アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。
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この記事について
サマリー
要約
アデニル酸シクラーゼ（AC）シグナル伝達の感作は、薬物乱用やパーキンソン病などの神経精神や神経疾患の様々に関与している。のGαi/ o-ジ連結型受容体の急性の活性化は、AC活性を阻害する、ACの異種感作におけるこれらの受容体の持続的活性化および細胞内cAMPのレベルの増加に対し。以前の研究は、AC応答のこの増強は、D 2ドーパミンなどのオピオイド受容体μのGαi/ oの連結型受容体のいくつかのタイプの慢性的活性化に続いて、インビトロおよびインビボの両方で観察されることを実証した。交流の異種感作が最初に4年前に報告されたが、この現象の根底にあるメカニズムはほとんどわかっていない。機械論的データの欠如は、おそらく偏りのないアプローチが識別するのを補助できることを示唆し、この適応応答に関与複雑さを反映している交流の異種感作に関与する分子経路をING。これまでの研究では、交流の異種感を調整するコンポーネントの重複などのキナーゼとGbγシグナリングを示唆されている。交流の感作に関連したユニークで、追加の重複標的を同定するために、拡張性のcAMPの感作アッセイの開発と検証がより大きなスループットが必要になります。感作を研究する従来のアプローチは、連続的な細胞培養維持だけでなく、複数の洗浄工程を伴うcAMP蓄積を測定するための複雑な方法論を含む一般扱いにくい。これにより、384ウェルフォーマットでハイスループットスクリーニング（HTS）のために使用することができる強固な細胞ベースのアッセイの開発は、将来の研究を容易にするであろう。 2、D 2ドーパミン受容細胞モデル（ すなわち 。CHO-D 2LおよびHEK-AC6 / D 2L）を使用して、我々は5-Sに私達の48ウェル感アッセイ（> 20ステップ4〜5日間）に変換しているTEP、384ウェルフォーマットにおける単一日間のアッセイ。この新しいフォーマットは、小分子のスクリーニングに適している、と我々は、このアッセイの設計も容易に標的とするsiRNAライブラリースクリーニングを予想してsiRNAのリバーストランスフェクションのために使用することができることを実証している。
概要
異種または超感として知られている適応型アデニル酸シクラーゼ（AC）シグナル応答が最初にノーベル賞受賞者、博士マーシャルニーレンバーグの研究室で発見された。博士ニーレンバーグ、慢性δオピオイド受容体の活性化後に観察増加交流応答性はアヘン耐性および依存性1に関与する機構であったことを提案した。慢性δオピオイド受容体の活性化に加えて、交流信号伝達のこの神経適応応答は、他のいくつかののGαi/ O共役受容体2の持続的な活性化に続いて発生します。注目すべきことに、これらの受容体の多くは、痛み、神経精神障害および神経障害に関連する、μ/κオピオイド、D 2月4日 、ドーパミン、5HT 1AおよびM 2/4ムスカリン受容体2が含まれています。博士ニーレンバーグの調査結果に加えて、多くの証拠は、両方の慢性オピオイド受容体の活性化にACシグナリングの感作を結ぶ存在in vitroおよびin vivo 3-7 の M>。 ACの感作はまた、（総説については参考文献2を参照）、統合失調症およびパーキンソン病を含むD 2様ドーパミン受容体が関与する様々な疾患と関連している。感作の潜在的な重要性にもかかわらず、正確なメカニズムは、ACの応答性が大幅に未知のまま増加につながる持続的なのGαi/ O共役受容体....
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プロトコル
1。アッセイレディ細胞の増殖および凍結保存
- 1.0100μMのL-グルタミン、800μgの/μLG418、300μgの/μLハイグロ、100 U /μLを補ったハムF12培地さ15cm 2細胞培養ディッシュ上で培養したCHO-K1-DRD 2L（CHO-D 2L）は、細胞ペニシリン、100μg/ml/μlのストレプトマイシン、及び10％ウシ胎児血清（FBS）。
- 細胞が90〜95％コンフルエントになるまで、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートする。 10μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、37℃で5分間、細胞解離緩衝液3μlのを添加することにより細胞を採取培養液12μlのを使用して細胞を再懸濁し、トリパンブルー排除を用いて細胞を数える。
- 室温で5分間、500×gで細胞懸濁液を遠心分離する。上清を吸引除去し、凍結培地を5μl（10％ジメチルスルホキシド、90％Fで細胞ペレットを再懸濁BS）。所望の細胞濃度（ 例えば、1〜20×10 6細胞/μl）を達成するために、細胞懸濁液を希釈する。
- 各クライオバイアルに細胞溶液の一定量1.0μL。 -80℃で一晩細胞凍結容器中の凍結バイアルをインキュベートします。長期保存のために液体窒素タンクに凍結バイアルを転送します。
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結果
パートI.市販の細胞モデルを用いた小分子阻害剤を同定するための384ウェルの異種感作アッセイを開発する。
細胞モデルにおける異種感作を検討するために、私たちは "混ぜて読む」フォーマットに分析を効率化することができました多くの改良を行いました。キー修飾のいくつかは、以下の強調表示され、議論においてより詳細に記載されている。最初の重要なステップは、凍結保存した細胞26に連続的に培養した細胞から私たちの細胞培養を修正しました。現在、日常的に1〜20×10 6細胞/μlの濃度で細胞の培養バッチを凍結保存することができる。それぞれのアッセイのために、細胞ストックを解凍し、希釈し、計数し、次いで384ウェルプレートに直接播種する。培養期間の必要性を排除し、アッセイの利便性を増大させる。我々の以前の感作アッセイのフォーマットは、48ウェルTISS利用UE培養プレート、および、洗浄、デカント、転写工程、および（ 図1）結合アッセイろ過ベースの[3 H].......
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ディスカッション
異種感作の研究を促進する努力において、我々は、我々の以前の広範囲に合理化された方法の達成修飾されている「ミックスを読み「ハイスループットスクリーニングと試験作用機序に修正可能なフォーマットである。次のように我々のプロトコルへの主要な変更は、要約することができる。1）」アッセイ対応」試薬として凍結保存した細胞の使用、384ウェルフォーマットへのアッセイの2）小型化、3）のHTRF測定の活用cAMPを。
私たちの細胞ベースのアッセイのための凍結保存の採用が大幅に一日実験やスクリーニングの努力に私たちの一日のための効率性と再現性を向上しています。このアプローチは、業界標準であり、容易に26を設定すること学術研究に変換することができます。細胞培養効率を向上させるために、細胞のバイアルを解凍し、希釈した後、384ウェルプレートのfoで直接プレーティングするが、その細胞株に「棚試薬オフ」として使用される各アッセイR。我々は以前、無脊椎動物Gタンパク質共役型受容体のアンタゴニスト32,33の同定を目的とした研究において、凍結保存細.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
著者は、方法論的なトレーニングや検定の指針としてリチャード·ジンクとトッドWiernickiを承認したいと思います。また、熟読し、編集上の提案のためにジョン·ポール·スペンスに感謝します。この作品は、リリー研究賞プログラム（LRAP）を通じて健康MH 060397、脳と行動研究財団、およびイーライリリー·アンド·カンパニーの国立研究所によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CHO-K1-DRD2L細胞 | DiscoveRx | 930579C2 | |
| ハム's F12 media | VWR | SH30026fs | |
| ウシ胎児血清 | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Σ | A1720 | |
| ハイグロマイシン | フィッシャー | 50-230-5556 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ライフテクノロジー | 15070063 | |
| 15cm皿 | BD ファルコン | 353025 | |
| DMSO | Σ | D2650 | |
| 細胞解離バッファー | Life Technologies | 13150016 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Life Technologies | 10010-049 | |
| クライオバイアル | フィッシャー | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC処理 384ウェルプレート | パーキン・エルマー | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad ソフトウェア | NA | |
| 3-イソブチル-1-メチルキサンチン | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)スルピライド | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 トランスフェクション試薬 | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Lifeテクノロジー | T10282 | |
| 水、DNase、RNaseフリー | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | マコン | カスタム siRNA | |
| ノンターゲティング siRNA コントロール | ダルマコン | D-001206-14-20 | |
| siGlo レッド | ダルマコン | D-001630-02 |
参考文献
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by....
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再版と許可
