最適化と利用のアグロバクテリウム媒介一過性タンパク質産生タバコ

植物は現在、異種組換え生物医薬品を製造するための、安全で信頼性が高く、拡張性の高い、安価なプラットフォームとして認識され、工業用タンパク質^1-3及び微生物や動物細胞発現系⁴を介して重要な利点を持っている。植物は、組み立てられた多量体抗体^5-7を含む翻訳後修飾、と正しく折り畳まれたタンパク質を発現することができる。いくつかの植物由来の組換え医薬タンパク質は、臨床評価^8を受けている。これらは、非ホジキンリンパ腫^9、赤血球凝集素ベースのパンデミックと季節性インフルエンザワクチン候補^10,11（カミングスら、Vaccineに提出）、抗連鎖球菌表面抗原Iの治療のための患者特異的組換えイディオタイプワクチン（scFv）を含む糖尿病の治療のために¹³虫歯^12、およびヒトインスリンの治療のために/ II抗体。さらに、ヒトRECOゴーシェ病患者の酵素補充療法のためのmbinantグルコセレブロシダーゼは、イスラエルと米国で承認され、米国の^14,15の外に拡大アクセスプログラムの下で提供されています。

異種タンパク質は、安定的に形質転換（トランスジェニックまたはtransplastomic）または一過性に形質転換植物で生産することができる。一過性のタンパク質産生、発現および蓄積^16を達成するために、短い時間枠を含む、トランスジェニック植物において産生に比べていくつかの利点を提供し、植物組織⁴内細菌バイナリーベクターまたは組換え植物ウイルスベクターを導入することによって達成することができる。最も先進的な一過性発現系は、植物ウイルスおよびバイナリプラスミドの成分を組み合わせ、アグロインフィルト^17,18によって送達される「発射ベクター」の使用に基づいている。 タバコモザイクウイルス （TMV）に基づいて、発射ベクターのアグロ浸潤が正常に研究室で適用されている例えば、ヒトパピローマウイルス^19、 ペスト菌 ²⁰などの病原体に対するワクチン抗原を産生するように拡張、インフルエンザは^21,22、 炭疽菌 ^23をウイルス、およびNに天然痘ウイルス²⁴ ベンタミアナの葉。 アグロバクテリウムによる一過性発現は、複数のタンパク質^2,25-27の同時生産のための有望な方法である。例えば、植物一過性発現系は、腫瘍特異的な組換え抗体^28,29、上皮細胞増殖因子受容体³⁰に対するグリコシル化組換え抗体、および炭疽菌防御抗原^31,32に特異的なモノクローナル抗体を産生するために使用されてきた。標的遺伝子および強化標的タンパク質発現^33,34における遺伝子サイレンシングのサプレッサー結果とベンサミアナタバコ植物の同時浸潤。

アグロ浸潤が均一introduするための一般的な方法です。植物組織^35〜37に目的の遺伝子を保有するcing細菌。無傷の植物における一過性の遺伝子発現のための葉のアグロバクテリウム減圧浸潤は、トランスジェニック植物^38-41を生成する必要なく、外来タンパク質の産生のために、迅速なスケーラブル、かつ有用な方法である。真空アグロ浸潤の間に、植物が逆さまに反転され、地上部は、 アグロバクテリウム懸濁液中に沈め。その後、真空をガスが気孔を通して葉細胞間隙から避難させる適用されます。葉へのアグロバクテリウム懸濁液の注入の真空結果の迅速な再加圧以下のリリース。 アグロバクテリウムの減圧浸潤に続いて、植物はさらに栽培されており、ターゲット式が監視されている。ターゲット発現の最高レベルは、通常、2〜3日は、バイナリーベクターと発射ベクターと4-7解像度と浸潤（DPI）、後の発現量、通常decreaを投稿観測されるゲ^{17,18,42-45。} アグロバクテリウム·ツメファシエンスは、タンパク質産生のために植物に目的の遺伝子を送達するための最も広く使用されている車両である。アグロ浸潤はNに非常によく動作しますベンサミ比較的貧弱シロイヌナズナ ⁴⁶を含む他のほとんどの植物にある。

本研究では、5〜6週齢のN.過渡タンパク質生産のための、単純、効率的、かつ経済的な方法を開発A.を用いてベンサミアナ浸潤ツメファシエンス 。 （N-モルホリノ） -アグロインフィルトレーション法の工業的スケールの主な欠点は、採取し、細菌および4'-ヒドロキシ-3 '、5'-ジメトキシアセトフェノン（アセトシリンゴン）、単糖類、および2を含む培地で細菌ペレットの再懸濁、遠心分離である-エタンスルホン酸（MES）vir遺伝子の誘導のためのバッファ。我々は、 アグロバクテリウムを最適化することによりこれらの問題を克服することができたN.中の標的タンパク質の産生を比較しました。 ベンサミアナとNエクセルシオールだけでなく、ハイブリッドNにexcelsiana。

1。植物栽培

その後のアグロ浸潤のために我々は2つの野生型タバコ種（N.ベンタミアナおよびN.エクセルシオール ）と室内施設でロックウールで水耕栽培ハイブリッド（ 髄膜excelsiana）を評価した。

1. 植物肥料溶液中でロックウールスラブを浸す。
2. 野生型Nの種をまくベンサミアナ、N.エクセルシオールとN栄養素に関するexcelsiana（N.エクセルシオール×N.ベンタミアナのハイブリッド）ロックウールの表面を浸した。
3. のために制御された条件（24℃、40から65パーセントの相対湿度）の下で種子から植物や（130〜150μEmの照明で14時間の明および10時間の暗闇^、-2秒^-1）、長日光周期を育てるNの4-5週間ベンサミアナとN excelsiana、およびNの5-6週間エクセルシオール。

Agroinfiltratのためのベクターの2。建設イオン

1. インフルエンザウイルス（HAC1）のA/California/04/2009株から合成レポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質[GFP]）、フルレングスの赤血球凝集素（HA）を挿入し、再設計リケナーゼ酵素^{（LicKM）18}を別々にpBID4-GFP、pBID4-HAC1とpBID4-LicKM、それぞれ^{18,32,41,47を}取得するために打ち上げベクトルpBID4 ^18（TMVに基づいたベクトル）。
2. Aのエレクトロ細胞内にGFPまたはHAC1を運ぶpBID4 10〜50 ngのご紹介Aのエレクトロ細胞へツメファシエンス GV3101株とLicKM ツメファシエンスは、遺伝子MicroPulserのエレクトロとGV3101、C58C1、GLA4404、AT06、AT10、At77とA4菌株。
3. 特に断りのない限り、浸透実験のために変換されたアグロバクテリウムを使用してください。

3。 タバコ植物にアグロバクテリウムの浸潤を掃除

1. A.を育てるLB培地、YEB MED IN（O / N）の株を一晩ツメファシエンスイウムまたはAB培地は、200〜250 rpmで振盪しながら28℃でカナマイシンを50mg / L添加。
2. 4,000倍で又はYEB若しくはLBで増殖させたAB 0.5又は遠心アグロバクテリウム細胞の600nmの光学密度のMilli-Q水_（600mL）中の希薄なアグロバクテリウム 4℃で10分間、gは_0.5〜600誘導培地（1×MS塩、10mMのMES、200μMのアセトシリンゴン、2％スクロース[MMA]）に再懸濁し、1〜3を室温で撹拌人事、いない限りは、特に記載がない。
3. アグロバクテリウム懸濁液中にタバコ植物の空中組織を浸すと30または60秒間50〜400ミリバールの真空を印加することにより真空チャンバ内の植物を浸潤する。最適な浸潤は、日常的に60秒間50〜100ミリバールで適用される。
4. 真空が破壊されると、水中ですすぎ、真空チャンバから植物を取り外し、プレ浸透成長のために使用されるのと同じ成長条件下で5-7日間増殖。
5. 有効性をテストするにはアグロバクテリウムのvir遺伝子は、アセトシリンゴンの異なる濃度（0、100、200または400μM）誘導化学物質の浸潤バッファー（1×MS、10mMのMES、2％グルコース）に懸濁アグロバクテリウムに添加した。のvir遺伝子は、グルコースの異なるパーセンテージ（0,1,2、または4％）の誘導に対する単糖の影響を浸潤緩衝液（1×MS、10mMのMES、200μMのアセトシリンゴン）中に懸濁アグロバクテリウムに添加した。N.ステップ3.3および3.4）で上記のようにベンサミ植物を浸透させた。
6. アグロバクテリウムの研究室では、GV3101、C58C1とLBA4404菌株とpBID4-LicKMベクターを有する野生株、A4、AT06、AT10、そしてAt77は0.5の₆₀₀にミリQ水で希釈した。N.ベンサミ植物は、ステップ3.3および3.4で前述したように、それぞれ特定の株を浸潤させた。

ウイルスサイレンサプレッサのため4。共同アグロインフィルトレーション手順

1. MGFP遺伝子と1:1、2:1,3:1および4:1の比率でトマトブッシースタントウイルス （TBSV）のウイルスサイレンシングサプレッサーP19を運ぶミリQ水で薄めたアグロバクテリウム GV3101培養IX。 N.潜入上記のようにベンサミアナ植物 。
2. N.潜入 2ミリQ水で薄めたアグロバクテリウム GV3101培養の混合物とベンサミアナ植物：pBID4-HAC1のプラスミドを有する第一及びサイレン抑制のいずれかを運ぶ二- TBSVのP19やシトラストリステザウイルスのP23、pCasspプラスミド中の（ pCassp19）と比4:1でそれぞれ35Sプロモーター（PGR-P23）の下でPGRバイナリープラスミド、で。

5。ウエスタンブロット分析

1. Nからランダム葉のサンプルを収集ベンサミアナ、N.エクセルシオールまたはN excelsianaの 4-7 dpiで植物や微粉末に液体窒素中で粉砕。
2. 0.5％のトリトンを含有する1×PBS緩衝液の3つのボリュームの追​​加X-100を各サンプルに。
3. 静かに4℃で15分間抽出したサンプルを振る
4. 5分間の抽出物をスピンし、清潔なエッペンドルフチュー​​ブに全可溶性タンパク質を収集します。
5. 1×PBS抽出緩衝液中で適当に希釈した（1:50〜1:100）に抽出物を希釈し、5×試料緩衝液（250mMのトリス-HCl [pHを6.8]、10％SDS、0.5％ブロモフェノールブルー、50％グリセロールを追加最終1×濃度にV / V、および500のDTT）。
6. 5分間沸騰サンプル。
7. 10％SDS-PAGEによってタンパク質を分離するには、イモビロン-Pトランスファーメンブレンに転写し、0.5％I-ブロックにブロックする。
8. 1時間ブロッキング溶液で1:1000に、マウス抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を用いて1:5,000およびHAC1でウサギポリクローナル抗GFP抗血清を用いてGFPを検出する。
9. 一次抗体標識後、1×PBST-20で膜を10分間各3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼと共にインキュベート（HRP） - 結合1:5000の抗ウサギ抗体またはHRP-コンジュゲートD抗マウス抗体1:10,000でそれぞれGFP及びHAC1検出のための1時間、のため。
10. スーパーシグナルウェスト·ピコ化学発光基質を用いてウエスタンブロットを処理します。
11. タンパク質のバンド強度を分析し、バンドに校正量を得るために、GeneToolsソフトウェアを使用してください。

タンパク質生産：（サンプルの校正済み数量×希釈）/ロードしたサンプルの量）が4 = mg / kgでのX。
式：タンパク質産生（P）、キャリブレーション量（C）、試料の希釈（D）とサンプル装填（S）の量。

6。ザイモグラムアッセイ

1. pBID4-LicKM浸潤Nを集めるベンサミランダム組織サンプル。
2. ウェスタンブロット分析のために上述したのと同じ方法を用いてタンパク質を抽出した後、0.1％リケナンで10％SDS-PAGEによって分析し、ゲルに含まれる。
3. 電気泳動後、100mMのトリス-HCl [pH8.0の]及び0.1％トリトンX（洗浄緩衝液中で10分間ずつ2回ゲルを洗浄-100）、次いで1時間65℃で洗浄緩衝液中でインキュベートする。
4. インキュベーション後、洗浄緩衝液を廃棄し、室温で5分間、0.5％コンゴーレッドでゲルを染色する。
5. ミリQ水にゲルを10分間ずつ3回すすぎ、そしてリケナーゼ活動を可視化するために1MのNaClを追加します。精製された細菌リケナーゼ蛋白質は、酵素活性の陽性対照として使用した。

7。のGFPイメージング

1. ハンドヘルド長波長UVランプを用いて全体の一過性形質転換植物におけるGFP蛍光の視覚的検出を行う。
2. 写真は一過性黄8を介してデジタルカメラで植物を形質転換し、52フィルタ（露光時間、15秒）ES。
3. ウエスタンブロットの画像を取得するGeneGnomeにGeneSnapソフトウェアを用いて解析し、精製したGFP規格に基づいて検量線と、GeneToolsソフトウエアを使用して結果を定量化する。
4. purifiに基づく検量線を使用して、HAC1タンパク質を定量するインフルエンザウイルスのA/Indonesia/05/05株由来HACタンパク質標準エド。
5. 3から4の平均値を計算するには、すべての実験のために複製されます。

植物の成長のための栄養要件。水耕植物成長培地（ロックウール）及び栄養溶液の使用は、N.の均一性を確実にするベンタミアナ成長と植物栽培用の土を使用することに関連する複雑さ（機械的規制や効率）がなくなります。我々はNの増加となりましたロックウールスラブ上ベンタミアナ植物の成長およびバイオマス蓄積のための最適条件を決定するために、市販の肥料に浸漬した。我々はの95〜100％の種子発芽を観察した。我々は、リンを欠いた栄養液を発芽およびNの成長をサポートするために失敗したことがわかったので、一つは、リンを含む発芽を達成するために重要であることに注意してくださいベンサミアナタバコ種子（ 図1A）。

アグロバクテリウムの成長と植物の健康とタンパク質産生に浸透メディアの影響は。我々は、Tの効率を最適化するために、いくつかのメディアの状態をテストした大規模生産のために、彼はアグロインフィルトレーション法。細菌（A.は GV3101株ツメファシエンス ）pBID4-GFP構築を保有するが、異なる培地条件（YEB、LBまたはAB）でO / Nを培養し、（1×ムラシゲ＆を含む遠心分離し、誘導培地（MMA）に再懸濁のいずれかであったスクーグ[MS]基礎塩混合物、10 mMのMES pHは5.6、20グラム/ Lスクロース及び200μMのアセトシリンゴン）または植物の浸透のために使用する前に、0.5の600にミリQ水で希釈した。私たちは、水で希釈した細菌と植物の真空浸潤は以前の報告42,48内の任意の浸透メディアで達成されたものに匹敵するタンパク質生産をもたらしたことを観察した。これとは対照的に、YEBまたはLB培地で増殖させた希釈していないアグロバクテリアとの浸潤がNの完全しおれの結果AB培地で増殖させた未希釈のアグロバクテリウム浸潤植物の健康に影響を及ぼさなかったが 、一方ベンタミアナダット（未満、24時間後の浸潤葉）示されていない。 図1Bに示すように、（0.6〜0.8又は1:10 1:5 600、0.3〜0.4の600）を示したYEB、LB又はAB培地で増殖させたアグロバクテリウム培養物で浸潤およびミリQ水で希釈した植物症状および。 アグロバクテリウムを遠心分離し、誘導培地（MMA）中に再懸濁し、それぞれ、1645、1520および1839の平均GFP産生を示したが、症状を示さず、タンパク質産生に有意差はアグロバクテリウムに比べていない直接（Milli-Q水で希釈したそれぞれ1671±102および1667±131 mg / kgで、）。そのため、ミリQ水は、植物の浸透のためのアグロバクテリウム培養を希釈するために推奨されており、日常的に0.5の600を達成するために私たちの、その後の実験に使用した。

標的発現に対するアグロバクテリウム懸濁液の細胞密度及び経時変化の影響は、我々 は 、次の場合を調べ、細菌細胞密度浸潤および標的発現のレベルの効率に影響を与える。この目的のために、我々は、pBID4-GFPを担持するアグロバクテ 4つの異なる細胞懸濁液の密度、600 1.0、0.5、0.1および0.05を評価した。次の浸潤、N.ベンサミアナ植物を4,7および10 dpiでサンプルを収集することによって目に見える症状の発生および標的発現の時間経過をモニターした。 4 dpiで、我々はない（GFP発現は0.05の600で観察されなかった）、アグロバクテリウムの異なる細胞懸濁液密度で浸潤植物間でGFP蛍光の顕著な違いを観察した。 7 dpiで、GFP蛍光は600 1.0、0.5および0.1の細胞懸濁液密度で浸潤植物において類似していたが、0.05のA 600で浸透させた植物に低かった。 図1Cに示すように、これらのデータは、ウエスタンブロットによって確認された600で、非常に低いタンパク質産生を示し、4 dpiで採取したサンプルの分析600（1739 mg / kg）の少なくとも最高。 0.05の600は、下のGFP生産（1,199 mg / kgの）を示しながら、7 dpiで、植物は、（それぞれ1662、1870および1890、）1.0、0.5と0.1の600で推定GFPの生産に有意な差は認められなかった。これとは対照的に、10 dpiでのGFPの生産に差は4細胞懸濁液密度（1,218、1,181、1,197および1304）のいずれかを浸透させた植物の中では観察されなかった。

アグロバクテリウムの別の株と浸潤。一過性タンパク質生産のための利用可能なアグロバクテリウム株の多様性を増大させるために、我々は、野生型単離株を試験した。自然宿主のクラウンゴールから分離され、これらの株は、親切に博士Gelvin（パデュー大学、ウェストラファイエット、インディアナ州）から提供された。一過性タンパク質生産におけるそれらの有用性を調べるために、我々はNに潜入以下の株·カーとベンサミ英pBID4-LicKM 18：A.リゾゲネス （A4）とA.ツメファシエンス野生型巣作りをする鳥は、A348、A208、およびA281（それぞれ、AT6、AT10、およびAt77という名前）だけでなく、Aの設計実験室株を株ツメファシエンス GV3101、C58C1、およびLBA4404。浸潤葉は7 dpiで集めた後、LicKM発現のレベルは、ウェスタンブロットアッセイによって推定した。 図2Aに示すように、LicKM産生の最高レベルは、わずかな違いが、（それぞれ、163〜1,750±1,650±1,450±26及び117 mg / kg）の菌株GV3101、A4およびLBA4404で達成することができ; C58C1を持つ式の最低レベル（〜900±102 mg / kg）を; （それぞれ〜1250±19、1100±42および1200±111 mg / kgで、）AT6、AT10とAt77中間生産。リケナーゼ酵素活性は、ザイモグラムアッセイを用いて実証された。 図2Bのいずれかを使用して、浸潤植物組織において産生さリケナーゼことを示しているアグロバクテリウム株は、酵素的に活性であった。一つには、A4およびAt77株で浸潤することN.benthamiana植物に注意してくださいAT10と症状を痛めながら軽度であった、（発育阻害、葉柄の伸長やカーリング、葉のカーリング）病理学的症状を示した。症状は、実験室株のGV3101（ 図2C）を浸透させたN.benthamiana植物観察されなかった。

代替タバコ種の浸潤。我々はN、ニコチアナ属（N.ベンタミアナおよびN.エクセルシオール ）の2つの野生型の種で、ハイブリッド種でバイオマス発電とタンパク質生産の速度を比較したexcelsiana（N.エクセルシオール×N.ベンタミアナ ）。テスト種、Nのベンサミアナタバコ 、 アグロバクテリウムベースまたはウイルスベースの発現系を用いた一過性タンパク質産生のために広く使用されているホスト2,34,49、発芽の4〜5週間以内に浸潤準備に達する。バイオマスの最適なレベルを生成するために必要な成長期間もN. 4-5週間であるexcelsianaしかしNの（6-7週間）長いエクセルシオール 。また、植物の節間は、N.ために比較的短いエクセルシオールは、他のタバコ種に比べて。

さらに、我々は、N.の減圧浸潤を観察したベンサミアナとN N.ながら60秒間、50〜250ミリバールでexcelsianaは 、全体の葉のアグロインフィルトレーションのための非常に効率的であるエクセルシオールは、真空は、例えばSillwet-77またはS240のような非イオン性界面活性剤の存在下で1分間ずつ3回適用した場合であっても、それらの下側キャノピと革の葉に浸潤することは困難である。また、Nの発芽率excelsianaとNエクセルシオール種子は〜40から50パーセントであった。 90〜100％に発芽率を増加させるために、種子を10％bleaで処理しなければならない播種前に1時間CH。同一の成長条件、N.から生成することができる最高の葉バイオマスの下excelsianaは約2倍高いNと比較され、 ベンサミ （ 表1）。

タンパク質産生は、N.において調べたベンサミアナ、N.エクセルシオールとN pBID4-GFPを保有するアグロバクテリウム株 GV3101で浸潤excelsiana。 GFPの蓄積は、ウェスタンブロット分析、続いてUV光を用いて全体の浸潤葉における7 dpiで評価した。 図3Aは、N.におけるGFPの均一な分布を示してベンサミアナとN. excelsianaとNに偏在（原因N.エクセルシオールの全葉面積を浸透させることの難しさに） エクセルシオール 。 図3Bは、7 dpiで3 タバコ種から収集された浸潤葉にUV光を照射することによって推定GFP産生のレベルを示しています。 GFPを培っlationレベルはNに高かったNに比べてベンサミ （〜2.23グラム/キログラム） excelsianaとNエクセルシオール （〜1.89及び1.54グラム/ kgで、それぞれ）。 N.におけるタンパク質産生の低レベルエクセルシオールは、不均一な浸潤と収集、葉に蓄積されたGFPの分布に起因している。

私たちは、直接光に露出された上部の葉は、多くの場合、天蓋の下葉より（2-4 dpiで）一過性のGFPの蓄積の初期の最高レベルを示すことを観察した。しかし、我々の研究では、GFPの蓄積は7 dpiで最も高かったとはGFPの蓄積を示さないuninfiltrated新たに成長した葉を除いて、ほとんどの葉が均等に分布していた。

一過性のタンパク質産生。真空浸潤に対する真空圧力および持続時間の効果が有意に無針注射器42に手による注入により適用される圧力と比較し、一過性発現レベルを増加させる。の適用真空が水没工場から排出するガスが気孔を通して葉が発生します。真空が破壊され、圧力が急激に増加すると、 アグロバクテリウムの懸濁液を排気ガス50を置き換えるために、葉へ駆動される。

N.の葉の真空圧力の効果を試験するためにベンサミ 、我々は30または60秒のための様々な真空圧（50-400ミリバール）でpBID4-GFPを保有するアグロバクテリウム株 GV3101を植物に浸透さ。これは、（50ミリバール未満）、より強い真空がまもなく浸潤（24〜48時間）後の組織しおれや植物の死につながる、浸透させた葉の機械的損傷に30または60秒の結果に適用することが示された。一方、わずか50葉面積の％とGFPの生産（303±90 mg / kg）を（ 図4A）の減少したレベルの浸潤の穏やかな真空（400ミリバール）の結果を適用する。重要なのは、我々は50、10の下に、GFPの生産に差が認められなかっ0と200ミリバール（1,651±107、1688±40、1594±26 mg / kgで、それぞれ）（ 図4A）と軽度のない、植物の健康に有害な影響50-200ミリバールから真空圧を30または60に適用した秒。そのため、真空圧力の50〜100ミリバールが浸透実験のために推奨されます。

ターゲット式の真空の期間の効果はNの1平らな浸潤することによって評価したベンサミ工場 pBID4を保有GV3101の0.5 Aの600で毎時間- 。同じアグロバクテリウム培養液中の8時間GFPは、 図4Bは、GFP産生のレベルは同じようにすべての時間を示唆し、8時間後までのポイントであったことを示して、このオーバー期間アグロバクテリウムは、一本鎖DNAを起動する能力を維持する。

タンパク質生産上の化学的誘導の効果。特定の植物のフェノール性代謝物および糖は、indはできAのUCE病原性遺伝子1,52 ツメファシエンス 。結果として、多くの化学物質およびmonosaccharaidesは、種々の植物種における一過性タンパク質産生を増強することが報告されている。アセトシリンゴンは、最も一般的にはA.の培養物に添加するアグロ浸潤40,53-57前VIRオペロンを誘導するためにツメファシエンス 。

我々は、N.における過渡GFPタンパク質の産生に対するシリンゴンの異なる濃度（0、100、200、および400μM）およびグルコース（0〜4％）の効果を評価しているGFP - pBID4を保有するアグロバクテリウム株 GV3101で浸潤ベンサミ 。この目的のために、我々は、浸潤前に1-3時間アセトシリンゴンおよびグルコースの異なる濃度を含有するMMA誘導培地中のアグロバクテリウム細胞を再懸濁した。両方の目視観察した（データは示さず）およびウエスタンブロット分析（ 図4C）、試験した濃度のいずれの結果によれば、これらの化合物から誘導培地は、アセトシリンゴンないまたはグルコースを含有しない対照と比較してGFP蛍光またはタンパク質産生の有意な増加を誘導した。

N.におけるGFPおよびHAC1遺伝子の一時的生産へのサイレンシングサプレッサーの共同浸潤の効果ベンサミアナタバコ葉 。それは、以前にレポータータンパク質34の増強された産生をもたらす、サイレンシングサプレッサー（ トマトブッシースタントウイルスのp19 [TBSV]）転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）と干渉の共発現が実証されている。

我々は、N.の共浸潤の効果を評価したGFPレポーター遺伝子（pBID4-GFP）およびp19の発射を担持するベクターでベンタミアナ 。浸潤、Aの600 0.5の希釈に先立ちpBID4-GFPおよびP19を保有ツメファシエンス GV3101培養物を、それぞれ1:1,2:1,3:1および4:1。エクスプレスの割合で混合したサイレンシングサプレッサーのイオンは、 カリフラワーモザイクウイルス 35Sプロモーターにより制御した。 7解像度（ 図5A）でのウェスタンブロット分析の結果によって示されるように、p19の存在下では、N. GFP産生を増加または減少させなかったベンサミ 、2 アグロバクテリウム懸濁液の任意の割合で。

p23andのP19 - - HAC1のためのPTGSの防止に関する我々はまた、2つのウイルスの遺伝子サイレンシング抑制の効果を比較しました。発射ベクターpBID4-HAC1（H1N1 A/California/04/2009）および2つのウイルスのサイレンシングサプレッサープラスミドのいずれかを保有するアグロバクテリウムの培養物は、それぞれ、0.5のA 600に希釈した4:1の比率で混合し、そして4〜5週齢のN.に共浸潤ベンサミ 。 AのサスペンションpBID4を運ぶツメファシエンス- HAC1を一人でコントロールとして浸透させた。浸潤葉試料を、3〜8個の解像度から収集した。実験はREPEたHAC1発現のated 3回の平均レベルは、ウェスタンブロット分析によって決定した。

図5B、Nの共同浸潤で実証されるようにP23やP19とベンサミアナ （それぞれ、642±157および764±108 mg / kg）をもたらした6 dpiでないサイレンシングサプレッサー（それぞれ約15から25パーセント）を用いていないと比較HAC1生産の増加。これはP23とP19は、我々のシステムで効率的であることを示唆している。しかし、pBID4-HAC1はP19と同じ場所に浸透させたときのHAC1の蓄積は日早く発生したことに留意すべきである。したがって、我々の結果は、HAC1上のサイレンシングサプレッサーp19およびGFPの蓄積の効果は一過性の発現および/ ​​またはN.におけるいくつかのタンパク質の安定性の選択的増強を示唆して異なっていることを証明するベンサミ 。

我々はまた、その存在下およびサイレンシングサプレッサーの不在HAC1タンパク質prodにレベルの両方において観察されはじめは、7 dpiで減少し始めた。これは発射ベクターで浸透させたN.benthamianaの一過性タンパク質生産の減少のタイミングは、標的特異的であることを示している。

発射ベクターを有するアグロバクテリウムの細胞バンクは、標的遺伝子の安定性、 アグロバクテリウムの生存率およびタンパク質の蓄積のレベルについて毎年評価した。 -80℃で保存したpBID4-HAC1で形質転換GV3101株の細胞バンクのグリセロールストックを浸潤N.における一過性タンパク質産生のレベルの変化なしで3年以上非常に安定であることが示されている。 図5Cは、HAC1タンパク質の生産は2010年、2011年、2012年および2013年の年間でウエスタンブロット法により推定されたことを示してベンサミアナ植物は、それぞれ、670、685、566および683 mg / kgであった。 N.平均HAC1生産ベンサミアナ植物を、651±49.4 mg / kgであった。

図1 N.における一過性の遺伝子発現のウェスタンブロット分析ベンサミ。（A）6週齢のN.ベンサミアナ 1）4.8％のリンを含有する肥料溶液中で生育する植物及び2）植物は0％のリンを含有する肥料溶液で成長する。新鮮な葉の重量と同等の二十5μgのレーン毎にロードした。GFP生産の（B）の比較pBIDを浸透させた植物の真空中で3別の培地で増殖させた4-GFP-宿すアグロバクテリウム GV3101培養：YEB、ABとLB。 YEB若しくはLB培地中でO / N増殖さGV3101培養物を低速で遠心分離し、誘導培地（MMA）中に再懸濁した（レーン：MMA-1とMMA-2のそれぞれ）した、又はYEBにO / Nを成長させ、LB又はAB型のメディアと直接1:5ミリQ水で1:10に希釈した（レーン：YEB / 5とYEB/10、AB級/ 5とAB/10、LB / 5とLB/10）（C）の比較。 A.種々の濃度の（600 1.0、0.5、0.1および0.05）を有する真空浸潤次の4,7および10 dpiでGFP発現のpBID4-GFPを運ぶGV3101株ツメファシエンス 。

図2。Nの真空浸透次過渡リケナーゼの生産と活性の比較diffeとベンサミ工場アグロバクテリウムの株を借りる。 アグロバクテリウム株 （GV3101、A4、At77、C58C1、AT6、AT10とLBA4404）の文化pBID4-LicKMがNの葉に個々に浸透させた発射ベクターを有するベンサミ 。浸潤葉は7解像度で収集した。ウェスタンブロッティングによって定量化（A）リケナーゼ製造。（B）ザイモグラムアッセイ法、酵素活性を介してリケナーゼ産生を実証する。（C）、アグロバクテリウムの効果（野生型A4、AT10、At77および実験室株GV3101） N上の浸潤7 dpiでベンタミアナ植物の健康。新鮮な葉の重量と同等の二十5μgのレーン毎にロードした。

図3。Nの葉において一過性GFP発現benthamiaAと真空浸潤後7 dpiでのN. excelsianaおよびN.エクセルシオール、NA GFP -発射ベクトルpBID4を保有·ツメファシエンス 。 GFPの蓄積のUV光下での（A）GFP発現の目視検査。（B）ウエスタンブロット分析。

図4一過性GFP発現および植物の健康上の真空圧の（A）効果。N. 30または60秒の真空保持時間で、400、200、100または50ミリバールの真空圧力下でGFP A.の（B）安定性および感染性-ベンサミアナ植物をpBID4で浸潤した。 Nにツメファシエンスベンサミアナタバコ、アグロバクテリウム GV3101をpBID4-GFPをAB培地で増殖させ、0.5のA 600に希釈宿すで浸潤。 AgroinfiltrationはNの1平らな浸潤することにより行った同じ希釈されたアグロバクテリウム培養中のベンサミ工場毎時間（レーン0-8）。（C）GFPの一過性の発現に及ぼすシリンゴンとグルコースの異なる濃度の影響。 pBID4を保有するアグロバクテリウム株 GV3101は- GFPは総合格闘技で0,100、200または400μMでゴン2％グルコースを含む、あるいはMMAで200を含むいずれかの0.5のA 600に遠心分離し、再懸濁し、YEB培地でのO / Nを成長させたμMアセトシリンゴン、0,1,2又は4％のグルコースを含む。 アグロバクテリウム懸濁液は、浸透前に室温で3時間保持した。

図5。N.における過渡タンパク質生産上のサイレン抑制の影響ベンタミアナの葉。 （pBID4-GFPの共浸潤と異なる比でのp19の後GFPタンパク質の）ウェスタンブロット分析。 7解像度（新鮮葉重量当量25μgのは、レーン毎にロードされた）。（B）pBID4-HAC1を運ぶアグロバクテリウムの文化で採取したサンプルは、個々にP19やP23サイレンサプレッサを運ぶ文化4:1の割合で混合したプラスミド。 アグロバクテリウム培養の結果の組み合わせは、植物内に真空浸透した。 HAC1の浸透した組織は、組換えタンパク質定量のための8解像度まで毎日収集した。 アグロバクテリウム細胞バンク（C）の安定性。植物は、タンパク質の蓄積を評価するために、毎年、アグロバクテリウム細胞バンクの同じバッチを浸潤させた。新鮮な葉の重量に相当50μgのは、レーン毎にロードされました。 目の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。この図である。

我々は、開示することは何もありません。