部位特異的架橋法を用いた分泌細菌病原性因子の集合体のモニタリング

サマリー

この記事では、目的のタンパク質と大腸菌の他の因子との間の相互作用を監視するために、パルスチェイス無線標識と部位特異的なフォトクロスリンクを組み合わせて使用する方法を示します。従来の化学的架橋法とは異なり、このアプローチは、生細胞内の秩序あるアセンブリ経路の高解像度の「スナップショット」を生成します。

要約

この記事では、目的のタンパク質と他の因子との間の動的な相互作用をin vivoで検出および分析する方法について説明しています。私たちの方法は、もともとPeter Schultzと同僚によって開発された琥珀抑制技術に基づいています¹。琥珀突然変異は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の特定のコドンに最初に導入されます。その後、琥珀色の変異体は、琥珀色のサプレッサーtRNAおよびMethanococcus jannaschiiに由来するアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子とともに大腸菌で発現します。このシステムを使用して、光活性化可能なアミノ酸アナログp-ベンゾイルフェニルアラニン(Bpa)が琥珀色のコドンに組み込まれます。次に、細胞に紫外線を照射して、Bpa残基を3〜8 Å以内に位置するタンパク質に共有結合します。フォトクロスリンキングは、数秒から数分の時間スケールで発生するタンパク質間相互作用の変化をモニターするために、目的のタンパク質のパルスチェイス標識および免疫沈降と組み合わせて行われます。私たちは、外膜に組み込まれたドメインと細胞外空間に転座するドメインの2つの独立したドメインからなる細菌の病原性因子の集合を研究するために手順を最適化しましたが、この方法は、原核細胞と真核細胞の両方で多くの異なる集合プロセスと生物学的経路を研究するために使用できます。原則として、相互作用する因子、さらには目的のタンパク質に結合する相互作用因子の特定の残基は、質量分析によって同定できます。

概要

生物学的経路におけるその役割を定義し、そのアセンブリを理解し、またはその作用機序を解明するためには、目的のタンパク質と他の細胞成分との間の相互作用を特定し、特徴づけることがしばしば不可欠です。タンパク質間相互作用の研究には、さまざまなアプローチが一般的に使用されていますが、すべてに限界があります。目的のタンパク質に結合するタンパク質を同定する最も簡単で偏りのない方法は、共精製(または共免疫沈降)ですが、このアプローチでは、精製手順中にタンパク質複合体が無傷のままである必要があります。弱いタンパク質相互作用や一過性のタンパク質相互作用は、化学的架橋によって安定化させることができますが、この方法では、通常、タンパク質配列に広く散在する第一級アミンを介してタンパク質を結合する化合物を使用する必要があります。解釈が困難な複雑な架橋パターンが生成されることがあります。これは、特に目的のタンパク質が多タンパク質複合体の構成要素である場合です。さらに、化学架橋剤のスペーサーアームの長さは一般に10 Åを超えるため、目的のタンパク質に近接して位置しているが、目的のタンパク質と直接相互作用しないタンパク質と共有結合を形成することができます。アフィニティークロマトグラフィーや 2 ハイブリッドスクリーニングなどの方法も、タンパク質間相互作用の同定にしばしば有用です。ただし、前者のアプローチでは、生理学的に重要な相互作用を促進する条件を再現する必要があり、弱い相互作用の検出には使用できません。後者のアプローチでは、結合相互作用が宿主生物内で複製でき、目的のタンパク質とその結合パートナーが融合タンパク質のコンテキストに配置されたときに維持されることが必要です。また、2ハイブリッド法では、偽陽性の結果が生成される傾向があります²。タンパク質間相互作用が確立されると、相互作用部位をマッピングするためにかなりの作業が必要になることがよくあります。おそらく、従来のアプローチの最も重要な欠点は、分子間相互作用の時間的配列や結合の速度論に関する情報を提供しないことです。

この論文は、タンパク質間相互作用を研究するために使用される他のアプローチの制限のいくつかを克服する簡単な方法について説明しています。最初に、目的のタンパク質をコードする遺伝子に単一の琥珀色の突然変異が導入されます。次に、琥珀変異体は、琥珀コドン³にのみ光活性化可能なアミノ酸アナログp-benzoylphenylalanine(Bpa)を組み込むように操作されたMethanococcus jannaschiiに由来する琥珀抑制tRNAおよびアミノアシルtRNA合成酵素と共発現します。その後、細胞に長波長紫外線(UV)光(~365 nm)を照射すると、Bpaと~3-8 Å^4,5以内のタンパク質との間に共有結合が形成されます。いくつかの実験状況では、活性化されたBpaと脂質や核酸などの細胞の非タンパク質成分との間にも架橋が形成され^{ることがあります6。}アンバーコドンで末端を持つ分子は、一般にSDS-PAGE上の完全長タンパク質と容易に区別でき、他のタンパク質と架橋することはできません。架橋前に細胞にパルスチェイス放射性標識を施し、次に架橋産物を免疫沈降またはアフィニティー精製することにより、タンパク質間相互作用の配列と持続時間を確立することができます。分子間相互作用に関する時間情報を生成する能力は、順序付けられた多段階のアセンブリ、トラフィック、またはシグナル伝達経路を通じて目的のタンパク質の進行を研究し、経路中間体を特定するために特に価値があります。化学的架橋と同様に、部位特異的架橋は生理学的条件下で発生するタンパク質間相互作用を検出しますが、架橋剤を単一の位置に導入することで、タンパク質の個々のセグメントと他の因子との間の相互作用の解析が容易になります。この部位特異的架橋のユニークな特徴は、目的のタンパク質が、異なる結合パートナーと相互作用する可能性のある複数のセグメントまたはドメインを有する場合に特に有利です。さらに、部位特異的架橋を質量分析などの方法と組み合わせて使用することで、タンパク質間相互作用を媒介する残基を正確にマッピングすることができます。この方法は大腸菌での使用に最適化されていますが、琥珀色の抑制によるタンパク質へのphotactivatableアミノ酸類似体の取り込みは、マイコバクテリウム、酵母および哺乳動物細胞^7-11で報告されています。したがって、原則として、私たちの方法は他のシステムで使用できます。

私たちは、大腸菌O157:H7の病原性因子であるEspPの生合成を促進する分子間相互作用を特定するために、この方法を広く使用してきました。EspPは、大きなN末端細胞外ドメイン(「パッセンジャードメイン」)と、円筒形のbバレル構造に折り畳まれてタンパク質を外膜(OM)に固定するaC末端ドメイン(「bドメイン」)を含む「オートトランスポーター」として知られるタンパク質のスーパーファミリーのメンバーです¹²。乗客の領域がOMを横切って移動するメカニズムは、長年の謎でした。すべての細菌細胞表面タンパク質と同様に、EspPは内膜を横切って輸送され、ペリプラズム(内膜と外膜の間の空間)を横切ってシャトルされ、一連の順序付けられたイベントでOMを標的にする必要があります。OMを横切って転座した後、EspPパッセンジャードメインもタンパク質分解性切断によってbドメインから分離され、細胞表面から放出されます。部位特異的架橋とパルスチェイス放射性標識を組み合わせることにより、タンパク質の両ドメインが最初にペリプラズム⁶の分子シャペロンSkpと相互作用することを示しました。その後、bドメインの離散的なセグメントは、Bam複合体と呼ばれるヘテロオリゴマーの成分と立体特異的に相互作用し、未知のメカニズムによってbバレルタンパク質の細菌OMへの統合を触媒します。おそらく最も興味深いのは、乗客ドメインが^OM13を横断するときに、バムコンプレックスサブユニット(BamA)の1つと接触していることを発見したことです。我々の結果により、オートトランスポーターアセンブリ¹⁴の詳細なモデルを構築することができ、OMを横切る乗客ドメインの輸送にバムコンプレックスが関与

していることが明らかになった。

プロトコル

1. プラスミドの構築

1. 目的のタンパク質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターにクローニングした後、部位特異的突然変異導入キットを使用して、目的の場所に琥珀色変異を導入します
   注:構造情報と表面曝露予測は、突然変異の位置を決定するための有用なガイドとして役立ちます。アンバー抑制と架橋の効率は大きく異なるため、アンバー変異は複数の位置に導入する必要があります。さらに、Bpaはチロシンとフェニルアラニンの類似体であるため、通常は大きな疎水性アミノ酸をコードする位置に琥珀色の突然変異を導入して、タンパク質の構造と機能の摂動を最小限に抑えてみてください。最後に、発現ベクターを選択する際には、目的のタンパク質を非常に高いレベルで過剰に産生すると、Bpa取り込みの効率が制限される可能性があることに留意してください。

2. 文化の準備

1. エレクトロポレーションを使用して、アンバー抑制システムをコードするプラスミド(pDULE-p Bpa;参考文献⁴を参照)と、アンバー変異を持つ目的のタンパク質をコードする適合プラスミドを使用して、適切な大腸菌株を形質転換します。
2. 適切な抗生物質を含むLB寒天上に細胞をプレートします(5 μg/mlテトラサイクリンを使用してpDULE-p Bpaを選択します)。プレートO/Nを37°Cでインキュベートします。
3. 翌日、0.2%グリセロール、メチオニンとシステインを除くすべてのL-アミノ酸(40μg / ml)、および抗生物質を含む3〜5 mLのM9培地¹⁴で、単一のコロニーからO / N培養を開始します。37°Cでインキュベートします。
4. 翌日、O/N培養物を2,500 x gで室温で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。細胞を5 mLの新鮮なM9培地に再懸濁し、遠心分離を繰り返します
   注:O/N培養物の培地中に存在する少量のbラクタマーゼは、有意な細胞増殖が起こる前に新たに添加されたアンピシリンを分解するため、この洗浄ステップはアンピシリン耐性をコードするプラスミドを維持するために重要です。
5. 細胞を2 mLの新鮮な培地に再懸濁し、分光光度計(OD₅₅₀)で細胞濃度を測定します。
6. 50 mLのM9培地と抗生物質を含む250 mLの三角フラスコに細胞を添加します(OD₌ 0.03)。培養物を37°Cで振とうする水浴でインキュベートします。

3. Ppaの組み込みとフォトクロスリンクの準備

注:以下で説明するプロトコルは、3つの時点(0、1、および5分)を持つサンプルタイムコース用です。異なる数の時点が必要な場合は、それに応じて音量を調整します。手順の概要を図 1 に示します。

培養液が
1. 増殖している間に、1 M NaOH中のBpaの新鮮な1 M(1,000x)溶液(100 μl 1 M NaOH中に27 mg Bpa)を調製します。溶液を暗所に保つために、暗い壁のチューブを使用してください。
2. 培養液が初期から中期の対数期(OD₅₅₀=0.2)に達したら、各培養液に1 M Bpaを50 μl加えます。Bpaをフラスコを回しながら一度に1滴ずつ追加して、沈殿を避けます。次に、琥珀色の変異体の発現を促進するために必要なインデューサーを追加します。培養物を37°Cでさらに30分間インキュベートします。
3. 30分間の導入期間中に、6本の使い捨て15ml遠心分離チューブに、時点(0分、1分、5分)と「+ UV」または「-UV」のいずれかをラベル付けします。チューブを氷の上に置きます。
4. 2つ目のアイスバケツに氷を入れ、その上に6ウェル組織培養プレートを置きます。
5. パルス標識のために高比活性(1,000 mCi/mmol)の³⁵S-メチオニンと³⁵S-システイン(または2つの化合物の既製混合物)を解凍し、追跡用に非放射性L-システインとL-メチオニン(各100 mM)の溶液を調製(または解凍)します。
6. 放射性標識の5分前にUVランプをオンにします.
   注:ランプは、マルチウェルプレート内のサンプルから3~4cmの位置に配置できるように調整可能である必要があります。
7. 「-UV」とラベル付けされた各チューブとマルチウェルプレートの2つのウェルに氷(~2 ml)を追加します.
   注意: 氷は、5分の時点の直前に3番目のウェルに追加する必要があります。チューブやウェルに直接氷を入れて、各時点で細胞内反応を即座に停止し、それによって特定の生化学的経路の正確な「スナップショット」を取得することが不可欠です。
8. 30分間の誘導期間の終わりに、25 mlの培養物を予熱した125 mlの使い捨て三角フラスコに移します。フラスコを37°Cの振とう水浴に入れます。

4. パルスチェイス標識とUV照射

注:パルスチェイスラベリングとUV照射プロトコルには、タイムリーに実行しなければならない多くのステップがあり、かなりの組織化と事前の準備が必要です。すべての試薬とチューブは、すぐにアクセスできる必要があります。0分、1分、5分の時点を持つ実験のプロトコルを以下に示します。

1. 0:00(分:秒)に、25mlの培養物を125mlのフラスコに移します。
2. 0:30に30μCi/mlの放射性アミノ酸を加え、素早く渦巻いて混ぜ合わせる。フラスコを37°Cの振とう湯に入れます。
3. 1:00の時点で、100 mMのメチオニン-システイン溶液250 μlを加え、すばやく渦巻いて混合します。
   1. すぐに、氷を含む冷やしたマルチウェルプレートのウェルの1つに培養物4mlをピペットで移します。「0 min - UV」とラベル付けされた15 mlチューブに2番目の4 mlアリコートをピペットで移します。フラスコをウォーターバスに戻します。
4. 時間2:00に、氷を含む冷やしたマルチウェルプレートの2番目のウェルに培養物4mlをピペットで移します。「1 min - UV」とラベル付けされた15 mlチューブにさらに4 mlのアリコートをピペットで入れ、フラスコをウォーターバスに戻します。
5. 時間6:00に、氷を含む冷やしたマルチウェルプレートの3番目のウェルに培養物4mlをピペットで移します。「5 min - UV」とラベル付けされた15 mlチューブに別の4 mlアリコートをピペットで入れます。
6. マルチウェルプレートを取り付けたアイスバケツを予熱したUVランプの下に置き、各サンプルを個別に4分間照射します
   注:時間間隔が少なくとも4分間隔で配置されている実験では、各サンプルをマルチウェルプレートにピペットで移したらすぐに照射する必要があります。
7. 「0 min +UV」、「1 min +UV」などのラベルが付いた冷やした15 mlチューブに細胞を移します。
8. 細胞を2,500 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
9. 各サンプルを300 μLのM9培地またはPBSに再懸濁し、100%冷たいトリクロロ酢酸(TCA)33 μLを加えてタンパク質を沈殿させます。TCAをマイクロフュージで最高速度で10分間遠心分離し、上清を除去します。この時点で、サンプルは-20°Cで保存できます。

5. 免疫沈降と架橋製品検出

1. 各サンプルに50 μLの可溶化バッファー (15% グリセロール、200 mM Trisbase、15 mM EDTA、4% SDS、2 mM PMSF) を加え、95°Cで5分間攪拌しながら加熱し、沈殿したタンパク質を可溶化します。
2. 1 mL の RadioImcipitation Assay (RIPA) バッファー (50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、1.0% Igepal CA-630、0.5% deoxycholate、0.1% SDS) を添加し、各サンプルの 5 分の 1 から 2 分の 1 を使用して標準的な免疫沈降¹⁵ を行います。
   注:Igepal CA-630(オクチルフェニルポリエチレングリコール)は、もはや市販されていないNP-40の代わりに使用されています。この2つの化合物は化学的に区別がつきません。
3. 免疫沈降タンパク質をSDS-PAGEで分離します。染色、脱染、および乾燥ゲル。
4. ゲルを蛍光体スクリーンO/Nに露光し、蛍光体イメージャーで放射性タンパク質(架橋製品を含む)を検出します。

結果

私たちは、OMへの移動中にEspPと相互作用するタンパク質を特定するために、部位特異的なフォトクロスリンキングを使用しました。ここに示す実験では、残基1113と1214のフェニルアラニンコドンが琥珀色のコドンに置き換えられました。どちらの位置もbdomainに位置し、bdomainはOMに統合され、メンブレンアンカーとして機能します。EspPβドメイン¹⁶の結晶構造は、2つの残基がbバレルのペリプラズム側にあるが、~120°離れていることを示しています(図2および図3の構造を参照)。大腸菌AD202株¹⁷を、pDULE-p Bpaと、2つのEspPアンバー変異体¹³のうちの1つをコードするプラスミド(pRI22)で形質転換した。IPTGを添加してEspP合成を誘導した後、パルスチェイス標識を行い、0分、1分、5分でサンプルを採取しました。各アリコートの半分をUV照射し、残りの半分を非照射対照として使用した。次に、EspP C末端ペプチド...

ディスカッション

この論文では、部位特異的な光架橋とパルスチェイス標識を組み合わせて、目的のタンパク質と生細胞の他の成分との間の相互作用のダイナミクスを調べる方法について説明します。この方法は、タンパク質が他の因子と順次相互作用する多段階プロセスを研究するのに特に役立ちます。従来の化学的架橋アプローチとは異なり、部位特異的な光架橋は、目的のタンパク質の個々のセグメントまたは個々の残基の状態に関する詳細な情報を提供します。この情報は、複数の独立したドメインまたはモジュールを持つタンパク質、またはここに示すように、オリゴマー複合体の異なるサブユニットと接触する比較的近い間隔の残基を持つタンパク質の分析に特に価値があります。おそらく、この方法の最大の利点は、多段階経路における一連のイベントとタンパク質間相互作用の動態に関する情報を提供できることです。さらに、合成中に架橋基を目的のタンパク質に取り込むことで、時間のかかる化学反応を実行したり、予測不可能な方法で天然環境を変化させる可能性のある化学試薬で細胞を処理したりする必要がなくなります。原則として、長波長のUV光を使用してBpaを活性化しても、細胞成分に大きな損傷を与えることはありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
QuikChange II 部位特異的変異導入キット	アジレント	200521
BPA (H-P-BZ-PHE-OH)	BACHEM	F-2800
TRAN35S-LABEL, 代謝標識試薬 (35S-L-メチオニンおよび35S-L-システイン, >1,000 Ci/mmol)	MP Biomedicals	51006
Spectroline SB-100P超高輝度UVランプ、365 nm	Spectronics Corporation	SB-110P
Spectroline Replacement Bulb 100S	Spectronics Corporation	11-992-15
Falcon Tissue Culture Plate, 6-well	Becton Dickinson Labware	353046
Disposable 125 ml Erlenmeyer flask	Corning	430421
Innova 3100 Shaking Water bath	新製品ブランズウィック・サイエンティフィック	n.a.