3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

サマリー

この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。

要約

現在では周知の細胞および組織の微小環境は、腫瘍の開始と進行に影響を与える重要な調節因子であることが知られている。さらに、細胞外マトリックス（ECM）は、in vivoでの培養およびホメオスタシスにおける細胞の挙動の重要な調節因子であることが実証されている。二次元（2D）上で細胞を培養する現在のアプローチは、細胞及びそれらの微小環境との間の複雑な相互作用の妨害及び損失のプラスチック表面をもたらす。三次元（3D）培養アッセイの使用を介して、細胞-微小環境との相互作用のための条件は、in vivoでの微小環境に似ている確立されている。この記事では、周囲の環境への細胞浸潤の評価における3D培養の可能性を例示する、三次元基底膜タンパク質マトリックス中に乳癌細胞を成長させるための詳細な方法を提供する。加えて、我々はこれらの3Dアッセイはmolecシグナリングの喪失を検査する可能性を有する方法について説明手続きを免疫染色することにより上皮形態を規制ULES。これらの研究は、乳癌の広がりに必要な浸潤を調節するプロセスに重要な機構の詳細を識別するために助ける。

概要

個人または集団の細胞の移動および浸潤癌の2特徴である、癌細胞^1-4の転移拡散のために必要。転移を開始する癌細胞の能力は、遊走細胞の基底膜を分解するために浸潤突起を使用して、隣接組織に侵入するそれらの能力に依存する。浸潤突起はマトリックス分解プロテアーゼ⁵の放出を介して細胞外マトリックスの分解を可能にする動的なアクチンが豊富なマトリックス分解突起である。癌細胞浸潤は、癌細胞の移動、続いてマトリックスの分解を伴い、これは三次元（3D）マトリクス環境²の再編を伴う。このようにして、マトリックスを貫通するように、セルは、その形状を変形し、細胞外マトリックス^（ECM）2と対話する必要があります。

乳房組織の完全性の維持は、緊密に依存controlled個の組織構造の細胞ECMおよび細胞-細胞接着接合は、上皮極性の遺伝子発現および破壊に影響を与えるので^6-10癌の発症につながる可能性がある。しかし、このようなトランスウェルチャンバーアッセイまたは創傷スクラッチアッセイなどのほとんどのin vitroでの遊走および浸潤アッセイは、2次元（2D）であり、したがって、これらは、細胞とその隣接する環境^3,6,8,11-14間の複雑な相互作用を無視。細胞形態における変化、細胞分化、細胞-マトリックス接着、遺伝子発現パターンを含む、かなりの形態学的および機能的多様性は、一般に、2D ^2,6,8,11をアッセイに欠けている3D培養物中で細胞を培養することによって検出されている。このように、診療所^6月10日に、基礎研究における画期的な成果のより良い翻訳につながる、3Dアッセイの生体状態のより生理学的にrecapitulatingで有意に有益であり、使用しています。しかしながら、留意すべきである、3D培養物を用いて得られる多くの利点にもかかわらず、このモデルは、種々の細胞型を含むインビボでの腫瘍微小環境の複雑さのすべてをキャプチャすることはできません。しかし、癌細胞の接着および浸潤^15-17上の腫瘍間質の相互作用の効果を研究するために、3Dモデル（例えば、線維芽細胞、白血球、およびマクロファージ）への間質細胞を組み込むことが可能である。

培養中の乳房上皮細胞は、ラミニンおよびコラーゲンなどのECMタンパク質が存在する場合に最も効果的に成長する。これは公知で、市販のマトリックス混合物は、エンゲルブレス-ホルム-スウォーム（EHS）マウス腫瘍から誘導され、マトリゲル基底膜マトリックス^2,8として知られている。多数の技術が基底膜マトリックス^2,8に3次元のコロニーとして上皮細胞を成長させるために確立されている。三次元基底膜マトリックスモデルは、悪性および非悪性の両方の乳房細胞を確立するために有効である成長、 生体内環境^18,19で発生しているものに似ている。 MCF10A細胞は、非悪性乳腺上皮細胞である。基底膜マトリックス中で増殖させたときに、これらの細胞は、正常な乳房細胞のin vivo形質の展示および細胞増殖、細胞極性、及び管腔スペース^8,12,20を確立するために、アポトーシスを制御受ける。さらに、MCF10A細胞の細胞核の外観はより密接²¹単層で培養されたものよりも組織中の乳房上皮細胞のものに似ている三次元培養物中で腺房を形成する。ビッセルおよび同僚による研究は、悪性細胞が高度に無秩序な表現型を示すので、ラミニンに富む環境の中で増殖させ、増殖を増加させ、減少したときに悪性の乳房細胞は非悪性乳房細胞から分化することができることを明らかにした最初の細胞 - 細胞接着、間葉マーカーの発現増加及び侵襲性構造体の数の増加は^3,6,2を形成2。

セル環境の異常は、腫瘍形成^に影響^を与えることができる^20。三次元培養法を効果的に腫瘍細胞とその周囲の環境との間で生じる通信を研究し、このような通信方法^14,20,21,23タンパク質発現の影響を決定するために使用することができる。この記事では^、侵襲性を分析するために、3D培養物におけるMDA-MB-231乳癌細胞を成長させるため、および上皮マーカーラミニン、細胞基底膜^18,19,24の成分を用いて、上皮形態の損失を研究するための詳細な方法論を提供^25。詳細な手順は、正確かつ再現性の任意の浸潤癌細胞により星状（侵襲性）構造形成を定量化する能力を提供し、そのようなMDA-MB-231、Hs578T細胞、MCF-7、またはT47Dなどの一般的な乳癌細胞株（に限定されない）。従って、このアッセイは、タンパク質とどのように細胞内で発現または治療を評価するためのプラットフォームとして機能することができるプロまたは抗侵襲性化合物は、単一又は複数のセルにより、細胞外マトリックスの分解を調節する。

プロトコル

基底膜マトリックス中の乳癌細胞の1。三次元培養（埋め込み技術）

1. 取り扱いマトリゲル基底膜マトリックス：4℃で一晩を氷上で溶かす基底膜マトリックスは、低温で液体であるが、室温で固化する。氷（ 図1A、B）に基底膜マトリックスを保管してください。
2. 螺旋パターン（ 図1C）で、P-200ピペットマンのチップを用いて、マトリックス拡散による基底膜マトリックス50μlの共焦点No.1のガラスボトムディッシュをカバーしています。気泡の形成を回避するために、基底膜マトリックスを拡散する場合は注意が必要です。同様に、メニスカスの形成を防止するために、ガラスボトムディッシュの国境近くまで行列を広げないようにしてください。経験の浅い取り扱い基底膜マトリックスは、次いで氷上に配置でき、皿、P-200ピペットマンやピペットを予冷した場合（または4℃で冷蔵庫に一晩放置）。このステップの提供固形化の前に、基底膜マトリックスを広めるために追加の時間。 （ 図1D）を固化する基底膜マトリックスを可能にするために、少なくとも30分間（5％CO _2、37℃で）、細胞培養インキュベーター中皿（複数可）を配置します。
3. 行列が凝固を受けている間に、細胞の70〜80％コンフルエント100 mmのプレートをトリプシン処理。細胞がプレートから離れ持ち上げ始めたら、トリプシン（ 図1E）を不活性化するために、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI 1640培地10mlに再懸濁。その後、15ミリリットルコニカルチューブ（ 図1F）に再懸濁した細胞を移す。
4. 専用の細胞培養遠心分離機（ 図1G-H）で3分間、100×gで（円錐管中に存在する）の細胞をスピン。
5. 1ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞がスピンダウンされている間、一定分量行列50μlの（注：各ガラスボトムディッシュを1マイクロチューブが割り当てられ、それ故に、もし実験は）それは3マイクロ遠心管が同様に必要であるということに、3料理を必要とし、その後、氷（ 図1B）にチューブを配置します。
6. （ 図1I）乱さペレットを残しながら、ステップ1.4からのコニカルチューブから培地を吸引する。 FBSを補充したRPMI培地の1ミリリットル（ 図1J）に（スピンダウンしてきた）細胞を再懸濁する。
7. 細胞をマイクロ遠心チューブに血球計数器（ 図1K）、または細胞粒子カウンタのアリコートを2.5×10 ^4個の細胞を用いて計数し、50μl（ 図1L）の総容積を得るように適切なメディアを使用してそれを先頭したら。
8. 1:1の比率のステップ1.5からのマトリックスを含むマイクロチューブにステップ1.7（50μl中25,000細胞）から細胞を混合する;最終容量は100μL（ 図1M）になります。
9. Sにステップ1.8から細胞混合：優しく行列100μlのプレートステップ1.2からolidified基底膜マトリックスでコーティングされたディッシュ（ 図1N）。これは、基底膜マトリックスに埋め込まれるべき細胞を可能にする。
10. （5％CO ₂で37℃で）、細胞培養インキュベーター中皿（複数可）を転送できるようにし、マトリックス：細胞混合物は、少なくとも30分間凝固させる。
11. 行列はかつて：細胞混合物が固化し、ディッシュ（ 図1O）にFBSを補充したRPMI培地の2ミリリットルを追加し、実験（ 図1P）の残りのために保存されるインキュベーターをお皿を取り戻す。
12. 5日間毎日、メディアを変更（またはアッセイに必要なに従って、MDA-MB-231細胞のアッセイの持続時間の長さは5日である）。
13. 光学顕微鏡を用いて、微分干渉コントラスト基底膜マトリックス（ 図3A）に懸濁MDA-MB-231コロニーの（DIC）画像を撮影する。一日一回10倍の対物レンズでの像20代表のエリア5日間のコロニーの形態形成（ 図3C）を決定する。
14. 細胞コロニー星状形成（ 図3B）を決定するために盲目的に画像を分析。コロニー細胞のスフェロイドからの1つ以上の突起が知覚される場合星状であると見なされる。 、侵襲性星状コロニーの割合を決定取得画像あたりの細胞コロニーの総数で星状コロニーの数を分割し、各20日の画像の星状コロニーのパーセンテージを平均化する。

図1基底膜マトリックス（埋め込 ​​み技術）中のMDA-MB-231乳癌細胞の3次元培養。 AB）ドラフト内で行わ実験の模式図（）。C）コーティングされたガラスボトムディッシュのほか基底膜マトリックスを50μlと少なくとも30分間凝固させるマトリックスを可能にする（）、5％CO _2、37℃で細胞培養インキュベーター中に置いた。D）ディッシュ（複数可）E）細胞をトリプシン処理した。F ）細胞を円錐管に存在する。GH）細胞を（）組織培養遠心機で3分間100×gでスピンダウンした15ミリリットルコニカルチューブに再懸濁した。i）細胞ペレットをスピンダウンされています。J）細胞（）マイクロ遠心チューブに分注し^4個の細胞を2.5×10）L。K）細胞を血球計を用いて計数した。FBSを補充したRPMI培地1mlに再懸濁し、50μlの総体積を得るように適切なメディアを使用してオフに突破した。M 1:1の比率のステップ1.5からのマトリックスを含むマイクロチューブにステップ1.7からの）ミックス細胞（50μl中25,000細胞）;最終容量は100μなります。。、L、N）静かに行列を100μlプレート：ステップ8からの細胞混合ステップ1.2から固化したマトリックスでコーティングされたディッシュにO）行列たら：細胞混合物が固化するが、に、FBSを補充したRPMI培地の2ミリリットルを追加一品。P）は 、それが実験の残りのために保存されるインキュベーター内の皿を置きます。

免疫蛍光で3D培養の形態形成機能の2。検討

1. セットアップ製氷皿、冷リン酸緩衝溶液（PBS）、20％アセトン：80％メタノール（固定液）、および3％ウシ血清アルブミン（BSA;ブロッキング溶液）皿を取り出す前に（ 図2A）（複数可）インキュベーターから。
2. 製氷皿と吸引メディアにディッシュ（ES）を配置し、冷却したPBSの2ミリリットル（ 図2B）で3回洗浄します。
3. 図2C（皿（複数可）中に80％メタノール溶液：最後のPBS洗浄を吸引した後、20％の2mlのアセトンを追加図2D）で20分間細胞を固定します。
4. 固定の20分が終了すると、室温での料理を持ち帰る固定液を吸引し、その後、PBSで3回洗浄します。最終的なPBS洗浄を吸引した後、室温（ 図2E）で少なくとも30分間ブロックするディッシュ（ES）への3％BSAの2ミリリットルを追加します。
5. ブロック期間中にブロッキング緩衝液3％ウシ血清アルブミン（BSA）中に溶解し（適切な希釈で）一次（ラミニンV 1:100）および二次抗体の希釈液を調製する。細胞混合物：「BSA +一次抗体」ソリューションμL400〜500は、マトリックス上に直接追加する必要がありますのでご注意ください。
6. ブロッキングの30分の有効期限が切れた後、一次抗体を添加して、室温（ 図2F）で少なくとも1時間インキュベートする。何PBS洗浄は30分blockinに続いて実行されるべきではないことに注意してくださいG期間。
7. ステップ2.6が完了すると、「BSA +一次抗体」溶液を除去し、PBSで3回洗浄します。
8. 直接マトリックス上に（適切な希釈時）の3％BSAに溶解した二次抗体を追加します。細胞混合物、料理をカバーして、室温（ 図2G）で1時間インキュベートする。
9. 「BSA +二次抗体」溶液を除去し、PBSで3回洗浄します。
10. （ 図2H）核染色のためにPBSに溶解し、ヘキスト33258（1:10,000）の2ミリリットルを追加し、アルミホイルの下で5分間インキュベート（または光退色を制限する不透明の容器で覆い）。
11. ヘキスト33258トンとのインキュベーションの5分の有効期限が切れた後、PBSで（ES）5倍をお皿を洗う。
12. 直接マトリックス上に封入剤を追加し、共焦点ディッシュ中の細胞混合物と基底膜matriにおけるコロニーの完全性に任意の混乱を誘発防止するために、慎重にカバーガラスでカバーX：細胞混合物（ 図2I）。
13. ディッシュ（ES）は、室温（ 図2I）で一晩（または24時間）乾燥させます。乾燥したら、お皿（ES）は、-20℃で保存することができますが、それは非常に彼らは可能な限り迅速に画像化されるべきであることをお勧めします。
14. （ 図3D-E）使用される抗体の適切なレーザー波長を有する蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。

図2。免疫蛍光法によって3次元培養の検討。であって、a）実験装置の模式図は、B）ディッシュ（ES）製氷皿の上に置き、培地を吸引。 。続いて、細胞を冷PBS C）20％の2mlのアセトン2mlで3回洗浄した：80％のメタノール溶液をディッシュ（複数可）に添加しD）のための細胞を固定BSAは、室温で少なくとも30分間ブロックする皿（複数可）に加え、4℃（氷上でのいずれか、または冷蔵庫で）E）、3％、2 mlで20分F）の30分間一旦ブロッキングは、一次抗体を添加し、室温で少なくとも1時間インキュベートし、有効期限が切れているG）の適切な希釈率で3％BSA（）に溶解させた二次抗体は、基底膜マトリックス上に直接添加した：細胞混合物; 。続いて皿を覆い、室温で1時間インキュベートH）、ヘキスト2mlの（1:10,000; PBSに溶解）をアルミホイルで5分間インキュベートしdishe（ ​​複数可）、細胞に添加I）装着培地に直接添加した。マトリックス上：共焦点皿と皿中の細胞混合物をガラスカバースリップで覆われている。ディッシュ（ES）を室温で一晩（または24時間）乾燥させ。

結果

3Dマトリックスに侵入するMDA-MB-231細胞の例は、 図3Cに示されている。細胞は、マトリックス（1日目）に埋め込 ​​まれ、3日目で、侵襲性（星状）構造の形成を開始し、完全に5日目（ 図3C）によってマトリックスに侵入している。星状に形成されたコロニー数をカウントし、（侵襲性及び非侵襲性）ディッシュあたりのコロニーの総数のパーセンテージとして表す。測定は、5日間毎日行われているのでさらに、浸潤率も評価することができる。

形態形成のイベントのタイムラインを確立することは、これらのアッセイにおいて多数のパラメータをテストするための基礎を提供する。たとえば、乳癌細胞は、細胞骨格の再配置を促進することができる抗癌薬または薬物で治療することができ、及び浸潤に対するこれらの薬剤の効果が確認されていない細胞と比較して、車両^24を制御することができる。交互に、乳房の缶の容量侵襲的な突起を形成するために、CER細胞を遺伝子RNA干渉（例えば、shRNAのような^{）18,24,25を}...

ディスカッション

三次元細胞培養技術の開発は、研究者たちは、劇的な形態学的変化を視覚化できるように、乳房上皮細胞の形質転換を研究することを可能にした。細胞浸潤を分析するほか、単一または多細胞スフェロイドは乳房上皮細胞の接着、増殖、サイズ、および基底頂端極性の変化を評価するために使用することができる。細胞は、ECM ⁸を重ねている、以前に報告された方法論とは対照的に、我々の方法は、定量化される多方向侵入が可能になり、ECM ^18,19,24、で細胞を埋め込 ​​みます。これらの革新的な3D培養モデルは、研究者は、従来のトランスウェルチャンバー浸潤アッセイを使用して、単層の細胞を研究するときは不可能な表現型の変化を研究することができます。細胞コロニーの共焦点免疫蛍光分析と一緒に両方の生化学的および薬理学的戦略を組み込むことによって、3Dモデルは気をつけ能力を促進していますYは、より洗練されかつ詳細に形態学的変化を分析する。従って、この技術は、癌の開始および進行に影響を与えるメカニズムの理解を助長している。

我々は、共焦点皿当たりMDA-MB-231細胞のプレー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5mlチューブ	VWR	CA10011-700	滅菌済み、使い捨て
100mm培養皿 BD353003	VWR	CABD353003	滅菌済み、使い捨て
15mlファルコンチューブ	VWR	CA21008-918	滅菌済み、使い捨て
1mlフィルターチップ	VWR	10011-350	滅菌済み、使い捨て
200 μlフィルター付きチップ	VWR	22234-016	、使い捨て
20μl フィルター付きチップ	VWR	22234-008	滅菌済み使い捨て
35 mm ガラス底共焦点 No.1 培養皿	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	使用前に予冷
ウシ血清アルブミン (BSA)	BioShop	ALB003.100	IF
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体、高度に交差吸着された	Life Technologies	A11029	1:250 IF
Alexa Fluor 568 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 抗体	Life Technologies	A11011	1:1,200 IF
抗β-カテニン用	BDトランスダクションラボラトリ	610153	マウスモノクローナル;IF
シ胎児血清(FBS)	Sigma	F1051	10%(v / v)で使用
Hoechst 33258、五水和物(ビス - ベンズイミド) - 10mg⁄ml Solution in Water	Life Technologies	H3569	0.1% (1:10,000 希釈) で使用
InVivo Analyzer Suite	メディアサイバネティクス		(10Xおよび40XのDIC画像)
キスペプチン-10(KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	100 nMで使用
アンチラミニン	シダーラン	AB19012(CH)	ウサギ-ポリクローナル全長ヒト;1:100でIF
LSM-510 METAレーザー走査型顕微鏡に使用	Zeiss		は63倍対物レンズで使用、油浸レンズ
マトリゲルフェノールレッドフリー (BD356237)	VWR	CACB356237	ロット番号2180819;10.4 mg/ml
オリンパス IX-81 顕微鏡	オリンパス		3D培養イメージングに使用(10倍および40倍でのDIC画像)
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/ml)	ライフテクノロジー	ズ 15140-122	抗生物質(培地に添加;0.01%で使用)
10mlピペット	VWR	CA53300-523	滅菌済み、使い捨て
RPMI 1640 グルタミン付き培地	ライフテクノロジー	ズ 11875-119	MDA-MB-231細胞
の培養に使用0.25% トリプシン-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200-072	MDA-MB-231細胞のトリプシン化に使用
MEGM (弾丸キット): MEBM (CC3151)+シングルクォート (CC4136)	ロンザ	CC-3150	MCF10A細胞の培養に使用