タンパク質（mRNPs）を逮捕し蓄積する翻訳機構からmRNAを隔離する^、2と錯体^を形成し、そのアセンブリがeIF2αリン（真核生物開始因子α2）のリン酸化によって引き起こされることができます。 SGSはPボディーのようなポリソームや他の顆粒と部品を交換する動的な構造体である。彼らは、mRNAが安定な非ポリソームmRNPs ³への翻訳、再開始、劣化、またはパッケージのいずれかに分類され、処理される「トリアージセンター」を構成する。のSGの組み立てが速いbはUTより大きな顆粒に合体初期多数の小さな集合体との漸進的なプロセスである。微小管を破壊するか、安定化する化学的阻害剤の使用は、微小管ネットワークがアセンブリ、凝集および分解プロセスを含むSG動力学に必要とされることを示している。

のSGの動的アセンブリも二量体化することができ、TIA-1（T細胞内部抗原1）およびTIAR（TIA-1関連タンパク質）のような特定のRNA結合タンパク質（RNA-BP）の凝集によって促進される、SGSに⁴へソーム分解およびmRNAのルーティングを促進する。 G3BP（に、RasGAP SH3ドメイン結合タンパク質）は、細胞が亜ヒ酸や高温で強調しており、脱リン酸化G3BPの過剰発現がのSGアセンブリ^5を誘導することができたときのSGに局在するようなRNA-BPである。

G3BPは最初に、RasGAP P（RAS-GTPアーゼ活性化タンパク質との相互作用により特徴づけられた進化的に保存されたRNA-BPである120 ^6）;しかし、この相互作用は、最近^7を再訪した。 G3BPファミリは、2哺乳動物のメンバーは、G3BP1（G3BPと呼ばれる）とG3BP2 ^8が含まれています。両方のタンパク質は、細胞がストレス⁹に供されるのSGに共局在。正規のRNA認識モチーフ（RRM）を保存されたRNP1とRNP2モチーフにした：G3BPs N末端NTF2ドメインはプロリンリッチ（PXXP）のモチーフが続くそれらの局在やオリゴマー化に影響を与えることが示唆構成し、C末端モチーフは、RNA結合に関連付けられている、アルギニン - グリシンが豊富（RGG）のボックスが続く。興味深いことに、EGFPに融合した異なるドメインを構築することによって、タンパク質の様々な部分の分析はNTF2様ドメインおよびRNA結合ドメインは最も効率的に二量体化特性の重要性を示唆し、前記SGsに動員し、RNAが結合であることを示したのSGの組み立て。多様なモデルは、in vitro ^10-13 に G3BPタンパク質の異なる機能を明らかにした。マウスにおけるG3BPの破壊は、発生、成長および生存^14、並びに、空間ワーキングメモリ¹⁵に運動失調および欠陥を特徴と中枢神経系（CNS）におけるG3BPの重要な役割におけるこのタンパク質の重要性を示している。 G3BP欠乏は、SGの形成と神経変性疾患¹⁵の間の直接リンクを確立、変更された神経可塑性およびカルシウム恒常性につながる。それは、神経細胞のような初代細胞内のSGのダイナミクスを研究することができることが重要である。

このプロトコルは、亜ヒ酸の治療を受け、一次細胞でG3BP1含有のSGの組み立てを観察する簡単な方法を提供します。これは、応力の異なる種類、例えば、異なる条件下でのSGアセンブリを研究するために使用することができる。また、他のSGの顆粒または他の成分に適合させることができる。実際、このプロトコルは、G3BP1に焦点を当てていますが、TIA-1 / ^{R、TTP（tristetraprolin）2}のような他のストレス顆粒マーカーがありますFMRP（脆弱X精神遅滞症候群タンパク質^{）16、TDP-43（transactive}応答DNA結合タンパク質^43）17またはスタウフェン^18。具体的には、TIA-1 / Rのようなタンパク質が過剰発現された場合、異なる形成のSG機能、調節および関連する転写産物が異なる場合であっても、アセンブリのSGを誘導することができるRNA結合タンパク質、核、G3BPのようである。のSGのこれらの重要な構成要素のいずれか、または核生成の発蛍光タグ付きバージョンのトランスフェクションは、画像の特定のSGアセンブリとダイナミクスに行うことができます。

プロトコル

このプロトコルのすべての動物の手続きは、1986年11月24日の欧州共同体理事会指令（86-609/EEC）のガイドラインに厳密に準拠している。食料と水を自由に摂取できるように、家群のマウス、。 12時間の明：暗サイクル（午前7:00に点灯し）、12時間で制御された環境（22±1℃、55±5％の湿度）でそれらを維持する。

1マウス初代細胞の培養：マウス胚線維芽細胞（MEFに）

1. オートクレーブ細いピンセットだけでなく、湾曲したピンセットと解剖ハサミ。滅菌容器に保管してください。無菌D-PBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）を使用します。完全なMEFの培地を調製する：10％ウシ胎児血清（FBS）、1mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1％非必須アミノ酸、および0.5mM 2 - メルカプトエタノールを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ F12そして37℃の温
2. 妊娠中のマウス（13.5日でポスト交尾（DPCを安楽死させる））頸椎脱臼により。 90％エタノールで消毒したマウスから子宮角を削除します。無菌で清潔なフードの下、37℃での胚とホーンを配置し、D-PBSをあらかじめ温めておい。ホーンを開き、場所 100ミリメートル滅菌プラスチックシャーレ中の胚は、臍帯材料からそれらをクリーンアップし、血液の過剰を取り除くために温かいD-PBSでそれらを洗ってください。両眼の下では、胚の手足、内臓を取り除き、 脳を含む頭部の上部。
3. 新しいシャーレに、ミンチ 無菌の手術と非常に小さな断片に胚 ブレード またはハサミ（少なくとも1分間）。異なる遺伝子型の胚の場合、個々のペトリ皿に各胚を入れて、ジェノタイピングのための尾または上位頭を維持するように注意してください。
4. 1Xトリプシン-EDTA（0.25％トリプシン、1mMのEDTA）で胚をカバーしています。 37℃のインキュベーター内で1時間に30分間インキュベートします。完全に10ミリリットルを追加トリプシン反応を停止するためのMEF培地。上下にピペットすべての凝集物を除去する。 10分間（完全培地で満たされた）を50mlチューブに細胞懸濁液を放置し、そして室温で300×gで5分間遠心し、上清を。完全培地（1胚のための6ミリリットル）でペレットを再懸濁します。生存可能な有核細胞を、トリパンを使用してカウントすることができる ブルー （約5×10 ⁶細胞は、一胚から期待することができる）。プレート60ミリメートルペトリ皿当たり3ミリリットル。
5. 翌日培地を変更し、 細胞が成長することができます 料理がコンフルエントになるまで。多くの 細胞型は見ることができ、 しかし、唯一の線維芽細胞は、継代培養後も存続します。
6. セルを分割し、それらをトランスフェクションのための50〜70％の集密度になるまで、ガラスボトム（時間経過の実験のために重要）で35mm皿で成長することができます。 マイコプラズマおよびマウスの病原体のためのテスト。

2。文化Aニューロンの場合のdaptations

1. 文化前日、無菌で清潔なフードの下のコートポリ-L-リジンと35ミリメートルのガラスボトムペトリ皿（0.1 mg / mlと200μl）を、一晩のままにしておきます。
2. 次の朝、二回45分〜1時間に1回5分間のために、無菌純水ですすいでください。 2のDMEMミリリットル+10％FBS培地と交換し、37℃のインキュベーターに保つ。
3. 18.5 DPCの胚を解剖。無菌で清潔なフードの下、100ミリメートルペトリ皿に冷滅菌HBSS（ハンクス液）中の胚でホーンを配置。新生仔はまた、ダムの寿命を維持し、特に入手が困難であることができるトランスジェニック動物の場合には、より多くの子孫を生成することを可能にするために代わりに胚のに使用することができる。個々のペトリ皿に、各胚や新生児を取り、はさみで首を切った。 、目に湾曲した鉗子を挿入することにより、ヘッドを保持する皮膚をカットし、丁寧に背面からソフト頭蓋骨を開くヘッドの目までは、頭の両側にある。視神経および脳幹をカット、脳を除去し、HBSSを含む新しいペトリ皿に入れて。ステレオスコープの下では、二つの薄い鉗子を使用して、すべての髄膜を除去します。海馬、皮質、または勉強する構造に応じて、脳の他の部分を分離する。
4. 冷HBSSの4.5ミリリットルで解剖脳の構造を浸し15ミリリットルのチューブに予め用意し、トリプシンで消化するまで氷上に保つ。 2.5％トリプシンの0.5ミリリットルを加え、20分、15分、37℃でインキュベートする。消化された脳の部分を破棄しないことは非常に注意しながら、HBSSでトリプシン3回すすいでください。
5. があるまで1ミリリットルチップを搭載した1ミリリットルマイクロピペットで1ミリリットル（皮質）、DMEM +10％FBSおよびピペッティングし、数回上下に500μL（海馬）に再懸濁し、次に、1ミリリットルを加えた200μlのヒントを装備目に見える骨材ません。
6. 各35ミリメートルのガラスだぼっに細胞懸濁液100〜200μLを配布DMEM +10％FBSを含有するニューロンは、少なくとも3時間、37℃で付着させてm個の皿。予め加温したニューロン完全培地により交換し（Neurobasal培地を、250μMのL-グルタミンおよびNS21を補充Chen ら ¹⁹に記載のように調製）および神経成長を可能にするために、37℃で残す。 in vitroでの 5から14日後に神経細胞をトランスフェクション（DIV）（トランスフェクションの効率は、DIVのカップルの後に高いが、シナプスの接続が良く7-10 DIVから確立されています）。

EGFP-G3BP1コンストラクトの3。トランスフェクション

35ミリメートル皿あたり精製したプラスミドの3μgのを使用して、蛍光マーカー（など、GFP、YFP、）に融合した目的タンパク質のcDNA（のSGの任意のコンポーネント）を含むベクターで細胞をトランスフェクト。

1. 製造業者のプロトコール（材料/試薬の表を参照）、以下、商業メソッドを使用するMEFをトランスフェクト。
2. カルシウムと神経細胞をトランスフェクト夏らから適応リン酸カルシウム法²⁰簡単に言うと：
   1. 解決策を準備し、DMEM-ウォッシュ：25のKClを含むDMEM;トランスフェクション溶液：1X DMKY（HEPES 5mMの、MgCl _2を 10mMの、フェノールレッド）を含むDMEM洗浄;衝撃溶液：HEBS 1×、1×DMKY、DMSOおよび2％（v / v）で;そして37℃で保管してください
   2. ニューロン、ろ液からメディアを取り出し、37℃で保管してトランスフェクション培地と交換し、リン酸カルシウムプラスミドDNAの沈殿物の調製時に37℃で保管した後、DMEM洗浄で洗浄する。
   3. 1.5ミリリットルの微量遠心管中で、（この順番で）ブラウン水（最終容量50μL）、 _塩化カルシウム2.5 Mの5μL、およびプラスミドDNAの3μgのを追加します。すでに丸底ポリプロピレンチューブに導入されたHEBS 2X50μlの上に、このミックスをドロップします。ドロップと一緒に回転することにより、チューブを混ぜる。 30分間、室温で沈殿形態をしましょう​​。
   4. precipitatを追加Eニューロン上に滴下し、30から50分の間、37℃で去る。
   5. DMEM-洗浄ですすぎ、最後に予備調整培地を再導入して、1分間のショック溶液と交換してください。 37℃で細胞を維持する

のSGアセンブリおよびダイナミクスを含むG3BPの4。可視化

1. フェノールレッドを含まない培地でフェノールレッドが含まれている細胞の培地を交換してください。
2. 買収のための蛍光を装備した共焦点顕微鏡を使用してください。顕微鏡システムをオンにします。水銀ランプ、コンピュータ、およびレーザーを。買収の開始前に37℃で少なくとも20分室内を暖める。
3. G3BPの過剰発現のSGの種類の自然形成を誘導する。細胞は、このようにして、ストレス誘導なしのトランスフェクション後24時間のSGの右側のアセンブリについて観察することができる。代替的に、ストレスがさらに前記SGsの組立を誘導するように誘導することができる。 0.5 mMの亜ヒ酸ナトリウムとスターを追加右化合物（顆粒はよく1時間以内に形成される）の添加後に取得はt。
4. 浸対物レンズに油を追加します（40Xや63Xの目標を使用します）、ステージホルダーに安定化に適応35ミリメートル顕微鏡ホルダーに客観的な、上のシャーレをインストールしてください。料理は買収が変更されそうで平坦であることを確認してください。関連する蛍光団によると、蛍光灯の電源を入れ、トランスフェクションされた細胞を可視化する。目的の細胞を漂白し、細胞毒性を最小限にするために、フィールドに入ると蛍光をオフにします。
5. 」を取得タブ」において、タグ·フルオロフォアの励起波長（EGFPタグ付きG3BPを使用しています我々のプロトコルでの488 nm）をに応じてレーザーを選択して、PMT（光電子増倍管）に適合し発光長を選択します。ノイズや過飽和ならびに毒性を最小限にするために、レーザパワー（通常は10％以上）を調整し、ゲインを設定し、信号対雑音比を変更するためのオフセット。レーザー博覧会（ライン平均2、フレーム平均1）の期間を最小限にするために（1,000 Hz）の高速スキャン。所望であれば、（1μmのZ工程は細胞に通常結構です）Zスタックのパラメータは3Dで画像を再構成することができるように設定してください。各収集間隔の時間を決定する：短い間隔は、より一貫したムービーを取得する許可が、これは（20秒の間隔を記載した実験に使用した）光退色および毒性を誘導することができる。総取得の持続時間は、応力の種類に応じて変えることができる。多くのG3BP含有SGSが亜ヒ酸治療では非常に急速に形成され、治療の1時間後によく見えるされています。その場合には、15の買収の合計時間で、右側のストレス後の買収を撮影し、開始するために、急速に細胞を選択 - いくつかのSGの組み立てを観察するの大部分は十分な20分。
6. 画像を保存し、ImageJソフトウェアを使用してスタックし、ムービーを再構築する。

結果

ストレス顆粒形成は、ストレス、アポトーシスの防止に関連し、クリアされるまで、停止した翻訳付き携帯適応を可能にする、ストレスに対する細胞の応答において重要である。このアッセイは、許可鍵のSGタンパク質成分（ 図1）の局在化に従うことによって、一次細胞でのSGを研究する。 G3BP、SGのアセンブリの主な要因は、培養されたMEFまたは神経細胞（ 図2AのAとC）の細胞質ではなく、拡散的に存在し、明確にMEFにおける亜ヒ治療だけでなく、神経細胞（ 図2A Bの下の個別の顆粒中に存在しているd）に初代細胞は、例えばそれらの成分の一つの非存在下でのストレス顆粒の研究を可能にする、トランスジェニックマウスモデルから得ることができる。興味深いことに、マウスでのG3BP1の欠乏は、特に運動失調P、中枢神経系の重大な欠陥につながると空間ワーキングメモリの変更（四肢留めテスト、 図2Bに見られるように）正しく動きを調整するために無能力によって特徴づけをhe...

ディスカッション

プロトコルの懸念の中で最も重要なステップ慎重に細胞毒性をダウン下げるために監視されなければならないトランスフェクション、より詳細には、時間の経過合併。

初代細胞の培養物であれば無菌状態が維持され、注意が切開および細胞分離ステップ中の損傷を防止するためにとられているように、困難な部分ではない。 MEFを初期の継代で凍結保存することができる。リン酸カルシウムによるニューロンのトランスフェクションは、ウェル^21を動作することが示されており、このプロトコルらは夏から適応^20は、トランスフェクションの良好なレベルを可能にする、しかし、それは、特定の細胞死を誘導することができる。これは、溶液のpHをチェックし、1時間を超えてはならないリン酸カルシウム沈殿、プラスミド、を有する神経細胞のインキュベーションを監視するために、培養後の数日以内にニューロンをトランスフェクトすることが重要である。光学顕微鏡で確認し、TRANを削除sfection媒体凝集が認められた場合。 DMEMで洗浄回数を増やすことができる。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12	Gibco	21331	プレウォーム 37°C;C
ピルビン酸ナトリウム	Gibco	11360
非必須アミノ酸	Gibco	11140
L-グルタミン	Gibco	25030
トリプシン	Gibco	15096
ガラス底 B-35	Greiner	627860/627861	処理の有無 (処理:接着細胞の接着を増加させる)
ポリ-L-リジン	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	37°Cの予温;C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	37°Cで予温;C
2-メルカプトエタノール	Gibco	31350
鉗子	Biotek	DU-110-A	非常に薄い、先端 0.1 mm (髄膜の除去に便利)
湾曲した鉗子	Biotek	P-110-BUF	非常に薄い、先端 0.1 mm
小型はさみ	Biotek	CM-85-BS
プラス トランスフェクション JetPEI 試薬の除去に役立ちます	Ozyme	101-10	MEFsトランスフェクション、フォワードプロトコールに従う
倒立型レーザー走査型共焦点顕微鏡	Leica	SP5

海馬ポリ