抗核抗体のHE​​p-2細胞を用いたスクリーニング

サマリー

間接免疫蛍光（IIF）のアッセイは伝統的に、ヒト血清中の抗核抗体（ANA）の検出のために使用されてきた。これらの抗体の存在が全身性自己免疫リウマチ性疾患（SARD）の診断を助けることができる。このプロトコルは、効果的に正確にこれらの自己抗体を検出するために、IIF法を実行する方法を示しています。

要約

ANAのテストにリウマチのポジションステートメントのアメリカの大学は、全日空が^1をスクリーニングするためのゴールドスタンダード方式としてIIFの使用を規定している。 IIFは、専門家の手の中に優れたスクリーニング検査ではあるが、加工、IIFを読み取る技術的な問題は、スライドさせる - このような労働集約型スライド処理、マニュアル読書、経験豊富なの必要性、訓練を受けた技術者や暗い部屋の使用など - IIFメソッドを作る近代的な、自動化された実験室のワークフローにフィットするのが難しい。

高品質のANAスクリーニングに向けた最初の重要なステップとは、慎重なスライド処理である。この手順では、労働集約的であり、完全なプ​​ロセスの理解だけでなく、細部や経験に注意を払う必要があります。

スライド読み出しが暗い部屋で蛍光顕微鏡によって行われ、細胞周期との関連で、様々なパターンに精通した技術者によって行われそして間期と分裂細胞の形態。 IIFは、SARDのための最初の行のスクリーニングツールであるという条件で、正確にこの手法を実行するための手順を理解することが重要です。

近年、デジタルイメージングシステムは、IIFスライドの自動読み取りのために開発されている。このような、NOVAビュー自動蛍光顕微鏡のようなこれらのシステムは、ルーチンのIIFのワークフローを合理化するために設計されています。 NOVAを表示することにより、読影からの画像取得を分離し、ウェルの高解像度デジタル画像を取得し、記憶する。画像は、高解像度のコンピュータモニタ上で解釈見られる。それは、今後の参考のために画像を格納し、画像上の蛍光強度データを提供することで、オペレータの解釈をサポートしています。また、予備的に正または負のような結果を分類し、陽性サンプルのためのパターン認識を提供しています。要約すると、IIF readiを暗室の必要性を排除し、自動化し、合理化NG /解釈ワークフロー。最も重要なことは、読者と読みの間の一貫性を向上させます。また、スライドバーコードを用いて、転写エラーがサンプルのトレーサビリティと、正の患者識別を提供することによって除去される。これは増加した患者データの整合性と安全性をもたらす。

このビデオの全体的な目標は、スライド処理、共通IIFパターンの識別、およびこの手法を簡素化し、調和させる新たな進歩の導入など、IIFの手順を示すことである。

概要

長期抗核抗体（ANA）は、DNA、タンパク質およびリボ核タンパク質^1、2を含む細胞核の成分と反応する自己抗体の様々を説明しています。 HEP-2細胞、抗原の何百もの天然のタンパク質配列は、全日空¹の検出のための理想的な基板を提供する。ヒト血清中のANAの検出は、結合組織疾患のための重要なスクリーニングツールであり、IIFは、ANA ^1を試験するための参照方法である。最近では、HEp-2細胞でのIIFは、抗原特異的免疫アッセイおよび多重方法でいくつかの研究室で置き換えられました。原因偽陰性の結果に対する懸念や臨床医への透明性の欠如のために、米国リウマチ学会は、HEp-2細胞を用いて、IIFは、ANAは^1をスクリーニングするための「ゴールドスタンダード」であるべきと結論付けたタスクフォースを結成した。

ANAによるスクリーニングの主観的な性質のために、HEp-2細胞の品質である結果の正確かつ自信を持って報告にtegral。有糸分裂細胞の高い数が、最適な細胞形態、十分なコンフルエン、関連抗原の発現の存在は特に重要である。 IIFパターン認識は、患者の診断を支援するための重要なツールとして機能する。様々なパターンの重要性を理解することは、臨床医や検査技師が診断を確定するために、適切なフォローアップのテストを実行することができます。例えば、均質ANAパターンは、抗dsDNA又はクロマチン抗体の存在下で起こり得る、および全身性エリテマトーデス^（SLE）3に関連付けることができる。反対側から、近年、一般に、ルーチンサンプルの最大12％において見られる、いわゆる緻密な微細な斑点模様（DFS​​）は、主に抗DFS70抗体と関連していることが記載されている。 （他の疾患特異的ANAずに）単独で見られるこれらの自己抗体は、全身性の自己免疫リウマチ性疾患と関連していない<> 4-9 SUP。それによって、抗DFS70抗体に対する確認検査は、不要な反射テストを減らす大幅なコスト削減を提供し、患者の不安を和らげることができます。

IIFは、自己抗体を検出するための最初の行のスクリーニング方法であることを考えると、ユーザは、試薬および組織基質の選択は結果に影響を与えることができる方法を理解することが最も重要である。 IIF技術は本質的に主観的であるので、使用する試薬は、最高品質の結果を提供することが重要である。

このビデオプロトコルのこの目標は、IIF法、ANAに関連する共通のパターンを実行するために必要な正しい手順をユーザに慣れるために、実験のワークフローを合理化し、結果を標準化することができる新しい進歩を導入することである。

プロトコル

1。準備と基質の選択サンプル

1. 梱包から試薬を除去し、各項目は室温にすることができます。試薬を準備し、方向インサートに応じて患者の血清を希釈。注：NOVAライトのスライドにバーコードされているので、容易に検査情報システムLISと併せて自動化システムに組み込むことができる。この手順は、手動スライド処理を示す図である。ハイスループット研究所は、しかしながら、自動スライド処理装置を選択することができる。

コントロールとサンプルの2また

1. ポジティブコントロールし、適切なスライドウェルにネガティブコントロールの1滴1滴を分注する。残りのウェルに希釈した患者血清のピペット20〜25μL。一度に1スライドを処理します。
2. 底に湿らせたペーパータオルで染色容器にスライド（複数可）を配置します。容器を覆い、30分間のスライド（複数可）をインキュベートする。注：湿度の高い条件になる乾燥から基板を防ぐ。井戸の乾燥は、人為的染色につながる可能性があります。このインキュベーション期間中に、患者の血清中の抗核抗体を各ウェルに固定された細胞の抗原に結合するであろう。
3. インキュベーション期間の後、洗浄バッファーの穏やかな流れを用いて血清を洗い流してください。基板の損傷を避けるため、ウェル間のサンプルの交差角度スライドを防止するために若干のウェル上に直接流を導く回避する。余分な洗浄バッファーをオフにタップして、約5分間の洗浄バッファーを含むコプリンジャーにスライドを置く。

蛍光結合体の3。追加

1. 一つ一つは、洗浄バッファーからスライドを外し、ゆっくりと過剰な洗浄緩衝液を除去するためにタップします。各ウェルに（FITC抗ヒトIgGのラベル）の蛍光コンジュゲートの1滴を適用します。加湿された容器に30分間スライドをインキュベートし、染色を交換してください容器カバー。注意：ANAのテストでは、IgGのFc特異的結合体の使用をお勧めします。結合体は、光に敏感であり、カバーが加湿された環境を維持することに加えて、光への暴露からスライドを保護します。このインキュベーション期間中に、コンジュゲートは、細胞抗原に結合した患者の抗核抗体に結合するであろう。この結合体は、ウェルにおける蛍光の存在で結果を結合。
2. 上記のようにスライドをすすぎ、洗浄します。
3. ペーパータオルの上にカバースリップを置き、カバーガラスの下端までの連続した​​線に封入剤を適用します。
4. 洗浄バッファーから各スライドを削除し、余分な洗浄バッファーを除去するためにゆっくりとスライドをタップします。カバースリップの端までスライドの下端をタッチします。
5. 穏やかにカバースリップ上の封入剤は、気泡を形成することなく、スライドの上端に流れるような方法で、カバースリップ上にスライドを下げる。注意：共同封入剤の最適量を使用するなど、verslippingは、完璧に練習が必要な技術である。

正と負の結果4。識別

マニュアルの解釈

1. ビューには、暗い部屋に置か蛍光顕微鏡でスライドさせる。蛍光の細胞分布と均一性を評価するために20倍または25倍を目的に、全ウェルのスキャンを実行する
2. 陽性とパターンに関する最終解釈を作るために40倍の対物レンズに切り替えます。
3. ポジティブ及びネガティブコントロールを見てください。 1 + 4 +からの反応度評価尺度を使用したグレードの陽性。注：ネガティブコントロールは、完全に暗く表示されない場合がありますが、多くの場合、低レベルの非特異的な蛍光を表示します。ポジティブコントロールは、核内の明るいアップルグリーン蛍光（ 図1）が表示されます。

自動化された解釈

注意：additiでNOVAビュー自動蛍光顕微鏡やその他の自動化されたデジタル画像機器による手動の解釈、負荷およびスキャンスライドへの上;何暗室は必要ありません。適切なスライド式を選択して、プロジェクトを作成した後、測定器は、各ウェル内の細胞の高解像度デジタル画像を取得して記憶する。さらに、NOVAビュー蛍光強度を測定し、陽性または陰性として結果を分類し、陽性サンプルのためのパターン認識を提供する。画像はNOVAの表示結果の最終的な解釈は、改訂、確認を可能にし、高解像度のコンピュータモニタ上のオペレータが見られる。レポートは、確認された結果に生成することができます。それは結果の解釈を助けるために意図されているデジタル顕微鏡は、経験豊かな検査技師に関連して使用されるべきである。

結果

、均質な斑点、セントロメア、核小体、核ドット：HEP-2のための細胞染色結果を評価する際に、5の主な核のパターンが最も一般的に報告されます。これらのパターンは、自己抗体は、核の特定の構成成分への結合の結果である。 ANAテストは、核構造に特異的であるが、細胞質構造体に対する自己抗体に関連する細胞質パターンも観察することができる。いくつかの場合において、いくつかの自己抗体がサンプル中に存在し得る、画像が混在パターンとして現れることができる。

他のそれほど頻繁に観察され、IIF法によって検出することができるしばしば細胞周期の特定パターンがある;最近では、特殊な臨床的意義を持つ、いわゆる密集細かい斑点パターンはいくつかのANA陽性血清に記載されている。

均質パターン

均質なパターンを識別するために、十分にスキャンして、有糸分裂または分割を識別細胞。有糸分裂細胞の凝縮クロマチン（ 図2、オレンジ色の矢印）は、多くの場合、均質なパターン、休止細胞を呈する均一、全体の核の拡散蛍光（ 図 nuclei.In休止菌に比べてより顕著である固体、均一な蛍光を示す2、白矢印）。この特徴的なパターンは、多くの場合、抗dsDNA抗体¹⁰の結果である。

まだら模様

粗い斑点のパターンでは、有糸分裂細胞が凝縮した染色体領域（ 図3、オレンジ色の矢印）の染色を示さない。休止細胞は、全体の核を通して粒状蛍光を示す。核斑点が粗いか細かいとして定義することができます。粗い斑点パターンは、多くの場合、抗Sm及び抗RNP ¹¹の結果である。

微細な斑点パターンでは、休止細胞は、典型的には均一dにおいて、核全体に細かい又はびまん性斑点を示すistribution（ 図4、白矢印）。細かい斑点模様は、多くの場合、抗SSAand抗SSB ¹²の結果である。

密な微細斑入りパターン

現在では、密な細かい斑点模様（DFS​​）は、通常の試験では一般的であり、サンプルの限り12％が抗DFS70自己抗体陽性であることが認識されている。しかし、単独で見られるこれらの自己抗体は、全身性の自己免疫リウマチ性疾患^{4 -6}に関連付けられていません。これらの抗体は、健常者とSARD ⁶とは無関係の病気を持つ患者では普及している。抗DFS70抗体についての確認試験は、不要な反射テストを減らすのに役立ち、かなりのコスト削減を提供し、患者の不安を和らげることができます。

DFSパターンを識別することは困難であると、ANA陽性が患者と医師の両方に不安を引き起こす可能性がありますので、それは非常にidenti後の確認検査を行うことをお勧めします全日空positivty ^5,6の臨床的意義を明確にする抗DFS70抗体を示唆するパターンをfying。

細胞核（ 図5、白矢印）核全体に展示均一に分布細かいスペックルを休んでいる間、このパターンでは、有糸分裂細胞（ 図5、オレンジ色の矢印）は、中期クロマチンの正斑点染色を示す。

セントロメアパターン

、動原体パターンを識別井戸をスキャンして、有糸分裂または分裂している細胞を同定した。有糸分裂細胞（ 図6、オレンジ色の矢印）では、これらの個別のスペックルが密接にしばしば「中期バー」と記載されているものの中に会合するようになる。セントロメアパターンでは、休止細胞（ 図6、白矢印）は、核全体に分布し、約40〜60の個別スペックルを示しています。セントロメアパターンは、抗CENP A、Bの結果であり、C ¹³抗体。

ステップ」>核小体のパターン

他nucleolearパターンは染色体領域の陽性染色を表示しながら、いくつかの核小体のパターンは、有糸分裂細胞におけるびまん性細胞質染色（ 図7、オレンジ色の矢印）と負の染色体領域に関連付けられています。核小体パターンが弱い斑入りや核質の均一な染色とともに、核小体の均質または斑点染色（ 図7、白矢印）に関連付けられています。これらのパターンは、抗RNAポリメラーゼIII、抗フィブリラリン、anti-Th/Toとanti-PM/Scl抗体^14,15に関連している。

核ドット柄

核ドットパターンは、負の中期分裂細胞（ 図8、オレンジ色の矢印）とし、安静時の細胞核内のいくつかの個別の斑点（ 図8、白矢印）に関連付けられています。この特徴的なパターンは、多くの場合、SP-100、PML、またはP80コリン自己抗体の結果である。これらの抗体は以下のとおりです。原発性胆汁性肝硬変や自己免疫性肝炎¹⁶とsociated。

図1ネガティブコントロール（左）：細胞は、低レベルの非特異的な蛍光を表示しませんが、具体的な核染色陽性対照（右）：細胞は、アップルグリーン、核の蛍光を表示します。

図2。均質パターン。有糸分裂細胞（orangearrow）固体蛍光を示す。休止細胞でも、びまん性染色（whitearrow）を示す。

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図3。粗い斑点模様。有糸分裂細胞（オレンジの矢印）は、負の染色を示す。休止細胞は、異なる斑点汚れ（白い矢印）を示している。

図4。ファイン斑点模様。有糸分裂細胞（オレンジの矢印）は、負の染色を示す。休止細胞は、明確な細かい斑点染色（白矢印）を示している。

図5。高密度細かい斑点模様。有糸分裂細胞（オレンジの矢印）細かい粒状の固形染色を示す。休止細胞は、非常に微細な、びまん性斑点汚れ（whitearrow）を示す。

図6。セントロメアパターン。有糸分裂細胞（orangearrow）均一、離散スペックルを示しています。細胞（whitearrowを）休んでは、細胞核あたり40〜60の個別スペックルを示しています。

図7。核小体のパターン。有糸分裂細胞（orangearrow）は顆粒状染色のような大きなクラスタを表示されます。核小体で休んセルnucleishows蛍光（whitearrow）。

図8。原子力ドットパターン。有糸分裂細胞（orangearrow）は負に表示されます。休止細胞は、いくつかのDISCRを表示核（whitearrow）中のETEの斑点が。また、nucelarドットパターンは、ミトコンドリア抗原（赤い矢印）に対する自己抗体に関連する細胞質染色と共存させることができます。

ディスカッション

HEp-2 細胞によるスクリーニングは、SARD 患者の診断における重要な最初のステップです。 ただし、IIFメソッドには調和が欠けています。変動の原因には、スライドの調製、共役特異性、蛍光顕微鏡の効率、リーダーの経験が含まれます。こうした懸念にもかかわらず、IIFはANAテストの「ゴールドスタンダード」であり続けています。 HEp-2細胞には多種多様な自己抗原が含まれており、これらの自己抗体の検出に理想的な基質を提供します。 一部の研究室では、IIFはマルチプレックスアッセイやELISAなどの固相スクリーニング法に置き換えられています。このような検査の欠点は、十分に感度を持つ抗原の全範囲を表示しないことです。その結果、真陽性の患者が見逃される可能性があり、有害な結果をもたらす可能性があります治療の遅れや誤った診断の問題に加えて、確認検査の繰り返しや不必要な診断調査により、追加の医療費が発生する可能性があります。IIFに固有の課題があることを考えると、結果の主観性を避けるために、この手法を適切に実行することが最も重要です。

ANAスクリーニングの結果を正確に解釈し、報告するためには、最高品質の基材を使用することが不可欠です。HEp-2基質を選択する際には、臨床的に関連するエピトープを天然タンパク質状態で発現するように細胞を最適化することが重要です。 トランスフェクトまたは修飾されたHEp-2細胞株は、適切な抗体-抗原結合を許可しない可能性があります。さらに、複数の異なる自己抗体が同時に存在する場合、組換え細胞は1つまたは複数のパターンをマスクする可能性があります。 基質には多数の有糸分裂細胞も存在する必要があります。適切な数の有糸分裂細胞により、パターンを迅速かつ正確に識別できます。

基板の特性に加えて、このビデオプロトコルの目的は、サンプルの添加、スライド洗浄、共役体の追加、カバーの滑り、および陽性と陰性の結果の決定などの重要なステップを示すことにより、IIF技術を説明することです。これらの各ステップに適切な手法を使用しないと、結果が損なわれる可能性があります。 結合していない抗体をすべて除去するには、適切な洗浄が重要です。 一部の患者は非常に大量の自己抗体を示しており、これらの場合、他のウェルを汚染しないようにウェルから血清を洗浄することが重要です。

IIFは伝統的に非常に労働集約的で主観的な実験方法でしたが、スライドプロセッサ、バーコードスライド、自動デジタル顕微鏡などの新しいテクノロジーにより、ワークフローを大幅に簡素化し、一貫性を高め、解釈のばらつきの原因を減らすことができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPIコンジュゲート)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
バーコードスキャナー	INOVA Diagnostics	LINK019