ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

タンパク質は、治療薬⁶の最も急成長しているクラスであり、生物学的治療のパイプラインの急速な拡大は、タンパク質薬剤の開発および使用に関連した課題にますます注目が集中している。 One固有の考慮事項は、健康で機能する免疫系では、全ての細胞外タンパク質は、抗原提示細胞（APC）によってサンプリングされるという事実から生じる。一旦APCにより内部移行、タンパク質は、小ペプチドフラグメントに切断され、推定上の免疫原性のセグメントは、クラスII主要組織適合複合体タンパク質（MHC II）の溝にロードされる。ペプチド-MHC II複合体は、次いで、APCの表面に表示され、真の免疫原性ペプチドは、同族のCD4 T細胞表面受容体⁷との三元MHC II-ペプチド-T細胞受容体複合体を形成し、T細胞エピトープと呼ばれる。この臨界分子認識事象は、T細胞活性化をもたらす複雑なシグナル伝達カスケード、サイトカインの放出を開始するS、CD4 T細胞媒介B細胞の成熟とに結合して、問題のある外因性タンパク質をクリアしたIgG抗体を循環させる、最終的に生産。このように、免疫原性タンパク質は、構成のT細胞エピトープを同定およびMHC II複合体形成の原因の重要な残基を変異させることにより脱免疫化される可能性があります。これは、T細胞エピトープは、多数の広く免疫原性タンパク質全体に分散することができることは、注目に支持、およびエピトープ削除突然変異の大部分は、タンパク質機能または安定性の不慮の損失を引き起こす可能性がある。そのため、工学は生物学的療法は複雑で技術的に困難な客観的可能脱免疫が、成功したT細胞エピトープの削除プロジェクト^3,5,8-12のいくつかの例が存在する。主に抗体治療薬に限定されている移植ベースの「ヒト化」とは異なり、エピトープの削除は関係なく、配列、構造、機能の本質的に任意のタンパク質標的に適用することも、homologoの可用性私たち人間の足場。このようなアプローチを実装するための最初のステップは、標的タンパク質配列内に埋め込まれた鍵ペプチドエピトープの同定である。

合成ペプチドおよび組換えヒトMHC II分子を用いた高スループット生化学アッセイは、エピトープ同定と緩和^1,3-5への迅速な予備的な洞察を提供することができます。これらのELISA型アッセイは、他のタンパク質/ワクチン設計および開発ツールへの強力な補完することができます。例えば、エピトープマッピングに1十分に確立された実験的なアプローチは、時間、労力に依存しており、集中的なex vivoでの細胞増殖アッセイ^{15リソース} 。簡単に言えば、標的タンパク質の一次配列は、最初の重複ペプチドのパネルに分割され、12残基と、多くの場合、15量体は、隣接するペプチドとの間で重複している。ペプチドのパネルは、化学的に合成され、各ペプチドの免疫原性は、Blooの周辺を用いるいくつかの異なるイムノアッセイのいずれかで試験するd個の単核細胞（PBMC）、ヒトのドナーから単離された^13,14。検索結果においてより大きな信頼性を提供するために、ペプチドは、典型的には50以上の異なるドナーからのPBMCを使用してレプリケートで試験する。脱免疫化は、究極の目的である場合において、作業が変異したペプチドの追加のパネルを生産し、その後の機能解析¹⁰のために、全長タンパク質内の任意の脱免疫化変異を導入する前に、PBMCアッセイにおいて新規なペプチドのパネルを試験する必要性によってさらに悪化する。これらの細胞アッセイは、ヒト患者における免疫原性を評価するためのゴールドスタンダードまま、このような徹底的なアプローチの効率は、迅速かつ高スループットMHC II-ペプチド結合アッセイを用いて推定される免疫原性エピトープをプレフィルタリングすることによって改善される可能性があります。

同様に、生化学的ペプチド-MHC II結合アッセイは、ラジカルエピトープ同定プロセスを加速するためにインシリコにおける予測方法と組み合わせることができる。T細胞エピトープ予測のための計算のさまざまなツールが存在し、その例は、のProPred ^16が含まれ、MHCPred ^{17、SVRMHC 18、ARB 19、20を} SMM-揃え、NetMHCIIpan ²¹だけでなく、EpiVax ²²によるこのようなエピマトリックスなどの独自のツール。同様に、エピトープ予測因子は最近、脱免疫変異は、タンパク質の構造と機能^23〜26を崩壊させる可能性があるリスクを軽減するために設計された統合タンパク質脱免疫アルゴリズムを得るために、他のバイオインフォマティクスと分子モデリングツールと統合されました。いくつかのエピトープ予測因子が合理的に正確^27,28であることが証明されているが、計算結果は、常に実験的な検証が必要。迅速な高スループット、費用効果的な実験方法は、インシリコエピトープ予測内の予備フィルターとして最適です。

同じような文脈では、エピトープ予測因子は、逆vaccinoloための抗原選択を駆動することができますGY ^29,30。例えば、バイオインフォマティクスの進歩が急激に病原体プロテオームから抽出された全タンパク質又はペプチドエピトープの形でワクチン候補を同定する全ゲノムスクリーニングをもたらした。これを可能にする技術は、保護ワクチンの発見と開発を再形成されているが、免疫原性のワクチン候補の頑丈に大規模なリストの形で新たな挑戦を紹介します。ハイスループットペプチド-MHC II結合アッセイは、ペプチド結合親和性を定量化し、複数のMHC II対立遺伝子の中で乱雑に結合することによって、エピトープの選択を導くことができる。タンパク質脱免疫を持つように、このような実験方法は、最終的に有望なワクチンリードの計算予測を検証するために必要とされる。

ここで、384ウェルフォーマットにスケーリングされたペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。プロトコルは、高度に並列化され、以前に、96ウェルプレートフォーマット^1,3-5記載と比較して75％試薬コストを削減する。シングルリキを使用したDハンドリングロボットは、このメソッドは1研究者が簡単に8濃度未満48 HRの4 MHC II対立遺伝子型の範囲に渡って三連で約90試験ペプチドを分析することができます。この記事では、1 MHC IIアレルに対する7実験ペプチドの分析のための1の384ウェルELISAプレートのセットアップについて説明するが、容易に所望のペプチドおよび/またはMHC任意の数の実験をスケールするように広がったシート電卓は、補足資料として提供されているII分子。

1結合：四大活動は、ペプチド-MHC II結合アッセイを含み、試験ペプチドは、可溶性MHC IIタンパク質の結合溶液相に対する標識対照ペプチドと競合する。結合は、試験ペプチド濃度の広い範囲にわたって測定される。 2 - キャプチャ：結合反応が平衡に近づく後、ペプチド-MHC II複合体を捕捉し、固定化された抗体とのコンフォメーション依存認識による未結合のペプチド及び蛋白質から分離される。 3 - 検出：キャプチャコントロールペプチドを定量的に時間分解蛍光を用いて検出される。 4 - 分析：分光データは、処理されたプロットし、試験ペプチド及びMHC IIタンパク質の用量依存的な結合特性を確認するために分析される。

1が利用可能な場合、以下の手順の様々なステップでは、液体ハンドリングロボットの使用が推奨されます。特に、384ウェル形式で、液体の自動分配および希釈は、ユーザエラーを最小にする、より詳細な結果ウェル間のボリューム一貫性、および手動96ウェルアッセイ（データは示していない）と比較してIC ₅₀値に対する下位95％信頼区間が得られる。液体処理ロボットが使用できない場合、「（液体処理ロボット）」で注釈工程は手作業で行われてもよい。可能な場合は同様に、384ウェルフォーマットと互換性のある自動プレート洗浄機をお勧めします。これは事実上、プレート洗浄プロセスを標準化しています。プレート洗浄機を使用できない場合は、「（プレートウォッシャー）」で注釈工程は手作業で行われてもよい。

1。コー​​トELISAプレート（1日目）

1. 希L243抗体ストック（0.5 mg / ml）をホウ酸緩衝液中の10μgの/ mlの作業濃度である。
   1. シングル384ウェルプレートをコーティングする、ホウ酸緩衝液9.8ミリリットルに株式抗体を200μlを加える。 （代替スケーリングのための補助的なスプレッドシートの計算機を参照してください）​​。
2. 384-Wの各ウェルにL243抗体溶液25μlを追加エル白ELISAプレートを高結合。 （液体ハンドリングロボット）
3. ポリエステルフィルムでプレートを密封し、4℃で一晩インキュベート
   注：各384ウェルELISAプレートは、15テスト1 MHC II対立遺伝子に8希釈でペプチドだけでなく、正と負の対照まで収容することができます。これは最終的に三連の測定値が得られる。

2。試験ペプチド希釈（1日目）を作る

1. DMSO中の各試験ペプチドの10mMストックから開始し、384ウェルポリプロピレンプレート（ 表1）を用いてクエン酸リン酸緩衝液で以下の希釈系列を作る。 （液体ハンドリングロボット）
   注：完全な384ウェルポリプロピレンプレートは、3つの別々のELISAプレートを必要とする。ポリプロピレン板の3分の1は唯一のELISAプレート（ 図1）が必要になります。

表1試験ペプチド希釈系列の調製 。

図1のペプチドマップは、ポリプロピレン384ウェルプレート中のペプチド希釈液のアッセイ（A）地図結合プレート 。各ポリプロピレン板が歌うに対する競合結合反応で15ペプチドの3グループを収容することができますルMHC II対立。結合反応が平衡に近づくと（B）、各ペプチド群は、抗MHC II抗体でプレコートされた別々の384 -ウェルELISAプレートに、三連で、転送される。

3。 MHC IIマスターミックス（1日目）を準備

1. 反応バッファーを作る
   1. クエン酸リン酸緩衝液3920μlに1 mMのPEFA圏の80μL及びオクチル-β-D-glucopyranaside 60mgのを追加します。 （代替スケーリングのための補助的なスプレッドシートの計算機を参照してください）​​。
2. 15ミリリットルコニカルチューブを使用して反応緩衝液中で101 nMである（ 表2）に選択されたMHC II原液を希釈します。
   注：MHC II濃度が最終的に結合反応し、中和ELISAアッセイで25 nMで50 nmとなります。 MHC IIストック濃度は、製造者のロット番号に依存して変化する。 （補足スプレッドシートの計算機を参照してください）​​。

表2。MHC IIマスターミックスの調製。

4。陰性および陽性対照（第1日）を準備

1. ステップ2.1から384ウェルポリプロピレンプレート（ 図1A）の「負の対照」ウェルにクエン酸リン酸緩衝液21.5μLを加える。
2. 384ウェルポリプロピレンプレートの「陽性対照」ウェルにクエン酸リン酸緩衝液21.5μLを加える。
   注： "POSITIVEコントロール」は、以下、セクション5で完了します。
3. 1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにステップ3.2およびピペットからMHC IIマスターミックスの49.5μLを削除します。
4. ステップ4.3からMHC IIマスターミックスの49.5μlにクエン酸緩衝液0.5μLを加える。
5. 384ウェルポリプロピレンプレートの「負の対照」ウェル（ 図1A）、ステップ4.4からMHC IIマスターミックスを調整する濃度の21.5を添加する。
   注：このサンプルは、MHC IIタンパク質、NOコントロールペプチド、お​​よびNO試験ペプチドを含む、ゼロ信号ネガティブコントロールを表す。

5。適切なコントロールペプチドは、MHC IIマスターミックス（1日目）に追加

*私たちは、経済のために10mgのスケールをご注文をおすすめします。
表3。様々なMHC II対立遺伝子の制御ペプチド。*

1. 20100μMで希釈されたストックを得るために、新鮮なDMSOにコントロールペプチド（DMSO中400μMのに格納されている）1:20に希釈する。
   1. 25μMの400μlの対照ペプチドを追加475μLのDMSO。注：これは大過剰であるが、粘性のDMSO溶液の正確なハンドリングを可能にします。
2. さらに、ステップ3.2からMHC IIマスターミックスにステップ5.1からのコントロールペプチド（20 mM）を1:100に希釈する。
   1. MHC IIマスターミックスの残りの2,850.5μlにステップ5.2に希釈したコントロールペプチドの28.8を添加する。
3. 384ウェルポリプロピレンプレート（ステップ4.2）（ 図1A）の陽性対照ウェルに対照ペプチド（ステップ5.2）で、MHC IIマスターミックスの21.5を添加する。注：このサンプルは、MHC IIタンパク質、コントロールペプチド、お​​よびNO試験ペプチドを含む高信号ポジティブコントロールを表します。

6。結合反応（1日目）を作る

1. 結合反応を作成するには、1:1の比率で試験ペプチド希釈液（ステップ2.1）のそれぞれにコントロールペプチド（ステップ5.2）を含むMHC IIマスターミックスを追加します。
   1. コンを含むMHC IIマスターミックスの21.5μLを追加ステップ2.1から各テストペプチド希釈の21.5μlにステップ5.2からペプチドをTROL。 （液体ハンドリングロボット）
2. ポリエステルフィルムとの結合反応を密封し、振とうせずに37℃でのCO ₂以外_の制御インキュベーター内で12月24日時間インキュベートする。

7。結合反応（2日目）を中和し、転送

1. 37℃のインキュベーターから結合反応（ステップ6.2）を含む384ウェルポリプロピレンプレートを取り外します。
2. 中和バッファーとの結合反応1:1に希釈する。 （液体ハンドリングロボット）
   1. 各ウェル結合反応を中和バッファーの43を添加する。
3. 4℃からELISAプレート（ステップ1.3）を取り外し、PBS-0.05％トゥイーン20の60ミリリットル/ウェルで3回洗浄します。 （プレートウォッシャー）
4. 転送ステップ7.3からの抗体でコーティングされた384ウェルELISAプレートの三重ウェルにステップ7.2から、各中和結合反応の25μlの。 （ 図1 強い>）（液体処理ロボット）
5. 一晩2.5時間37℃のインキュベーター内または4℃の冷蔵庫でポリエステルフィルムと場所でELISAプレートをカバーしています。

8。 ELISA法の開発（2日目または3）

1. ステップ7.5からELISAプレートを外し、60μL/ウェルのPBS-0.05％Tweenで3回洗浄する。 （プレートウォッシャー）
2. DELFIAアッセイ緩衝液中でストレプトアビジン-ユーロピウム保存溶液（0.1 mg / mlのストレプトアビジン、7のEu ^{3 +} /ストレプトアビジン）千倍に希釈します。
   1. 1 384ウェルプレートの場合は、10ミリリットルアッセイバッファーに10μlのストレプトアビジン - ユーロピウムを希釈。
3. ステップ8.1から384ウェルELISAプレートの各ウェルに希釈したストレプトアビジン - ユーロピウムの25を添加する。 （液体ハンドリングロボット）
4. 1時間室温で暗所でのポリエステルフィルムと場所でプレートをカバーしています。注意：1時間のインキュベーションの間、冷蔵庫から増強溶液を削除し、ROで暗所に10ミリリットル/プレート取っておくomの温度。
5. 1時間のインキュベーションに続いて、60μL/ウェルのPBS-0.05％Tweenでステップ8.3 3Xから384ウェルELISAプレートを洗う。 （プレートウォッシャー）
6. ステップ8.5から384ウェルELISAプレートの各ウェルに増強溶液25μlを追加します。 （液体ハンドリングロボット）
7. ポリエステルフィルムとの384ウェルELISAプレートを被覆し、プレートを10〜15分間室温で暗所で静置する。
8. 200、ストップ：INT：1,000、例340は、EM 10〜15分インキュベートした後、時間例えばユーロピウム設定で分解蛍光プレートリーダー（スタート、intを使用してステップ8.7から384ウェルELISAプレートの蛍光を読む。615、カットオフ：なし、PMT：オート/ウェル読み取ります。50）。

9。データ解析

1. サイド·バイ·サイドの列の3反復値（、Y =蛍光測定、X =試験ペプチド濃度）でのXY形式のグラフのデータを入力してください。
2. X =ログ（X）：ログには、すべてのデータのためのX値を変換する
3. ログTRAにフィットIC ₅₀値を抽出するために、1部位競合結合モデルにデータをnsformed。
4. 平均ネガティブコントロール値にボトム値を制約する。
5. グローバルトップ値にフィットし、グローバルフィットパラメータは下記、または陽性対照と同等であることを保証する。

エンテロバクター·P99の β-ラクタマーゼ（BLA）（Genbank登録IDを表示＃X07274.1）の成熟ペプチド配列は、MHC II対立遺伝子DRB1 * 1501（ 表4）の推定上のペプチド結合物についてのProPred 16で分析した。のProPredは義務P1アンカー残基（ すなわち 、M、L、I、V、F、Y、または31を結合MHC IIのために必要とされる位置1、でW）で117ノナマーペプチドを同定した。 5％の閾値において、以上の2.6に等しいスコアペプチドのみが可能性が高いバインダーである。従って、5％の閾値においてのみ、トップ11のペプチドは、MHC II DRB1 * 1501に結合することが予測される。

表4。トップスコアは、BLAペプチドおよび* 1501 MHC II対立遺伝子DRB1の予測をのProPred。

予測epitopの代表パネルESは、当社のMHC II結合アッセイ（ 表4、太字のエントリ）に分析のために選択した。 15残基のBLAペプチドフラグメントは、化学的に推定上の九量体MHC IIエピトープは合成タンパク質フラグメント内に埋め込まれたように合成した。 MHC II結合溝自体は、わずか9個のアミノ酸を収容しているが、証拠は、フランキング配列は、ペプチド-MHC II相互作用に影響を与えることができることを示唆し、15〜20残基の合成ペプチドは、したがって、一般的に15で使用される。生物学的に処理されたタンパク質断片で発生する可能性のある重複するエピトープの複雑さを表現するために、我々は、（II）は、単一の予測非結合体、（I）は、単一の予測のバインダーを含んで合成配列をテストし、（III）複数の（iv）は、複数の非結合体を予測し、バインダーを予測し、または（v）予測された結合剤および非結合体（ 表4及び5）の混合物。

化学的に合成されたペプチドの表5。リスト。

上記のプロトコルに記載されるようにMHC II DRB1 * 1501への結合について、ビオチン化MBP-B対照ペプチド（ 表3）と競合するこれらの合成ペプチドの能力を分析した。合成ペプチドに対する競合結合曲線を図2に示す。 IC 50値は、プリズムの1部位競合結合、非線形フィット関数（ 表6）を用いて、対数変換データを当てはめることにより計算した。 図2に見られるように、ペプチドは、天然に三つのグループに分割する：IC 50 <1μM（ペプチド2および10）との強力な結合剤; 1μM≤IC 50 <100μM（ペプチド4、9、11、及び24を有する中程度の結合剤）、IC 50≥100μ弱いバインダー、M（ペプチド31）。

図2。MHC IIアレルDRB1のためのBLAペプチドの競合結合曲線* 1501。タイトな結合剤にはオレンジ色のライン、適度なバインダー緑色の線、弱いバインダー栗色ラインに適合している。

表6。 DRB1 * 1501のためのBLAのペプチド断片のIC 50値を算出した。

レナードモイーズはによって採用さEpiVax社、プロビデンス、ロードアイランドに位置して個人所有のバイオテクノロジー企業でストックオプションを保持している。この調査報告書に含まれている仕事は、企業の商業目的に関連付けられる可能性の偏りがない。