Method Article

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

DOI:

10.3791/51216

⸱

January 31st, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

In This Article

Summary

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我々は、植物におけるモノクローナル抗体およびレポータータンパク質の一過性発現に対する導入遺伝子の調節エレメント、植物の成長および発達パラメータ、およびインキュベーション条件の影響を決定し、モデル化するのに使用することができる実験アプローチの設計を記載している。

Abstract

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植物は、低コスト、拡張性、安全性などのバイオ医薬品の生産のための複数の利点を提供します。一過性の発現は、短期開発と生産時間の付加的な利点を提供していますが、発現レベルは、このように適正製造基準の文脈における規制の懸念を生じさせるバッチ間で大きく異なります。我々は、バッチ間の発現の変動性に発現中に調節発現構築物の要素、植物の成長および発達パラメータ、およびインキュベーション条件、などの主要な要因の影響を決定するための実験計画法（DoE）アプローチの設計を用いる。私たちは、モデル抗HIVモノクローナル抗体（2G12）、蛍光マーカータンパク質（DsRedの）を発現する植物をテストしました。我々は、モデルの特定のプロパティを選択するための理論的根拠を議論し、その潜在的な制限を識別します。一般的なアプローチは、容易に他の問題に転送することができるため、モデルaの原理広く適用日時：知識ベースのパラメータの選択、より小さなモジュールに最初の問題を分割することにより、複雑さの低減、最適な実験の組み合わせのソフトウェア誘導セットアップと段階的なデザイン増強。そのため、方法論だけでなく、植物におけるタンパク質発現を特徴付けるためだけでなく、機械論的な説明を欠いている他の複雑なシステムの調査のために有用である。パラメータ間の相互接続性を記述した予測式は、他の複雑なシステムのための機械論的なモデルを確立するために使用することができます。

Introduction

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植物が成長する安価であるため、植物における生物薬剤学的タンパク質の産生が有利で ​​あり、プラットフォームは、単により多くの植物を成長させることによってスケールアップすることができ、ヒト病原体1,2を複製することができない。 アグロバクテリウムツメファシエンスと葉の浸潤に例えば基づく一過性発現戦略DNA送達および精製された製品の納入の時点までの時間が2ヶ月未満〜3年に短縮されるため、追加の利点を提供します。一過性発現は、機能喪失型変異体を補完するか、タンパク質相互作用4-6を調査する能力についての遺伝子を試験するために、例えば 、機能分析のために使用される。しかしながら、一過性発現レベルは、トランスジェニック植物7-9における発現レベルよりも大きいバッチ間の変動を示す傾向がある。これは、バイオ医薬品製造プロセスは、一過性発現のWiに基づいて、可能性を減少させる再現性が重要な品質属性であるとリスク評価10される場合がありますので、適正製造基準（GMP）のコンテキストで承認されちゃう。このような変化も、研究者が調査する予定の相互作用をマスクすることができます。したがって、我々は、植物において一過性発現レベルに影響を与える主な要因を特定するために、高品質の定量的な予測モデルを構築するために設定してください。

1ファクターを1つずつ割り当....

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Protocol

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1。エネルギー省戦略の計画

  1. デザインに含めるための関連要因と応答を識別します。
    1. 測定のための1または複数の応答を定義します。ここで、2G12およびDsRedの発現レベルを使用した（μg/ ​​ml）を、関連するとみなさ検出可能な最小の差を含む（10および20μg/ml/ mlのそれぞれ）とシステムの推定標準偏差の近似値（4,8μgの/ mLであった）先の実験に基づく。
    2. 入手可能な文献を使用し、これまでの実験や特殊なスクリーニングの設計からデータがインパクト応答に定量化されます（ 表1）7,8,19,20有意な因子を選択する（ 例：要因計画は、導入を参照してください）。
    3. （数値または合式）のファクタ·タイプを割り当てて、数値の要因はエネルギー省の調査（ 表1）の間に変化される範囲内の範囲を選択します。
    4. numeriを識別C因子れる連続的な変化が実現するのは困難である。
      1. 一定のレベルに正確に調整することができない要因のための連続的な変化の使用は避けてください。 例えば 、培養温度は、通常、±2℃以内に制御することができ、このような27.2℃、25.9℃、29.3℃のマストなどの値を使用して、したがって連続的に変化避けること。
      2. その代わりに、これらの要素（ 表1）

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Results

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異なるプロモーターとの5'UTRを使用して一過性発現の際のDsRedの蓄積のための記述的モデル

葉の抽出物中のDsRed蛍光は、組換えタンパク質の発現レベルを示すために使用されたので、実験計画戦略の応答として使用した。我々は、関連すると考え検出可能な最小の違いは、20μg/ mlのであり、システムの推定標準偏差は、最初の実験に基づいて8μg/ mlのだった。一過性発現モデルに含まれる因子は、文献データの7,8、我々の以前の結果9に基づいて選択した。調査した範囲も、これらのデータに従って選択された（ 表1）。少なくとも三つのレベルは、二次ベースモデルの計算を可能にするすべての個別の数値の要因のために選択した。 D最適選択アルゴリズムは、エネルギー省の選択のために選ばれたことのための最も正確な推定値を得るために実行されます回帰モデルの係数。最初にDesignExpertによって提案設計は90ランからなるしかしFDSは、予測（ 図3A）、1％.......

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Discussion

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リソースは、多くの場合、希少かつ高価であるため、すべての実験は慎重な計画が必要です。計画段階（ 例えば、すべての重要な要因の相互作用をカバーしていないベースモデルを選択する）中にエラーが発生し、実質的に生じたモデルの予測力を減少させるため、実験全体を切り下げることができるので、これはエネルギー省の戦略のために特に当てはまります。しかしながら、これらの誤差は容易に基本的な手順に従うことによって回避することができる。

エネルギー省計画時の考慮事項

最初に、それぞれの実験計画の実行のために（正または負）の結果を評価することが好適である回答を選択することが重要である。例えば：UV吸収37により決定された対象タンパク質の濃度は、特定のプロモーター/ 5'UTRの組合せの活性を評価するのに有用である。しかし、タンパク質の機能評価（ 例えば 。DsRedの場合、蛍光によるまたはCASでのプロテインAへの結合それはまた、タンパク質の質の側面を含んでいるので、2G12のe）はさらに良いで.......

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Disclosures

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公開手数料は、部分的に原稿やその内容については責任を負いの作成に携わっに関与していなかった企業Statease社（米国）とStatcon（ドイツ）が主催した。

Acknowledgements

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著者らは、この研究で使用したタバコ植物を栽培するためにPPAMの植物発現ベクターとイブラヒムアルAmediを提供するための博士トーマスラーデマッヘルに感謝しています。私たちは、原稿を編集すると、彼の援助のためリチャード·M·ワイマンに感謝したいと思います。この作業は、部分的には、欧州研究評議会上級助成「未来ファーマ」、提案番号269110とフラウンホーファーZukunftsstiftung（フラウンホーファー未来財団）によって資金を供給された。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Design-Expert(R) 8株式会社Stat-Ease(スタットイーズ)n.a.DoEソフトウェア
TryptoneCarl Roth GmbH8952.2メディアコンポーネント
酵母抽出Carl Roth GmbH2363.2メディアコンポーネント
塩化ナトリウムCarl Roth GmbHP029.2メディアコンポーネント
AmpicillinCarl Roth GmbHK029.2抗生物質
寒天Carl Roth GmbH5210.2培地コンポーネント
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012Microorganism
pPAMGenBankAY027531Cloning/expression vector; 
NucleoSpinプラスミド MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250プラスミドDNA分離キット
NucleoSpin ゲルおよびPCRクリーンアップMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250プラスミドDNA精製キット
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spectrophotometer
NcoINew England Biolabs Inc.R3193L制限エンドヌクレアーゼ
EcoRINew England Biolabs Inc.R3101L制限エンドヌクレアーゼ
AscINew England Biolabs Inc.R0558L制限エンドヌクレアーゼ
NEB 4New England Biolabs Inc.B7004S制限エンドヌクレアーゼバッファー
TRISCarl Roth GmbH4855.3メディアコンポーネント
四ホウ酸二ナトリウムCarl Roth GmbH4403.3メディアコンポーネント
EDTACarl Roth GmbH8040.2メディアコンポーネント
アガロースCarl Roth GmbH6352.4メディアコンポーネント
ブロモフェノールブルーCarl Roth GmbHA512.1カラーインジケーター
キシレンシアノールCarl Roth GmbHA513.1カラーインジケーター
グリセロールCarl Roth GmbH7530.2メディアコンポーネント
ミニサブセル GT セルBioRad170-4406ゲル電気泳動チャンバー
Agrobacterium tumefaciens株 GV3101:pMP90RKDSMZ12365微生物
エレクトロポレーター 2510エッペンドルフ4307000.658エレクトロポレーター
牛肉抽出カール・ロス GmbHX975.2メディア部品
ペプトンカール・ロス GmbH2365.2メディア部品
スクロースカール・ロス GmbH4621.2メディア部品
硫酸マグネシウムカール・ロス GmbH0261.3メディア部品
CarbenicillinCarl Roth GmbH6344.2抗生物質
KanamycinCarl Roth GmbHT832.3抗生物質
RifampicinCarl Roth GmbH4163.2抗生物質
FWD プライマーEurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV プライマーEurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720サーマルサイクラーApplied Biosystems4359659Thermocycler
RNAfold webserverUniversity of Viennan.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cmGrodann.a.Rockwoolblock
Greenhousen.a.n.a.Forplant cultivation
PhytotronIlka Zelln.a.Forplant cultivation
Omnifix-F SoloB. Braun6064204Syringe
Murashige and Skoog saltsDuchefaM 0222.0010Media component
GlucoseCarl Roth GmbH6780.2Media component
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GPhytohormon analogon
 BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008光度計
Osram クールホワイト 36 WOsram4930440光源
リン酸二ナトリウムCarl Roth GmbH4984.3メディアコンポーネント
遠心分離機 5415DEppendorf5424 000.410遠心分離
機 Forma -86C ULT 冷凍庫ThermoFisher88400冷凍庫
シナジー HTBioTekSIAFRT蛍光プレートリーダー
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPRデバイス
プロテインA ライフテクノロジーズ 10-1006抗体結合タンパク質
HEPESCarl Roth GmbH9105.3メディアコンポーネント
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3メディアコンポーネント
2G12 抗体PolymunAB002リファレンス抗体
物 物

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

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