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方法論記事

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

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DOI：

10.3791/51218

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2014年1月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

この記事について

サマリー

アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。

要約

アデニル酸シクラーゼ（AC）シグナル伝達の感作は、薬物乱用やパーキンソン病などの神経精神や神経疾患の様々に関与している。のGαi/ o-ジ連結型受容体の急性の活性化は、AC活性を阻害する、ACの異種感作におけるこれらの受容体の持続的活性化および細胞内cAMPのレベルの増加に対し。以前の研究は、AC応答のこの増強は、D 2ドーパミンなどのオピオイド受容体μのGαi/ oの連結型受容体のいくつかのタイプの慢性的活性化に続いて、インビトロおよびインビボの両方で観察されることを実証した。交流の異種感作が最初に4年前に報告されたが、この現象の根底にあるメカニズムはほとんどわかっていない。機械論的データの欠如は、おそらく偏りのないアプローチが識別するのを補助できることを示唆し、この適応応答に関与複雑さを反映している交流の異種感作に関与する分子経路をING。これまでの研究では、交流の異種感を調整するコンポーネントの重複などのキナーゼとGbγシグナリングを示唆されている。交流の感作に関連したユニークで、追加の重複標的を同定するために、拡張性のcAMPの感作アッセイの開発と検証がより大きなスループットが必要になります。感作を研究する従来のアプローチは、連続的な細胞培養維持だけでなく、複数の洗浄工程を伴うcAMP蓄積を測定するための複雑な方法論を含む一般扱いにくい。これにより、384ウェルフォーマットでハイスループットスクリーニング（HTS）のために使用することができる強固な細胞ベースのアッセイの開発は、将来の研究を容易にするであろう。 2、D 2ドーパミン受容細胞モデル（ すなわち 。CHO-D 2LおよびHEK-AC6 / D 2L）を使用して、我々は5-Sに私達の48ウェル感アッセイ（> 20ステップ4〜5日間）に変換しているTEP、384ウェルフォーマットにおける単一日間のアッセイ。この新しいフォーマットは、小分子のスクリーニングに適している、と我々は、このアッセイの設計も容易に標的とするsiRNAライブラリースクリーニングを予想してsiRNAのリバーストランスフェクションのために使用することができることを実証している。

概要

異種または超感として知られている適応型アデニル酸シクラーゼ（AC）シグナル応答が最初にノーベル賞受賞者、博士マーシャルニーレンバーグの研究室で発見された。博士ニーレンバーグ、慢性δオピオイド受容体の活性化後に観察増加交流応答性はアヘン耐性および依存性1に関与する機構であったことを提案した。慢性δオピオイド受容体の活性化に加えて、交流信号伝達のこの神経適応応答は、他のいくつかののGαi/ O共役受容体2の持続的な活性化に続いて発生します。注目すべきことに、これらの受容体の多くは、痛み、神経精神障害および神経障害に関連する、μ/κオピオイド、D 2月4日 、ドーパミン、5HT 1AおよびM 2/4ムスカリン受容体2が含まれています。博士ニーレンバーグの調査結果に加えて、多くの証拠は、両方の慢性オピオイド受容体の活性化にACシグナリングの感作を結ぶ存在in vitroおよびin vivo 3-7 の M>。 ACの感作はまた、（総説については参考文献2を参照）、統合失調症およびパーキンソン病を含むD 2様ドーパミン受容体が関与する様々な疾患と関連している。感作の潜在的な重要性にもかかわらず、正確なメカニズムは、ACの応答性が大幅に未知のまま増加につながる持続的なのGαi/ O共役受容体の活性化に関連する。

これらの研究は、重要な神経生物学的ターゲットとしてアデニル酸シクラーゼの感作のためのメカニズムを調べるための理論的根拠を提供する。同様に、個々のACアイソフォームは、この適応応答で開催8シグナリング交流の生理的関連性と重要性も2,9,10を認識すべきである。我々の研究の文脈において、ACの組換えアイソフォームの異種感作に関連する一般的な特徴は、それらの特性をパラレルデ交流の内因性のアイソフォームを研究するためcribed。具体的には、これまでの研究では、Gαiを/ Oタンパク質および後続のリリース/再配置βγサブユニットの活性化は、すべてのACアイソフォームの受容体誘起感のために重要な要件であることを発見した。さらに、いくつかの研究は、タンパク質キナーゼおよびGβγサブユニットからの信号を感作2,11-13に関与していることを示唆している。個々のACSでは、ユニークで明確な感パターン12が表示されます。密接に関連AC3を2増感されていないのに対し、例えば、アゴニストに対するD 2受容体の持続的な露出は、Ca 2 +の/カルモジュリン刺激14,15にAC1及びAC8の感作に関連している。 AC2、AC4、およびAC7は密接に関係しているが、しかし、唯一のPKC-刺激されたAC2活性は堅牢にアゴニスト7,14,16,17にD 2受容体の長期暴露後の増感されている。さらに、AC5およびAC6はheterの著しい度合いを示しているologous D 2受容体14,18-20の活性化に続いてガスとフォルスコリン刺激cAMP蓄積への感作が、Gβγサブユニット-交流の相互作用21のために彼らの要件が異なっているように見える。 AC感作のほとんどの研究は、モデル細胞株（ 例えば、HEK293細胞は、個々のACアイソフォームを発現する）を使用したが、これらの知見は、天然の神経細胞モデル4,22に変換するようである。より最近では、ACアイソフォームを発現するHEK293細胞において同定されたACアイソフォーム選択的小分子阻害剤の効果はまた、 インビボ行動研究23に変換することができる。

異種感作のために特定の分子メカニズムの欠如はおそらく適応応答の複雑さだけでなく、個々のAC 12アイソフォームのユニークな調節特性を反映している。このような複雑さの解明をさらに面倒な方法論tの使用により複雑である帽子は公平なアプローチを採用することから、学術研究者が限られている。そして48ウェル組織培養フォーマット15 -たとえば、私たちの前の機械論的研究では、24を使用して継続的に培養された細胞モデルの使用を含んだ。培養した細胞は通常、48時間増殖させた後、細胞の洗浄及びインキュベーションのシリーズ（ 図1）に続いて、アゴニスト薬物治療（2月18日時間）にかけた。 ACアイソフォーム特異的cAMP蓄積プロトコルが次に方法論15,24を結合面倒で時間がかかる[3 H] cAMPを用いたcAMP蓄積を測定し使用した。各アッセイのために最初から最後までの期間は、通常、細胞播種からデータ分析（ 図1）に四から五日間の合計を必要とした。新しい技術や自動化の適用は産業およびHTSセンターの設定で感作性試験のためにマークの強化につながっている。たとえば、グループはケミコンのためのナショナルセンターでの作業校正ゲノミクスは、2日は1,536ウェルフォーマット25にμオピオイド受容体誘発される感作の小分子阻害剤を同定するためのアッセイ方法をHTS報告した。

本稿では、ほとんどの学術研究機関で利用できる技術を使用して、異種感の研究のためのHTSアッセイを開発するための取り組みを説明します。この戦略は、異種内因性または個々の組換えアデニリルシクラーゼアイソフォーム（CHO-D 2L又はHEK-AC6 / D 2 L）との組み合わせでD 2ドーパミン受容体を発現する細胞モデルからの凍結保存細胞の使用を組み込むことによって達成された。私たちのスループットを向上させるために、我々は基本的に「ミックス読み」だった384ウェルフォーマットで5段階の、一日アッセイに私達の48ウェル感アッセイ（4-5日間の約 > 20ステップ）を再設計。新しいフォーマットは、cAMPのACCを測定するために、市販の均一時間分解蛍光（HTRF）アッセイを使用していますマルチモードプレートリーダーを用いて無傷の細胞内umulation。アッセイは、堅牢で、小分子のスクリーニングに適している、そして効果的に異種感作の阻害剤をスクリーニングするために適用することができる。加えて、我々は一般的なアプローチへのわずかな修正を加えてターゲットまたは全ゲノムのsiRNAライブラリースクリーニングのためのsiRNAのリバーストランスフェクションで、このアッセイを使用することを可能にするデータを提供する。

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プロトコル

1。アッセイレディ細胞の増殖および凍結保存

  1. 1.0100μMのL-グルタミン、800μgの/μLG418、300μgの/μLハイグロ、100 U /μLを補ったハムF12培地さ15cm 2細胞培養ディッシュ上で培養したCHO-K1-DRD 2L（CHO-D 2L）は、細胞ペニシリン、100μg/ml/μlのストレプトマイシン、及び10％ウシ胎児血清（FBS）。
  2. 細胞が90〜95％コンフルエントになるまで、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートする。 10μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、37℃で5分間、細胞解離緩衝液3μlのを添加することにより細胞を採取培養液12μlのを使用して細胞を再懸濁し、トリパンブルー排除を用いて細胞を数える。
  3. 室温で5分間、500×gで細胞懸濁液を遠心分離する。上清を吸引除去し、凍結培地を5μl（10％ジメチルスルホキシド、90％Fで細胞ペレットを再懸濁BS）。所望の細胞濃度（ 例えば、1〜20×10 6細胞/μl）を達成するために、細胞懸濁液を希釈する。
  4. 各クライオバイアルに細胞溶液の一定量1.0μL。 -80℃で一晩細胞凍結容器中の凍結バイアルをインキュベートします。長期保存のために液体窒素タンクに凍結バイアルを転送します。

2。アッセイレディ細胞（およびリバーストランスフェクションオプション）メッキ

  1. 急速に37℃の水浴中で細胞の凍結クライオバイアルを解凍する。細胞を解凍したら、のOpti-MEM 9μLを含む15μlのコニカルチューブに細胞を移し、チューブ3-5X転倒混和。
  2. 室温で5分間、500×gで細胞を遠心分離する。上清を吸引し、1μLのOpti-MEM中で細胞を再懸濁。
  3. 細胞生存率を決定し、必要に応じて（ 例えば、図3×10 5細胞/μlの濃度）中で生存細胞を希釈し、トリパンブルー排除を用いて細胞を数えるのOpti-MEM。組織培養中の細胞のプレートに10μl/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、384ウェルプレートを処理した。
  4. （勧告を製造していますによると - セクション7を参照）細胞によるcAMP産生を推定するための標準曲線を作成するのOpti-MEM中のcAMPの連続希釈液を作る。プレートにcAMP標準の10μL/ウェルを追加します（注）。単一の標準曲線は、アッセイプレートの1に別のプレートやブランクウェルに調製することができる。
  5. 室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。

3。 * siRNAトランスフェクション·オプションを逆転

このセクションでは、図3にはオプションと関連しています。

  1. RNaseフリーのddH 2 O（ 例えば 0.4ピコモル/μL）でのsiRNAの溶液を調製する。 384ウェルプレートの各ウェルに5μLを追加し、15 SEの100×gで遠心プレート室温でC。
  2. 0.006倍のOpti-MEM中でリポフェクタミン2000を希釈（ 例えばのOpti-MEM千μlにリポフェクタミン2000の6μLを加える）、そして上下にピペッティングにより混和する。
  3. 室温で5分間、リポフェクタミン2000/Opti-MEM溶液をインキュベートする。すでにsiRNAのが含まれている384ウェルプレートの各ウェルに希釈したリポフェクタミン2000/Opti-MEM溶液5μlを加える。室温で15秒間100×gでプレートを遠心分離する。
  4. 室温で30分間プレートをインキュベートする。
  5. 上記のようなプレートアッセイ準備細胞（第2節）。室温で15秒間100×gでプレートを遠心分離する。
  6. （説明を参照してください）ノックダウン標的遺伝子のために決定された48〜96時間、37℃（5％CO 2）の加湿インキュベーターにアッセイプレートを返します。

4。低分子スクリーニング

  1. オプティに目的の薬物（ 例えば、小分子阻害剤）を希釈する-MEM所望の最終濃度が6倍にする。連続希釈は、手持ちピペット又は液体ハンドリングステーションを使用して完成させることができる。
  2. 試験化合物の2.5μL/ウェルを追加したり、マルチチャンネルピ ​​ペットを用いて、ウェルの側に車両（ 例えば 、DMSO）を含有する緩衝液。
  3. 遠心分離機、室温で15秒間、100×gでプレート（インキュベーションはオプションです）。

5。永続的なアゴニスト治療

  1. のOpti-MEM中キンピロールの600 nMの（ すなわち 。100 nMでの6回の所望の最終濃度）溶液を調製する。
  2. 2.5μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、ウェルの側に600 nMのキンピロールソリューションを追加します。
  3. 室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、2時間、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。

6。のcAMP蓄積の刺激

  1. 2時間のインキュベーションの間、stimulatiを準備のOpti-MEM内の溶液に。刺激溶液を、40μMのフォルスコリン、2μMの3 - イソブチル-1 - methyxanthine（IBMX）、及び4μMのスピペロン（ステップ6における全ての濃度は、所望の最終濃度を4倍している）から構成されている。
  2. 5μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、ウェルの側面に刺激溶液を加える。
  3. 室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間室温でインキュベートする。

7。 cAMPの蓄積の消光と評価

  1. 細胞によるcAMPの産生を、製造業者の説明書に従ってcAMPのダイナミック2キットを用いて測定される。簡潔には、蒸留水中の抗cAMP-クリプテートおよびcAMP-d2とを再構成する。短期保存のために-20℃で一定分量を凍結する。
  2. 作業溶液を作るために製造業者の指示に従って溶解緩衝液中で別々に抗cAMP-クリプテートおよびcAMP-D2の一方のアリコートつのアリコートを希釈する。
  3. ADD抗cAMP-クリプ作業溶液および10μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、384ウェルプレートにcAMPの-D2の作業溶液の10μlの/ウェル。
  4. 室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間室温でインキュベートする。
  5. 337 nmの励起を用いた蛍光プレートリーダー（感度の自動スケール設定）でプレートを読んで、あたりの620 nmおよび665 nmでの排出量を測定する指示を製造しています。
  6. 指示を製造してあたりのcAMP標準曲線を評価するためのレシオメトリック分析を適用します。得られた値を用いて、データ解析ソフトウェアを用いて、試験ウェル中の推定されたcAMP蓄積を推定する。

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結果

パートI.市販の細胞モデルを用いた小分子阻害剤を同定するための384ウェルの異種感作アッセイを開発する。

細胞モデルにおける異種感作を検討するために、私たちは "混ぜて読む」フォーマットに分析を効率化することができました多くの改良を行いました。キー修飾のいくつかは、以下の強調表示され、議論においてより詳細に記載されている。最初の重要なステップは、凍結保存した細胞26に連続的に培養した細胞から私たちの細胞培養を修正しました。現在、日常的に1〜20×10 6細胞/μlの濃度で細胞の培養バッチを凍結保存することができる。それぞれのアッセイのために、細胞ストックを解凍し、希釈し、計数し、次いで384ウェルプレートに直接播種する。培養期間の必要性を排除し、アッセイの利便性を増大させる。我々の以前の感作アッセイのフォーマットは、48ウェルTISS利用UE培養プレート、および、洗浄、デカント、転写工程、および（ 図1）結合アッセイろ過ベースの[3 H]...

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ディスカッション

異種感作の研究を促進する努力において、我々は、我々の以前の広範囲に合理化された方法の達成修飾されている「ミックスを読み「ハイスループットスクリーニングと試験作用機序に修正可能なフォーマットである。次のように我々のプロトコルへの主要な変更は、要約することができる。1）」アッセイ対応」試薬として凍結保存した細胞の使用、384ウェルフォーマットへのアッセイの2）小型化、3）のHTRF測定の活用cAMPを。

私たちの細胞ベースのアッセイのための凍結保存の採用が大幅に一日実験やスクリーニングの努力に私たちの一日のための効率性と再現性を向上しています。このアプローチは、業界標準であり、容易に26を設定すること学術研究に変換することができます。細胞培養効率を向上させるために、細胞のバイアルを解凍し、希釈した後、384ウェルプレートのfoで直接プレーティングするが、その細胞株に「棚試薬オフ」として使用される各アッセイR。我々は以前、無脊椎動物Gタンパク質共役型受容体のアンタゴニスト32,33の同定を目的とした研究において、凍結保存細...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者は、方法論的なトレーニングや検定の指針としてリチャード·ジンクとトッドWiernickiを承認したいと思います。また、熟読し、編集上の提案のためにジョン·ポール·スペンスに感謝します。この作品は、リリー研究賞プログラム（LRAP）を通じて健康MH 060397、脳と行動研究財団、およびイーライリリー·アンド·カンパニーの国立研究所によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CHO-K1-DRD2L細胞DiscoveRx930579C2
ハム's F12 mediaVWRSH30026fs
ウシ胎児血清VWRSH3007003
G418ΣA1720
ハイグロマイシンフィッシャー50-230-5556
ペニシリン/ストレプトマイシンライフテクノロジー15070063
15cm皿BD ファルコン353025
DMSOΣD2650
細胞解離バッファーLife Technologies13150016
リン酸緩衝生理食塩水Life Technologies10010-049
クライオバイアルフィッシャー976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC処理 384ウェルプレートパーキン・エルマー6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad ソフトウェアNA
3-イソブチル-1-メチルキサンチンSigmaI5879
(±)QuinpiroleSigmaQ111
SpiperoneSigmaS7395
ClozapineSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S-(-)スルピライドSigmaS112
Lipofectamine 2000 トランスフェクション試薬Invitrogen11668019
Trypan blueLifeテクノロジーT10282
水、DNase、RNaseフリーMP Biomedicals821739
Gas siRNAマコンカスタム siRNA
ノンターゲティング siRNA コントロールダルマコンD-001206-14-20
siGlo レッドダルマコンD-001630-02
ズ ダル

参考文献

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