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Summary

卵·イン·ワーム（EIW）アッセイは、産卵行動を定量化するための有用な方法である。産卵の変化は、モデル生物の行動反応することができます<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em>このような病原性細菌によって生成されるものとして、潜在的に有害な環境物質へ。

Abstract

C. elegansの産卵行動は、浸透圧¹と振動²などの環境手がかりに影響されます。食品Cの合計がない場合に虫も産卵を中止し、その子宮³で受精卵を保持します。しかし、特に異なる食品の源、特に病原性細菌と産卵行動に腸球菌 、の効果は十分に特徴付けされていません。卵内ワーム（EIW）アッセイは、この場合にはE.、細菌の異なる種類の効果を定量化するための有用なツールであるフェカリス、産卵行動に。

EIWアッセイは、C.の子宮内に保持された卵の数を数える含むエレガンス ^4。 EIWアッセイは上演漂白、妊娠成人C.を伴うelegansのキューティクルを除去し、動物から保持卵を分離する。前の漂白に、ワームは、細菌（または環境キューの任意のタイプにさらされている）一定の期間。漂白した後、一方は非常に簡単にワームの子宮内部に保持された卵の数をカウントすることができる。 E.後の卵の保存では、このアッセイでは、定量化可能な増加フェカリス露光を容易に測定することができる。 EIWアッセイは、潜在的に病原性の細菌や環境毒素の存在についてスクリーニングするために使用され得る行動アッセイである。また、EIWアッセイは産卵行動がこのようなセロトニンやアセチルコリンなどの神経伝達物質^5-9によって変調であるため、シグナル伝達物質に影響を与える薬をスクリーニングするためのツールかもしれません。

Introduction

線虫（Caenorhabditis elegans）、顕微鏡、自由生活回虫は、伝統的に人間に、その透明な解剖学、十分に特徴付け開発、完全に順ゲノム、短い世代時間、および遺伝的相同性の発達と細胞シグナル伝達過程を研究するために使用されるモデル生物である。より最近では、C.エレガンスは、環境毒物学と先天性免疫^10、11の分野でモデル生物となっています。

これらの自己受精雌雄同体のワームは卵から孵化2〜3日以内に、性的に成熟したとなります。そのライフサイクル、C.中エレガンスは、成人に達する前に、4幼虫（L1〜L4）を通過する。 One孤立ふたなり、ピーク産卵から3日以内に、平均して、300子孫を生成することができます。生殖成熟したCでエレガンス雌雄同体は、受精卵が敷設される前に数時間のために子宮内に保持されています。ザ任意の一時点で子宮内に格納された卵の数は、通常の（ピーク産卵時）10及び15 ¹²の間である。子宮内の卵の数は、産卵率と産卵率の両方の関数である。受精卵は、外陰部¹³の開口部の周囲に配置された16外陰部の筋肉の収縮によって子宮から追放されています。ふたなり特有の運動ニューロン（HSNの）とVCの運動ニューロンのシナプス筋収縮に影響を与える外陰部の筋肉の上に、したがって、産卵行動^5,7,13,14。子宮から卵の追放は、ニューロンと筋肉の協調活動に起因して発生する。

C.のラボ文化エレガンスは 、通常非病原大腸菌 OP50の食事で育てています。自然環境、Cの線虫は、例えば病原性細菌などの食品、さまざまなソースに接触し、それは潜在的に有害であり得る。中の有害物質にさらされた場合環境、C.環境がより有利になるまで虫卵を保持します。おそらく、この卵の保持はその子孫を守るための努力です。

ワーム（EIW）アッセイでは、この卵で、C.エレガンスは 、潜在的に病原性細菌、環境で発見されている腸球菌を 、公開されています。 E.の病原フォームへの暴露フェカリスはCで永続的な腸の感染症や死を引き起こす可能性がありますエレガンス ^15。病原性細菌の他の形態への曝露は、しかし、効果を定量されなかった、卵の保持^16,17に影響^を及ぼすことが示されている。また、E.の軽度の病原性株の効果産卵行動に関するフェカリス 、すぐに致死でない株は、研究されていない。

EIWアッセイは、C.の子宮内に保持された卵の数を数える含むエレガンス ^4。にもかかわらずC.エレガンス透明であり、子宮内に蓄積した卵は、無傷の動物で定量化することは困難になる可能性があります。 EIWアッセイは妊娠成人Cを漂白関与一定期間細菌に曝露した虫 。漂白剤溶液は、背後に卵を残して外側のキューティクルを溶解する。卵は、保護卵殻の存在による漂白の効果に屈折率である。漂白した後、一方は非常に簡単に漂白時にワームの子宮から放出された卵の数をカウントすることができる。

記載されたアッセイは、一度に子宮に卵の数を定量化する、単純で安価かつ迅速な方法であるため、E.の影響を定量化卵の保持にフェカリス 。このアッセイは、卵の保持に対する細菌、環境毒素又は薬剤の他の種類の効果を定量化するために使用することができる。このアッセイはまた、病原性細菌のためのスクリーンとして使用される可能性を秘めている。

Protocol

1）線虫の増殖培地の調製（NGM）

1. 50プレートを作成するには、1.5グラムのNaCl、8.5グラム超純寒天、及び1 Lflask〜1.25グラムペプトンを追加します。
2. フラスコにのdH ₂ Oの487.5ミリリットルを追加します。アルミホイルの切れ端でフラスコの開口部を混合し、カバーするために静かに渦巻き。
3. 標準的な条件（121 PSI、120°C、20分）でオートクレーブして、ソリューションを滅菌。
4. 解決策は、水浴中で45℃に冷却することができます。
5. 5 mg / mlのストック溶液（エタノールに溶解）、500μlの1 M CaCl ₂を、500μlの1 M MgSO ₄を、そして12.5ミリリットルKPO ₄緩衝液（54.15グラムから500μlのコレステロール：溶液に、順番に次の行を追加します。のdH ₂ Oを500mlの中でKH ₂ PO ₄および17.8グラムK ₂ HPO ^_4）18に記載されているように。
6. 滅菌ピペットを使用して、各ポリスチレンを60mmペトリ皿に寒天溶液10mlを加える。メディアは室温overnで固化することを許可ightの。

BブロスE. 2）準備大腸菌メディア

1. 5を100mlの培養液を作るために、ビーカーにバクトトリプトン、2.5グラムの酵母エキス、5.0グラムのNaCl 5.0グラムを追加します。
2. 500mlを最終容量まで無菌蒸留水を加える。溶質が溶解するまで、撹拌しながら、ホットプレート上でソリューションを加熱。
3. 5ガラス瓶（少なくとも200ミリリットルの容積）にBブイヨンを100mlを注ぐ。
4. 標準的な条件（121 PSI、120℃、20分）でオートクレーブで解決策を滅菌する。
5. B液は使用前に室温まで冷却することができます。

3）種まきC.エレガンスメンテナンスプレート

1. NGMプレートは少なくとも1週間室温で乾燥させた後、E.のいくつかのコロニー〜と100ミリリットルBのブロス培養物を接種する大腸菌 （OP50）。
2. E.を育てる37℃で一晩大腸菌文化。
3. ピペットワンツー滴（約10081、L）OP50文化の各NGMプレートの中央に。プレートは、典型的には、蓋側を上に積層されている。 （播種）ピペッティングと、スタックの一番下にあるプレートに文化をピペッティングすることから始めます。各スタックの上のあなたのように動作します。文化は、プレートの端に近づきすぎていないことが重要であるので、播種後のプレートを移動しないようにしてください。
4. シードプレートは使用する前に、少なくとも1週間、室温で乾燥させます。
5. シードされたプレートを室温で密封されたプラスチック容器に（反転）が格納される。

4）C.を維持エレガンス菌株

1. よく供給C.を維持するためにelegansの株は、3〜4日ごとに新しい、シードNGMプレートに3 L4sまたは妊娠成人を移動するピックワームを使用しています。
2. ストアプレート（反転）は、好ましくはインキュベーター内部15℃ – 22℃記載のアッセイにおける文化20℃で保存した後elegansの開発は、温度依存性である。 maintenaとして温度が上昇NCE、発達段階の間の時間は減少します。

トリプシン大豆寒天（TSA）Eの5）の調製フェカリス文化メディア

1. ホットプレート上で、攪拌しながら50のプレートを作るために、滅菌したフラスコに、500mlの蒸留水を測定し、沸騰させる。
2. フラスコに粉末TSA寒天20gのを加え、溶液を溶解することができます。
3. 標準的な条件（121 PSI、120℃、20分）でオートクレーブで解決策を滅菌する。
4. 解決策は、水浴中で45℃に冷却することができます。
5. 滅菌ピペットを使用して、各ポリスチレンを60mmペトリ皿に寒天溶液10mlを加える。メディアが一晩室温で固化することができます。

トリプシン大豆ブロス（TSB）Eの6）の準備フェカリス文化メディア

1. 攪拌しながら250培養管を作るために、ホットプレート上でフラスコと暖かいに滅菌蒸留水500mlを測定します。 </lI>
2. フラスコにTSB寒天粉末15グラムを加え、粉を溶解することができます。
3. 標準的な条件（121 PSI、120℃、20分）でオートクレーブで解決策を滅菌する。
4. 滅菌、5ミリリットル試験管にその後ピペット2ミリリットル、室温まで冷却するソリューションを可能にします。

7）ストレプトマイシンと、E.のためのブレインハートインフュージョン（BHI）メディアの準備、 フェカリス文化

1. 滅菌フラスコに、500mlの蒸留水を測定し、ホットプレート上で、攪拌しながら、沸騰させる。
2. フラスコにBHI培地の26グラムを加え、溶液を溶解することができます。
3. 標準的な条件（121 PSI、120℃、20分）でオートクレーブで解決策を滅菌する。
4. ソリューションは℃の水浴中で45まで冷まします。
5. 無菌技術を使用して、10 mg / mlのストレプトマイシンストック溶液と混合する渦0.5 mlを加える。
6. 各60ミリメートルのポリスチレンシャーレに溶液10mlを加える。
<l私は>メディアが一晩室温で固化することを許可する。ストアプレート（反転）4℃で使用前に数時間までC。

8）E.を維持フェカリス菌株

1. E.を維持するフェカリス株は、独立したトリプシン大豆寒天（TSA）プレートにストリーク個々のコロニーを滅菌ループを使用しています。
2. 37℃で一晩培養液を育てる。数週間、室温で密封された袋や箱に保管プレート（反転）。

9）E.の準備EIWアッセイ用フェカリスプレート

1. E.のコロニーを2ミリリットルTSB文化を接種フェカリス 、37℃で一晩インキュベート℃、
2. E.のピペットを20μl フェカリス準備BHI-ストレプトマイシンプレートの中央に文化、そして37℃で一晩インキュベート℃、

10）E.の準備EIWアッセイ用大腸菌プレート（コントロールプレート）

1. の100ml B-仲間に接種E.の植民地と目文化大腸菌 OP50と37℃で一晩インキュベート
2. 非シードNGMプレートの中央にOP50文化のピペットを20μlと播いプレートは室温で一晩乾燥させます。

ワームアッセイ11）卵

1. 15ピック- 20上演-L4 C.準備BHI-ストレプトE.上の細菌の芝生の中央に虫 （ 図1） フェカリスプレート 。 BHIプレートにOP50の多くを転送しないように注意してください。 NGM-OP50プレートコントロールにL4s同じ数を選ぶ。
2. 20℃で40時間、プレートをインキュベート
3. 20％漂白剤溶液を準備します。蒸留水の適切な量と市販漂白剤（6.0％次亜塩素酸ナトリウム）を混ぜる。
4. プラスチックの蓋の上に10の個別の場所（ワームまたは細菌プレート）に漂白剤溶液10μl滴を追加します。
5. ワームピックを使用して、各漂白ドロップに1ワームを転送します。静かに渦の先端ワームは、ピックの先端を（解剖顕微鏡下で滴を表示することによって確認）洗い流されていることを確認するために漂白剤の液滴で選ぶ。
6. ワームは卵を（ 図2）追放、オープンバーストまでキューティクルが約10分間、または溶解することができます。プレートから卵を転送しないように注意してください。
7. 解剖顕微鏡を使用して、漂白剤の各ドロップで卵を数える。

Representative Results

Discussion

正常にこのアッセイを実施する中で最も重要なステップは次のとおりである：1）C.のよく供給銘柄を使用して正確に識別虫 、2）アッセイプレート上の細菌の培養、単一種類、3）E.への露出のためにL4ワームを上演フェカリス、4）Eに露光時間を維持するすべての試験および5にわたって一貫フェカリス ）漂白時間は卵の崩壊を防ぐために、10分を超えてはならない。

このアッセイのためには、健全な、よく飼育ワームを選ぶことが重要です。母性飢餓は子孫^19,20の繁殖力と成長に影響を与えることができ、したがって、それはワームがよくこのアッセイを実行する前に、いくつかの世代のために供給されていることが重要です。ワームのよく供給株式だけで簡単に2〜3日ごとに新しいシードNGMプレートにいくつ成虫を転送することによって維持されている。検定前に2日、成虫は、アッセイのために利用できる十分なL4子孫を持つためにOP50の新鮮な芝生の上に配置する必要があります。

<ウェブクラス= "jove_content">これは、EIWのアッセイプレートは、細菌の一タイプのみの成長を促進することも重要である。E.フェカリス菌株を BHIプレート上で増殖させた。ストレプトマイシンを大腸菌に対して選択するプレートに加えた彼らは、アッセイプレートにメンテナンスNGMプレートから転送されるL4ワームで転送された大腸菌 OP50、。 OP50もBHIプレート上に生えています。 、C.に対して選択されていない場合エレガンスは BHIプレート上ながら細菌の2つのタイプ（ 大腸菌及びE.フェカリス ）を餌になります。 E.の株このアッセイで使用フェカリスは、ストレプトマイシンに耐性がある。細菌の異なる種類このアッセイ、異なる抗生物質、おそらく異なる培地のために使用された場合は、選択した細菌を選択するために使用され、E.に対してすべきである大腸菌 OP50。

正確にこのアッセイのためにワームを上演を​​選択すると、いくつかの理由で重要です。まず、tの間に卵の保持をカウントすることが重要である彼は産卵の時/自己受精Cに敷設エレガンス 。産卵は、Cの最初の5日間のみ発生elegansの成人（40時間後にL4の周りピーク）かつ迅速にその後^4,21を拒否。受精卵を生産していないながら、成虫は2〜3週間の平均のために生きる、非常に多くの成虫は、少なくとも一週間のために生きる。したがって、EIWアッセイは年齢不詳のコミット予定していない成虫で実行されていないことを確認することが重要である。

それはEIWアッセイで動物を上演使用することが重要である第二の理由は、ワームが細菌にさらされてきた時、開発の時間、毒素または薬剤が厳密に制御されるようになります。 C.の文化エレガンスは通常卵、L1またはL4の段階で同期されます。 L4の段階があるため、Eに長い露光その懸念このアッセイに使用したワームは妊娠成人になる前フェカリスは致死性をもたらすでしょう。

10トン ">タイムワームの持続時間は漂白剤溶液中に残っているこの時間はワームからワームに変化はないものの、ワームは受精卵が最終的に漂白剤で溶解される。、通常は10分未満で溶解する必要があります。監視することも重要ですが、プロセス保護卵殻の存在のためにキューティクルのためよりも遅くなります。卵殻よりも長い10〜15分間溶液中に残っている場合漂白剤により溶解が開始されます。

卵の保持は産卵と産卵の間のバランスを反映している。独りEIWアッセイは、子宮内に保持卵数は産卵や産卵の変化によるものかどうかを区別しません。細菌株または毒素で処理したワームが対照群に比べ少なく卵を保持する場合、これは特に問題である。特に、これらのケースでは、フォローアップのひなサイズアッセイを行う必要があります。ひなサイズアッセイは、ワームの生殖寿命⁴上で産卵数を定量化</sup>。実験群と対照群のワームのひなのサイズが同じであれば、卵性に差が産卵動作の違いに起因することができる。それは考えにくいので、そのようなE.穏やかに病原性菌株フェカリスは、卵の生産を増加させるために行動するでしょう、それが仮定するのが妥当であるE.への曝露後の卵の保持の増加フェカリスは、（ 図3に見られるように）減少した産卵行動の結果である。

EIWアッセイはまた、細菌が卵の保持を変更することができるメカニズムを決定するものではありません。それが可能であることでそれは貧しい食料源であるため、病原細菌が植民地にして口の開口部をブロックしたりすることにより摂食に影響を与えるため、 虫卵を保持することができる。それは細菌がコロニー形成し、外陰開口部を塞ぐ、または産卵系の細胞の機能に影響を及ぼす可能性もある。さらなる分析は、WHIのメカニズムを決定するために必要とされるchの卵の保持が変更される。

このEIWアッセイを容易に卵の保持に対する化合物の多くの種類の効果を決定するために変更することができる。また、このアッセイは、病原体の効果のために必要な宿主（C.エレガンス ）または病原体（E.フェカリス ）に、遺伝子を同定するための画面に組み込むことができることを十分に単純である。 EIWアッセイはまた、産卵そのもの。C.を調節するために必要な遺伝子をスクリーニングするために使用することができるelegansの産卵行動は、このようなセロトニンやアセチルコリンなどの神経伝達物質^5-9で変調され、いくつかの神経細胞や筋肉群¹²の協調活動を必要とします。 EIWアッセイは、神経伝達物質となってシグナリングおよび/または筋肉の活動のために重要な遺伝子を同定するために使用され続けている。 EIWアッセイは、重要なCの定量的ではなく、質的よりも、分析を提供elegansの行動。

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
<em>C. elegans</em>, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for <em>C. elegans</em>	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for <em>E. faecalis</em>	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
<em>E. coli </em>(OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
<em>E. faecalis</em> strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
<p>all strains grew at 44.5 &ordm;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&nbsp;<span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-&alpha;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p>
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000