パルプ工場廃棄物流上での微生物増殖を促進する方法および培養微生物の生分解能の特性評価

サマリー

産業廃棄物を収集し、微生物の増殖を分析するために改変することができます。リグノセルロース抽出技術は、特定の生分解能力を分析するための成分を提供します。ガスクロマトグラフィー質量分析法は、パルプ化廃棄物で増殖した微生物の発酵産物を同定します。これらの方法は、パルプ化廃棄物を分解する微生物の代謝能力を決定します。

要約

クラフトプロセスは、高品質の紙を生産するパルプ用のリグノセルロース内の多糖類からリグニンを分離するために木材チップに適用されます。黒液は、クラフトプロセスによって生成されるパルプ化廃棄物であり、下流のバイオコンバージョンの可能性があります。しかし、リグノセルロース資源の難解な性質、黒液中の利用可能な有機炭素の大部分を構成するその化学誘導体、およびその基本的なpHは、この廃棄物の微生物生分解に課題を提示します。微生物増殖のための黒液の収集と改質の方法は、このパルプ廃棄物を利用して、リグニン、有機酸、および多糖類分解の副産物を貴重な化学物質に変換することを目的としています。提示されたリグノセルロース抽出技術は、培養微生物の代謝能力を理解するためのリグノセルロース成長基質の調製のための再現性のある方法を提供する。ガスクロマトグラフィー-質量分析を使用すると、パルプ化廃棄物での微生物の増殖から生じる発酵生成物の同定と定量が可能になります。これらの方法を一緒に使用すると、微生物の代謝活性の測定を容易にし、パルプ化システムに大きな価値を提供し、排水廃棄物を削減する発酵製品を生成する可能性があり、それによって潜在的な製紙の利益が増加し、黒液のさらなる用途が提供されます。

概要

木材のパルプ化は、長年にわたって最適化されてきた化学的に集約的なプロセスであり、廃棄物を最小限に抑えたシステムを作り出しています。ただし、このプロセスの出力の一部は、より価値の高い製品を生成するために使用できます。黒酒もその一例です。これは、世界のリグニン生産量の85%を占める主要な化学パルプ化方法であるクラフトプロセスから生成されます¹。クラフトプロセス(図1)は、温度(160-200°C)、圧力(120psig)、および白液に含まれる化学物質(水酸化ナトリウムと硫化ナトリウム)を使用して、木質繊維^2,3からリグニンを溶解します。黒液には、リグニン、有機酸、多糖類分解副産物^{が含まれています4}。これは、下流の製紙およびパルプ化プロセスに熱エネルギーを提供する回収ボイラーで蒸気を生成し、化学物質を回収するために焼却されます。パルプ化によって生成される黒液の量は、回収ボイラーが効果的に処理できる量を超える可能性があります。黒液を廃液として処分することは、水生動植物に悪影響を与えるため、選択肢にはありません。成長のために黒液を使用できる微生物の応用は、化学回収率の増加と、パルプ化システムの全体的なライフサイクル分析を改善する付加価値製品の生成という点で有益です。リグニン由来モノマーの化学的および生物学的変換により、食品甘味料や香料添加物として使用するバニリンと桂皮酸、プラスチックや樹脂に使用するフェノール、燃料に使用できるシクロヘキサンを製造することに成功しました5。

このパルプ廃棄物の生分解に関する以前の研究は、リグニンの解重合に焦点を当てていました。国際リグニン研究所(ILI)は、毎年4000万〜5000万トンのリグニンが生産されていると報告しています（http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php。そのリグニンのうち、商業産業プロセスに使用されているのはわずか1.5%^です6。PhanerochaetおよびTrametes属の白色腐朽菌によって産生されるラッカーゼおよびペルオキシダーゼ酵素によるリグニン解重合は、詳細に研究されてきました⁷。ノカルディアやロドコッカス⁸、シュードモナスプチダmt-2⁹、ストレプトマイセスビリドスポラスT7A10などの芳香族化合物を分解することが知られている土壌細菌も、リグニンを分解する能力があることが示されています。パルプ化廃棄物の細菌分解は、一部の細菌がパルプ化廃棄物の廃液¹¹を特徴付ける生理食塩水およびアルカリ性(pH 10-14)条件で繁殖できるため、有望である。リグニンは黒液の主成分ですが、微生物は黒液を構成する他の成分も分解する可能性があります。これらの技術は、リグニンを分解する微生物を同定するだけでなく、パルプ化廃棄物の黒液にさらに処理された成分の代わりに直接適用できる微生物を特定するのに役立ちます。

黒液は、中和とフィルター滅菌を通じて微生物の増殖のために収集および改変されました。微生物増殖要件は、新規リグノセルロース抽出プロトコルによって産生されたリグノセルロース成分に関する最小限の培地増殖実験により、環境微生物分離物について同定されました。増殖培地をガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)で分析し、黒液を唯一の炭素源として成長させた環境微生物分離物の代謝産物を決定しました。これらの技術の組み合わせは、黒液などのパルプ工場廃棄物で増殖した場合の微生物の代謝能力を決定するための評価ツールを提供します。このような技術を使用すると、副産物の生成のために特定の微生物をパルプ工場の廃棄物に適用する価値についての洞察も得られます。

プロトコル

1. 黒酒の収集と成長文化のための黒液の調製

1. クラフト蒸解釜に取り付けられた出口バルブから滅菌ガラス瓶に黒液サンプルを採取し、室温まで冷ましてから次の手順に進みます
   中和
2. 攪拌棒を装備した500mlのビーカーに100mlの黒液サンプルを加えます。
3. ビーカーを攪拌板に置き、速度を中程度に調整します。
4. 黒液が粘性(グリセロールと同様の粘度)になるまで、リン酸をゆっくりと滴下します。
5. 50 mlの円錐管にゆっくりと注ぎ、9,300 x gで30分間遠心分離することにより、すべての黒液溶液を分注します。
6. 上清をビーカーに入れ、pHテストリボンを使用してpHを測定します。沈殿したリグニンのペレットは、無害な固形廃棄物として廃棄し、処理することができます。
7. リン酸を添加し続け、pHストリップが上清の中性pHを示すまで溶液を遠心分離します
   殺菌
8. 溶液を0.22μmのフィルターに通して汚染細菌を除去し、ろ過した溶液を滅菌容器に入れて保存します。室温で保存してください。

2. リグノセルロースの抽出

炭水化物の分離

1. スイッチグラス、マツグラス、バミューダグラス(1mm以下に粉砕)5gを500mlの三角フラスコに入れます。次に、200 mlの蒸留水または脱イオン水、7.5 gのNaClO₂、2.5 mlの氷酢酸、および攪拌子をフラスコに加えます。
2. フラスコを攪拌板の上に置いた油浴に80°Cで1時間置き、攪拌板の速度を中程度に調整します。
3. さらに7.5 gのNaClO₂と2.5 mlの氷酢酸をフラスコに加えます。オイルバスで80°Cで30分間撹拌を続けます。
4. 前のステップを2回繰り返します(注:リグノセルロース系バイオマスを含むフラスコに、合計30gのNaClO₂と10mlの氷酢酸を加えます)。溶液を室温まで冷却します。
5. 濾紙をビュヒナー漏斗に入れます。漏斗をサイドアームフラスコの上に置き、掃除機に取り付けます。
6. 溶液をゆっくりと漏斗に注ぎます。
7. 固形物を100mlの蒸留水または脱イオン水で3回洗浄します。固形物を洗浄した後、濾液を廃棄してください。
8. 固形物1gを確保し、濾紙のきれいなシートの上に置きます。
9. この固体材料を50°Cのオーブンで一晩乾燥させます。サンプルをオーブンから取り出した後、「holocellulose」とラベル付けされた保存バイアルに入れます。
10. 残りの固体材料を、500 mLの三角フラスコ中の250 mlの10% NaOH(v / v)に加えます。フラスコに栓をします。
11. 溶液を70°Cのインキュベーターに1時間置き、250rpmで振とうします。
12. 溶液を室温で30分間冷却します。
13. サイドアームフラスコに取り付けられた濾紙とビュヒナー漏斗を使用して、固い材料を取り除きます。
14. 濾紙のきれいなシートに付着した固体材料を50°Cのオーブンに移し、一晩乾燥させます。
15. 残留物が乾燥したら、保存用バイアルに入れ、「セルロース」とラベル付けします。
16. ステップ2.13のろ液を500 mlの三角フラスコに移し、30 mlの酢酸と250 mlのイソプロピルアルコールを加えます。.フラスコに蓋をし、溶液をベンチトップに室温で少なくとも8時間置きます。
17. すべての溶液を50mlのコニカルチューブに移し、溶液を9,300 x gで30分間遠心分離します。
18. ボルテックスにより、ペレットを30mlの蒸留水または脱イオン水に再懸濁します。
19. 手順2.17-2.18 15xを繰り返して、ペレットを完全に洗浄します。
20. 上清を取り除き、ペレットを凍結乾燥のために保存します。凍結乾燥したら、サンプルを採取し、「ヘミセルロース」とラベル付けされたバイアルに入れます。
    リグニン分離
    Karaaslanらに基づくリグニン分離プロトコル。¹²
名
21. 5 gのスイッチグラス、マツ、またはバミューダグラス(1 mm以下の粒子サイズに粉砕)を、0.25 M NaOHおよび30%エタノールの溶液500 mlに加えます。スラリーを75°Cのインキュベーターに入れ、250rpmで2時間振とうします。
22. 溶液を室温まで冷却します。
23. サイドアームフラスコの上にあるビュヒナー漏斗に濾紙を置きます。真空に取り付け、溶液をゆっくりと漏斗に注ぎます。
24. 固形物は廃棄します。
25. 濾液が入ったフラスコに攪拌棒を追加し、中速に調整された攪拌板の上にフラスコを置きます。pH 2.0(約20 ml)が得られるまで、濃塩酸を溶液に滴下します。
26. 酸性化した溶液を室温で一晩放置します。
27. 溶液を9,300 x gで円錐形チューブ内で30分間遠心分離します。溶液を円錐形のチューブから慎重にピペットで取り出し、廃棄します。
28. ボルテックスにより、ペレットを30mlの蒸留水または脱イオン水に再懸濁します。
29. 手順2.27-2.28 15xを繰り返して、ペレットを完全に洗浄します。
30. 遠心分離後、上清を取り除き、ペレットを凍結乾燥のために保存してください。凍結乾燥したら、サンプルを「lignin」とラベル付けされたバイアルに入れます。

3. 微生物増殖培養物の調製

寒天プレート

1. プレートを注ぐ前に、0.2%(w / v)滅菌リグノセルロース抽出産物をM9最小培地¹³寒天
に加えます。
2. M9 最小培地で増殖させた約 200 ul の細菌培養液を O.D. 約 2.0 で溶断固化させたストリーク固化プレート。
3. プレートを37°Cでインキュベートし、成長をモニターします.
   液体培養
4. 滅菌125 mLフラスコに、滅菌済みのLuria-Bertani(LB)培地¹³またはM9最小培地¹³ 50 mLを加えます。リグノセルロース抽出製品の10%(v / v)または0.2%(w / v)で黒液を追加します。
5. O.D.が約2.0の細菌培養物の0.1%(v / v)を培地に接種します。
6. 培養物を37°Cでインキュベートし、200rpmで振とうします。
7. 培養期間中、6時間ごとに光学密度(λ=600nm)を測定して成長を評価します。培養物の1mlアリコートをキュベットに入れます。未接種培地に対してブランクにした培養物の光学密度を決定します。
8. 中盤の対数期で細菌を嫌気性血清ボトルに移します。
   1. 嫌気性血清ボトルを準備するには:好気性条件およびオートクレーブ下で、ブチルゴムストッパーとアルミニウムクリンプトップで血清ボトルを密封します。.滅菌後、血清ボトル内のヘッドスペースを変更しないでください。.
   2. シリンジを使用して、125 mLフラスコから50 mLの培養物全体を密封された滅菌血清ボトルに移します。
   3. 200 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。

4. GC-MSのサンプル調製

Raj、Reddy、Chandra¹⁴に従ってサンプルを準備します。比較に使用されるネガティブコントロールは、10% の黒液を含む M9 最小培地で構成され、未接種サンプルとも呼ばれます。

1. インキュベーション後、450時間後の9,300 x gで9,300 x gの非接種および接種細菌培養物(50 ml)を30分間遠心分離します。
2. 上清10mlをガラス試験管に移します。(注:プラスチックは、次の手順の化学物質と互換性がありません。
3. 上清を濃縮HClでpH 1-2に酸性化します。
4. 3容量の酢酸エチル(30 ml)を加え、チューブにキャップをして、4〜6倍に反転させて混合します。
5. 清潔なガラス試験管に少量の無水Na₂SO₄(1〜2 g)を入れます。
6. 酢酸エチル溶液から有機層(上部)を、使い捨てのガラス製パスツールピペットでピペッティングして慎重に収集します。
7. 無水Na₂SO₄を含む試験管に有機層を置きます。
8. 無水_Na2SO4上の有機層を試験管を軽くたたいて混合することにより脱水します。少量の無水Na₂SO₄を徐々に加え、大きな塊がなくなるまで混合します。
9. バキュームに取り付けられたサイドアームフラスコの上にあるビュヒナー漏斗に濾紙を置きます。
10. 溶液を漏斗に注ぎます。固形物は廃棄します。
11. 溶液を蒸発フラスコに移し、ロータリーエバポレーターを使用して濾液を蒸発させます。
12. 3 mgの酢酸エチル抽出残渣を2 mLの琥珀色のクロマトグラフィーバイアルに入れます。
13. 100 μlの1,4-ジオキサンと10 μlのピリジンを加えて残留物を溶解します。
14. N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド50 μLとトリメチルコロールシラン99:1% (BSTFA) を添加してください。次に、60°Cのインキュベーターに15分間振とうします。
15. サンプルは使用時まで4°Cで保存してください。

5. GC-MS

質量分析計(MS)とインターフェースされたガスクロマトグラフ(GC)に非極性キャピラリーカラムを、キャリアガスとしてヘリウムを流量1ml/minで装備します。

1. オーブンの温度が50°Cに安定したら、サンプル1μlを1/50の分割比で注入します。
2. カラムを 50 °C で 5 分間保持し、5 °C/分で 280 °C まで上昇させ、最終温度 280 °C を 20 分間維持します。
3. ガスクロマトグラフと質量分析計の間のトランスファーラインを300°Cに保ちます。
4. 溶媒遅延を15分から選択します。
5. 電子エネルギー70 eVで10〜500(m/z)の範囲の電子イオン化質量スペクトルを記録します。
6. 上記のように誘導体化し、クロマトグラフ標準液を添加します。購入した標準試料の保持時間や、米国国立標準技術研究所(NIST)の質量スペクトルデータベースでのデータを保持していることで、化合物を同定します。

結果

クラフトパルプ化プロセス(図1)で発生する黒液の収集と改質により、このパルプ化廃棄物を使用して、単一の細菌分離物または混合培養物の生分解能力を決定することができます。図2は、LB培地のみで培養した微生物環境分離株と10%中和黒液を添加したLB培地で培養した微生物の光学密度によって測定された好気性成長を示しています。これらの結果は、この細菌が中和された黒液の存在下で増殖することを示しています。黒液を含まない環境分離物の成長は、最初はより急速に成長しますが(指数関数的段階では生成時間が20時間)、成長は62時間を超えて持続しません。黒液の存在下での微生物環境分離物の成長は遅い(指数関数的段階での生成時間は35時間)。しかし、培養物は、成長の230時間後まで光学密度が増加し続けます。黒液の存在下で成長した微生物環境分離株の成長曲線も二相性の成長を示しており、これは、黒液が微生物環境分離物で使用できる複数の炭素源を含んでおり、細菌が示す栄養素利用の好みがあることを示唆しています。成長要件に黒液を利用する能力を決定するには、さらなる実験が必要です。また、中和されていない黒液に対す...

ディスカッション

このプロトコルは、パルプ化廃棄物を分解できる微生物、パルプ化廃棄物の増殖中に利用される炭素源、およびパルプ化廃棄物で増殖したときに生成される微生物代謝産物を特定することを目的とした技術の組み合わせについて説明します。私たちは、微生物環境分離物(10%の黒液で増殖し、リグノセルロース抽出成分を成長のための唯一の炭素源として使用できる通性嫌気性菌)でこのプロトコルの成功を示しました。このプロトコルは、リグノセルロス分解の可能性を有する他の微生物または微生物コンソーシアムによってパルプ化廃棄物を分解する可能性を決定するために使用できます。

一度に約1Lの黒液が収集されました。ただし、収集される量は、実験のニーズと黒液を収集するためのアクセスによって決定される必要があります。黒液を採取する際は、必ず安全メガネを着用し、採取ボトルを保持するための耐熱手袋を着用してください。このプロトコルでは、この実験で使用された微生物環境分離株の増殖を促進するために黒液を中和した。ただし、異なるpHにより、他の微生物の最適な増殖が可能になる可能性があります。また、他の微生物はパルプ化廃棄物のより高い割合で増...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,4-ジオキサン(認定ACS)	フィ	ッシャーD111	、酸化前酸化性化学
液	カロライナ州立大学の森林バイオマテリアル部門	N / A	pH 12.72、13.67%固形物
エタノール(微生物学グレード)	フィッシャーBP2818
酢酸エチル(ACS試薬グレード)	EMD	EX0240-9
可燃性氷酢酸(認定ACS)	EMD	AX0073
グアイアコール	グマアルドリッチ	PHR1136	摂取により有害、腐食性
HP-5キャピラリーカラム	ジレント	19091J-577	60 m x 0.18 mm内径、0.18 μmの厚さ
塩酸(認定ACS)	EMD	HX0603P
N、O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミドとトリメチルコールシラン99:1%(BSTFA)	Fluka	15238	、Na
2SO4 (FCCグレード)	VWR	BDH8026
NaClO2(80%)	シグマアルドリッチ	244155	可燃性、有毒
NaOH(認定ACS)	EMD	1.06498.1000	腐食性
アルカシッドpHテストリボンフィ		ッシャーA979
リン酸(認定ACS)	フィ	ッシャーA242
ポラリスQ質量分析計	Thermo Electron Corporation
Pyridine (99%)	Alfa Aesar	A12005	可燃性、皮膚と接触すると有毒
Switchgrass	Cherry Research Farm Goldsboro, NC	N/A	Harvested August 2011
Thermo Finnigan trace gas chromatograph	Thermo Electron Corporation
Whatman no. 1 filter paper	Whatman	1001-150