ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

サマリー

ここに記載されているプロトコルは、修飾されたヌクレオシド三リン酸に至る複雑なルートのように数々の障害を説明し、要約するすることを目指しています。結果的に、このプロトコルは、これらの活性化ビルディングブロックの合成と実用化のための彼らの可用性の両方を容易にします。

要約

化学官能基の導入のための伝統的な戦略は、新生鎖に適切に修飾されたホスホルアミダイト前駆体を付加することにより、固相合成の使用である。しかし、合成中に使用される条件と、むしろ短い配列への制限は、この方法論の適用を妨げる。一方、修飾されたヌクレオシド三リン酸は、核酸に多数の官能基の導入のために軽度の実用的な用途の幅広いパレットの修飾された核酸の使用への道を開く戦略を採用されている構成要素を活性化さこのようなリボザイムおよびDNAザイムの機能的タギングおよび生成など。主要な課題の一つは、これらのヌクレオシド類似体の単離および特徴付けをもたらす方法論の複雑さにある。

このビデオの記事では、我々はテサロニケの合成のための詳細なプロトコルを提示Eリン（III）ベースの試薬を用いて類似体を変更しました。また、それらの生化学的特性評価のための手順は、プライマー伸長反応とのTdTテーリング重合に特別な重点を置いて、漏らしている。この詳細なプロトコルは、修正されたdNTPのクラフトや化学生物学におけるそれらのさらなる使用のために使用されるであろう。

概要

5'-ヌクレオシド三リン酸（（D）のNTP）は、エネルギーのユニバーサル為替であることから細胞代謝の調節因子に至るまで無数のプロセスと機能に関与している重要な生体分子のクラスを表す。これらの基本的な生物学的変換での彼らの役割に加えて、これらの変性の対応は、オリゴヌクレオチドに官能基を導入するための汎用性とマイルドなプラットフォームとしてうまく通常^1,2に適用され、自動化固相合成を補完する方法論を進めてきた。実際に、（d）には、NTPをRNAのための基質として作用することができ、DNAポリメラーゼが^3に 、アミノ酸^4-13、ボロン酸^14,15を含む官能基の富に対するnornbornene ^16、ダイヤモンド状の残基^17、側鎖設け有機触媒^18、胆汁酸^19、さらには²⁰オリゴヌクレオチド^は、オリゴヌクレオチドに導入することができる。

_content ">核酸の機能化のための便利なベクトルを表す以外に、修飾dNTPは^、SELEXと変更された触媒核酸^21〜30と、様々な実用的なアプリケーション¹⁰のためのアプタマーを生成するためのin vitro選択の他の関連するコンビナトリアル法に従事することができます

プロトコル

1。修飾ヌクレオシド三リン酸の合成

選択された合成法は、この方法は一般的に信頼性が高く、非常に少数の副生成物（ 図^1A）39につながるため、ルートヴィヒとエクスタインによって開発された手順に従います。

1. 一晩真空下で乾燥した後、無水ピリジン（2ミリリットル）で2回、適切に3'-OAcで保護されたヌクレオシド（通常は0.1 mmol）のCoevaporateと。同時に、一晩真空下で乾燥したピロリン酸トリブチルアンモニウム（0.13ミリモル）。
2. 乾燥ピリジン（0.2ミリリットル）の最小でヌクレオシドを溶解し、共溶媒として乾燥ジオキサン（0.4ミリリットル）を追加します。最後に、2 - クロロ-1,3,2 - ベンゾジ-4 - オン（0.11ミリモル）を添加し、45分間室温で反応させる。
   注意：これは、特に注意が2 - クロロ-1,3,2 - ベンゾジ-4-1試薬と取られるべきであることは注目に値する。実際に、不活性ガス下でatmospこの試薬の偶数記憶ここにその分解を防止するのに十分ではない。従って、この分解に形成された白色固体を、使用前に掻き取られるべきであることができる。
3. （0.17ミリリットル）の乾燥DMFトリブチルアンモニウムピロリン酸の溶液を調製し、新たに蒸留したトリ（58μL、モレキュラーシーブを追加ことはありません）。反応混合....

結果

彼らは核酸⁴¹への官能基の広大な配列の容易な導入を可能にするので修飾されたヌクレオシド三リン酸は合成標的を魅惑的なされています。しかしながら、これらの活性化されたビルディングブロックの単離および特徴は、しばしば困難であることが判明している。従って、本明細書に示した結果は、上述の合成および生化学的手順内の様々な工程（ 図1B）を追従する手助けを提供すると考えられている。

特に、 図3は、 すなわち A（リン中心の特性信号を観測することができる修飾されたdNTP（この特定の場合において、dUを^{BPU TP（4）18、}図2）の典型的な粗³¹ P-NMRスペクトルを示す、-5.02（Pの_γ）で-20.55で-10.44の二重線（の_Pα）と三重項のダブレット_{（Pβ）PPM）。}また、よ高いリン酸塩（-21.02および-23........

ディスカッション

核酸への変更を含めることは、アンチセンスおよびアンチジーン剤の開発^42,43、標識及びオリゴヌクレオチド⁴¹の機能的なタグ付けを含む数多くの実用的なアプリケーションのために重要である、と遺伝アルファベット^44〜46を拡張するための努力において。化学的改変及び官能基は、通常、標準および自動固相合成プロトコルを適用することにより核酸中に導入される。しかし、ホロアミダイトビルディングブロックは、順番に化学官能⁴⁷の性質に厳しい制限を課して、この方法論によって課せられたという過酷な条件に弾力性である必要があります。唯一の制限は、彼らがポリメラーゼ^1,2の基質として作用することがあるので、その代わりに、変更されたヌクレオシド三リン酸の酵素媒介重合は、機能性のより広い範囲の導入を可能にする。 GENの顕著な不足しているにもかかわらず、公正妥当該当する方法論、信頼性が高く堅牢な合成および分析方法論は修正されたdNTPの合成のために開発されてきた。また、それらの固有の性質のため、変更された三リン酸は、さまざまな外部条件（ 例えば

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリブチルアンモニウムピロリン酸	Sigma Aldrich	P8533	湿性固体、Ar
2-クロロ-1,3,2-ベンゾジオキサホスホリン-4-オンの下に保管	シグマ アルドリッチ	324124	湿気に敏感な
ピリジン	シグマ アルドリッチ	82704	モレキュラーシーブの下
ジオキサン	シグマ アルドリッチ	296309	モレキュラーシーブの下
ジメチルホルムアミド (DMF)	シグマ アルドリッチ	40248	モレキュラーシーブの下
アセトニトリル	フィッシャーサイエンティフィ		HPLCグレード
トリエチルアミン	グマアルドリッチ	90342
トリブチルアミン	シグマアルドリッチ	90781
ddH<サブ2>2オ	ミリ		脱イオン精製水、ジエチルピロカーボネート(DEPC)
ジエチルピロカーボネート(DEPC)	シグマアルドリッチ	159220
D2O	ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ・インク	DLM-4-25
γ-[32P]-ATP	Hartmann Analytics	FP-301
Natural dNTPs	Promega	U1420
Vent (exo-) DNA ポリメラーゼ	NEB	M0257S
DNA ポリメラーゼ I, Large (Klenow) Fragment	NEB	MO210S
9°N<サブ>m DNAポリメラーゼ	NEB	MO260S
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT)	Promega	M828A
Pwo DNAポリメラーゼ	Peqlab	01 01 5010
T4 PNK	Thermo Scientific	EK0032
アクリルアミド/ビスアクリルアミド (19:1, 40%)	Serva	10679.01
アガロース	アポロ サイエンティフィック	BIA1177
G10 セファデックス	シグマ	G10120
尿素	アポロ サイエンティフィック	BIU4110
ジュピター セミ分取 RP-HPLC カラム (5μC18 300 Å)	Phenomenex
Gene Q サーマルサイクラー	Bioconcept	BYQ6042E
PCR バイアル	Bioconcept	3220-00
HPLC システム	アマシャム ファルマシア バイオテック		Äkta basic 10/100
すべてのオリゴヌクレオチドはMicrosynthから購入し、PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC で精製しました。 CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA アタガクトTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
実験手順と機器の詳細については、次の記事を参照してください: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol.Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

吸ックシQの存在下でオートクレーブ滅菌