ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

サマリー

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。

要約

クロマチンは様々なDNA依存性プロセスを制御するDNAやタンパク質で作られた非常にダイナミックな核タンパク質複合体である。特定の領域におけるクロマチン構造および機能は、転写因子、およびDNAメチル化を含むヒストンの翻訳後修飾（hPTMs）および変異体、クロマチン結合タンパク質の局所的な濃縮によって調節される。個別の機能領域でのクロマチン組成のプロテオミクス特性評価は、これまで質量分析（MS）によるその後の詳細な分析のための適切な純度と量でそのようなドメインを豊かにするために、効率的なプロトコルの不足によって妨げられてきた。取クロマチン免疫沈降は、その機能、hPTMs、変異体および共同関連する非histonicタンパク質の面で明確なクロマチン領域を分離するために使用され、それによって我々は、ここにChroP（CHRO MATIN のP roteomics）という名前の新 ​​たに設計されたクロマチンプロテオミクス戦略を、している記述MSにより分析した。我々は彼を説明ヒストンH3上のリシン9のトリメチル化の存在によってマークされた転写サイレントヘテロクロマチン領域に濃縮および分析のためのChroPのの設定、再。達成された結果は、徹底的にヘテロクロマチンプロテオームを特徴付けるChroPの可能性を実証し、クロマチンの異なるタンパク質決定因子が相互作用し、遺伝子座特異的構造的および機能的な構成を確立するために、相乗作用方法を理解するための強力な分析戦略としてそれを証明する。

概要

クロマチンはすべてのDNA媒介プロセスの主要なテンプレートとして関与している非常に動的な核タンパク質複合体である。ヌクレオソームはクロマチンの基本的な繰り返し単位であり、DNAの147塩基対が^{、1,2ラップ}回される各カノニカルヒストンH2A、H2B、H3及びH4、2分子を含有するタンパク質性八量体コアからなる。すべてのコアヒストンは、ヌクレオソームの外に突出している球状ドメインで柔軟なN末端 ​​「テール」として構成されている。クロマチン構造とダイナミクスを調節するための主要なメカニズムの一つは、主にヒストン^3,4のN-末端に生じる共有結合性翻訳後修飾（PTMを）に基づいている。ヒストン修飾がヒストン-DNA間、またはヌクレオソーム間の接触を変化させることにより、高次クロマチン構造を変化させるため、DNA結合タンパク質（ シスメカニズム）のアクセスを制御することのいずれかによって機能することができ、又はdockinとして作用することにより調節タンパク質のために、単一のユニット、または多量体複合体に埋め込まれたようなグラム·サイト。そのような調節タンパク質は、異なる方法でその機能を発揮することができる：直接遺伝子発現（ すなわち、TAFタンパク質）を調節することによって、またはヌクレオソーム位置決め（ すなわち、クロマチンリモデリング複合体）を変えることにより、又は他のヒストン残基を修飾することにより....

プロトコル

1。細胞培養

1. ネイティブチップ用の標準培地
   1. 10％ウシ胎児血清（FBS）、1％グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10mM HEPES（pH7.5）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を成長させる。
2. チップ架橋するSILACラベリング
   1. 10％透析FBS、1％グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、10mMのHEPES pH7.5および光L-リジン（Lysで0）、L-のいずれかを補充したリジンおよびアルギニンの枯渇したSILAC DMEM培地中にHeLa細胞を、成長アルギニン（Arg 0）またはその重対応物、L-リジン（Lysで8）およびL-アルギニン（Arg 10）（ 材料表）をそれぞれ73ミリグラム/ Lおよび42 mg / Lでの最終濃度。
   2. 完全な同位体コードアミノ酸の取り込みを確実にするためにSILAC培地で最大8つの世代のために細胞を増殖させる。彼らは交流でそれらを播種し、1.0〜1.5×10 ⁶細胞/ mlの密度に達したとき、2日ごとに細胞を通過3×10 ⁵細胞/ mlのoncentration。
   3. SILAC培地の悪い組成物から生じ得る生理学からの任意の可能な変化を個別化するためにSILAC培....

結果

クロマチン免疫沈降は、ゲノムに沿って、タンパク質やヒストン修飾の局在をプロファイルするために使用される強力な手法です。プロテオミクスと同等で、チップは、目的の変更またはタンパク質と一緒に免疫沈降「餌」として使用される質的にも量的にhPTMs、ヒストン変異体およびクロマチン結合タンパク質を同定するために、MSベースのプロテオミクスが続いている。 図1Aに概説したN-ChroPアプローチにおいて、クロマチンをMNase（ 図1B）で消化し ​​た天然のChIPは、別個の機能ドメインクロマチン大部分から精製するための入力として使用される。モノ - ヌクレオソームに富む消化したクロマチンは、特定の抗体と共にインキュベートし、免疫精製タンパク質を、SDS-PAGEによって分離されている。図の例では、のH3K9me3、サイレントクロマチン^32,33のマーカーは、アプローチを設定するために使用されます。選択は、事実に基づいていると、両方の機能的役割だけでなく、そのタンパク質相互作用因子のいくつかは十分に説明されています。また、完全なヌクレオソームは、正しい化学量.......

ディスカッション

我々は最近ChroP、クロマチンのタンパク質成分の大規模な特性評価のための定量的な戦略を記載している。 ChroPは、その強度から利益とそれぞれの限界を克服し、エピジェネティックなフィールドは、チップとMSで使用される2つの相補的なアプローチを組み合わせています。深いシーケンシング（チップ配列）に結合されたチップは、数ヌクレオソーム³⁵の解像度でヒストン修飾のゲノムワイドなマッピングが可能。それらの感受性に有利で ​​あるが、抗体に基づくアッセイは、同様の変更を区別する能力およびヒストンコード³⁶のコンビナトリアル態様の分析において制限されている。 MSは単独で、hPTMsの包括的かつ公平な分析を提供し、それらの組合せ^9では 、これまでの遺伝子座特異的なPTMのpattersに関する情報の欠如と、その結果として、バルククロマチンの解析に適用したが、一方。私たちは、機能的に分離するために、チップの修正版を採用ヒストンのPTMパターンと非histonicタンパク質を特徴づける明確なクロマチンドメインおよび質量分析法を具体的にCOに富む。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEMの	ロンザ	BE12-614F
FBS	Invitrogen	10270-106
SILAC DMEM	M-Medical	FA30E15086
透析 FBS	Invitrogen	26400-044
リジン 0 (12C6 14N2 L-リジン)	Sigma Aldrich	L8662
アルギニン 0 (12C6 14N4 L-アルギニン)	Sigma Aldrich	A6969
リジン 8 (13C6 15N2 L-リジン)	Sigma Aldrich	68041
アルギニン 10 (13C6 15N4 L-アルギニン)	Sigma Aldrich	608033
Micrococcal Nuclease	Roche	10 107 921 001
完全、EDTAフリー プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠	Roche	04 693 132 001
Spectra/Por 3 透析チューブ、3.5K MWCO、18mm フラット幅、長さ 50 フィート	Spectrumlabs	132720
QIAquick PCR精製キット	QIAGEN	28104
抗ヒストンH3トリメチル化K9-ChIPグレード	Abcam	ab8898
ストンH3ペプチドトリメチルK9	Abcam	ab1773
Dynabeads Protein G	Invitrogen	100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                           ビストリスゲル	Invitrogen	NP0335BOX
コロイドブルー染色キット	Invitrogen	LC6025
LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007
Formaldheyde	Sigma Aldrich	F8775
Aceti anhydride-d6	Sigma Aldrich	175641-1G
[header]
ギ酸	Sigma Aldrich	94318-50ML-F
ヨードアセトアミド ≥99% (HPLC)、結晶性	Sigma Aldrich	I6125
DL-Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43815
シーケンシンググレード修飾トリプシン、凍結 100 μg (5 × 20 μg)	プロメガ	V5113
ナノスプレーOD360μメートル×ID 75μm、ヒントID 8 μm コーティングされていない Pk 5	Microcolumn Srl	FS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & micro;m  15% C	Dr. Maisch GmbH	r13.aq.
炭素抽出ディスク、47 mm	Agilent Technologies	12145040
陽イオン抽出ディスク	Agilent Technologies	66889-U

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