方法論記事

アン in vivoで架橋アプローチショウジョウバエ胚

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DOI：

10.3791/51387

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2014年4月23日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

この記事について

サマリー

多成分タンパク質複合体は、細胞機能および開発中に重要な役割を果たしている。ここでは、後続の構造-機能分析のための架橋された複合体の精製に続いてインビボ架橋後のショウジョウバエ胚から天然のタンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。

要約

多くの細胞プロセスは、マルチサブユニットタンパク質複合体によって制御される。頻繁にこれらの複合体は、一過性に形成し、組み立てるためにネイティブ環境が必要です。したがって、これらの機能性タンパク質複合体を同定するためには、細胞溶解およびその後の精製の ​​前に、生体内でそれらを安定化することが重要である。ここでは、 ショウジョウバエの胚から大真正タンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。この方法はin vivoで容易に細胞膜を通過することができ、低濃度のホルムアルデヒドを用いて架橋することによって、胚の内側の複合体の胚の透過化と安定化に基づいている。続いて、関心対象のタンパク質複合体は、ゲル精製し、そして質量分析によって分析免疫精製される。我々は、生殖系列発達のために必須であるチューダータンパク質複合体の精製を使用してこの方法を説明する図である。チューダーは、複数のチューダードメインを含む大規模なタンパク質である - 小さな標的タンパク質のメチル化アルギニンまたはリジンと対話モジュール。この方法は、異なる生物及び組織由来の天然タンパク質複合体の単離のために適合させることができる。

概要

マルチサブユニットタンパク質アセンブリおよびDNA-又はRNA-タンパク質複合体の単離は、タンパク質複合体、DNA結合性調節タンパク質又はRNA結合タンパク質のRNA標的によって認識される、ゲノム遺伝子座を同定するために行われる。別の方法は、転写因子またはクロマチンタンパク質（のChIP-seqの）1と所与のRNA結合タンパク質（CLIP-seqの）2に関連するRNA標的によって認識されるDNA部位のゲノムワイドな同定を可能にする。 RNA由来のcDNAまたはDNA標的のライブラリーは、その後、深く配列決定される。これらの方法には、化学的またはUV誘導に研究複合体のタンパク質成分に対する抗体を用いて免疫沈降（IP）に続いて複合体を安定させるために、架橋を使用しています。

生物の開発中に、多くのタンパク質複合体を一過形成する。したがって、デベロッパーを制御する分子メカニズムを理解するために、インビボでのこれらの複合体の組成および機能を分析することが重要であるelopment。それは、in vitroで相互作用する成分の本来の濃度と細胞生化学的環境を再現することは事実上不可能であるため、このようなin vivoでの解析は、in vitroでのアプローチよりも優れているでしょう。ここでは、我々は成功してショウジョウバエの胚から、大きなタンパク質複合体を分離するために使用して、生体内のアプローチを示しています。この方法では、生きている胚におけるタンパク質複合体は、低濃度のホルムアルデヒドで架橋され、​​続いて、目的のタンパク質複合体は、複合体のゲル精製に続いて​​複合体の既知の成分と質量分析を用いてIPに対する抗体によって単離される未知の複雑なコンポーネントを識別します。ホルムアルデヒドは、細胞膜を透過することができ、2.3〜2.7オングストローム3の架橋範囲を有するので、タンパク質複合体は、 インビボで架橋することができ、複雑な構成要素は、互いに近い可能性が高い。この記事の我々にある一例としてチューダー（TUD）タンパク質複合体の単離を使用してこの方法を説明する。 TUDは生殖細胞の発達4-7に不可欠である生殖細胞タンパク質である。このタンパク質は、他のポリペプチド8月10日のメチル化アルギニンまたはリジンと相互作用することが知られ11 TUDドメインを含む。

先に、我々は、機能TUD 5 HA-タグ化発現し、従って、特異的な抗HA抗体を架橋後TUD錯体をプルダウンするために用いられるトランスジェニックショウジョウバエ株を生成されている。

タンパク質 - タンパク質架橋に加えて、ホルムアルデヒドは、核酸 - タンパク質架橋を生成することができるとのChIP-seqの実験で使用されている。さらに、 ショウジョウバエにおいて、ホルムアルデヒドと架橋インビボでヴァーサRNAヘリカーゼタンパク質11のRNA標的の同定を可能にした。

この記事では、生体内架橋およびPURのための方法を説明しながら、ショウジョウバエ胚由来のタンパク質複合体のification、この方法は、他の生物および組織に適合させることができる。

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プロトコル

1。大アップルジュース - 寒天プレートの準備

  1. 4板を作るために、千ミリリットルのフラスコに375ミリリットルをH 2 O、11.25グラムフライ寒天と攪拌棒を追加します。これは緩く、液体品の1 30分 - 滅菌サイクルに蓋をしたフラスコの蓋をミックスA.オートクレーブミックスAである。
  2. 500ミリリットルのビーカーに125ミリリットルのリンゴジュース、12.5グラムの砂糖と攪拌棒を追加します。ミックスAのオートクレーブ処理が終了するまで、約70℃で攪拌し、温度を維持しつつ、加熱されたプラットフォーム上ミックスB.ヒート·ミックスBである。
  3. ミックスが完了し、オートクレーブ処理すると、A.優しく合わせた混合物を攪拌してくださいミックスにミックスBを転送し、それを15分間冷ます。保存料の添加前過冷却となった寒天固化は避けてください。
  4. エタノール中10％（重量/体積）の4 - ヒドロキシ安息香酸メチル溶液を作る。これは防腐剤として機能します。上記のリンゴジュース寒天混合溶液の3.75ミリリットルを追加します。 anothe攪拌しておくR 5分。
  5. 各300センチメートル2プラスチックや発泡スチロールの板状に防腐剤を125ミリリットルのリンゴジュース寒天混合物を注ぐ。それを室温に冷却して固化してみましょう。注ぎながら、気泡の形成を避けてください。
    参考：アップルジュース寒天プレートはすぐに使用する準備が整いました。クリアーラップで使用されていないプレートをカバーし、一週間まで4℃で保存する。

2。 ショウジョウバエ胚収集と前架橋処理

  1. 胚を収集することができる、そこから約4万〜5万ハエで人口ケージをロードします。
  2. ミディアム標準コーンミール、糖蜜の125ミリリットル12を含む2枚ずつ作成し、それぞれのプレート上で乾燥パン酵母の約4グラムを振りかける。ハエを太らせるために48時間25℃のインキュベーター内で人口ケージにこれらのプレートを置きます。
  3. 25℃まで昇温さ2リンゴジュース寒天プレートそれぞれの上に乾燥したパン酵母の約1グラムを振りかけるプレート。 0-1 HR-齢の胚の収集を開始する人口ケージに2枚を配置します。
  4. 1時間のコレクションの最後に、プレートを取り出します。コレクションの別のラウンドが必要な場合は、2の新しいプレートを交換してください。
  5. プレートをカバーし、細かいペイントブラシで軽く胚を再懸濁するために十分な水を追加します。ステンレス製の金網からなる2層の篩を再懸濁した胚を注ぐ。
    注：最上位層は、胚経由せながら、大きなフライパーツを収集中程度の孔サイズ（850ミクロン）のメッシュで作られています。最下層は、酵母と水を通過させる、一方、胚を収集し、細かいメッシュ（75ミクロン）で作られています。
  6. 50ミリリットルチューブと細かいナイロンメッシュで作られたコレクションバスケットに集めた胚を転送するために細かいペイントブラシを使用してください。水で簡単に胚をすすぎ、その後乾燥させるために紙タオル上でメッシュをブロット。
  7. 3分間穏やかに旋回して、50％の漂白剤で胚を浸す。徹底的なすすぎ残りの漂白剤を除去するために水でLY。乾燥するペーパータオルの上でメッシュをブロット。
  8. （これはより長い30秒を取るべきではありません）15秒間、穏やかに攪拌しながら、イソプロパノールまたは多胚塊の崩壊まで、絨毛膜を除去した胚を浸す。完全に乾燥さペーパータオルの上でメッシュをブロット。
  9. 再懸濁し、それらを維持するために胚の上にヘプタンをストリーミングするピペットを使用しながら、5分間のヘプタン中の胚を浸す。乾燥するペーパータオルの上でメッシュをブロット。
  10. 3分間0.1％トリトンX-100（PBST）を含むリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中（PBS）のストリームに胚をすすぐ。
  11. コレクションバスケットを分解し、10ミリリットルのPBSTを含む15mlチューブにメッシュと一緒に胚を移す。メッシュから胚を洗浄するために静かにチューブを反転させる。
  12. チューブからメッシュを削除します。垂直にチューブを入れて、胚は重力によって、チューブの底に沈むましょう。
    注記：約100から300胚のμlを1ケージから1時間の収集のために期待されている。
  13. PBSTを取り外し、すぐに架橋実行し続けています。

収集された胚の3。 インビボ架橋

  1. 使用直前に、PBST中の0.2％ホルムアルデヒドを準備します。胚へのホルムアルデヒド固定液10ミリリットルを加え、10分間ロータリーシェーカー穏やかに攪拌しながら25℃でインキュベートする。一日の終わりまでに、未使用の固定液を捨てます。
  2. 架橋反応をクエンチ
    1. 架橋の終了時に、胚は、チューブの底に沈むう。
    2. ホルムアルデヒド溶液を除去します。すぐに架橋反応を停止させ、PBST中0.25Mグリシンの10ミリリットルを追加。 5分間ロータリーシェーカー穏やかに攪拌しながら25℃でインキュベートする。
    3. 胚は、チューブの底に沈むましょう。クエンチ溶液を除去します。 PBSTの10ミリリットルで3回胚を洗浄します。
    4. 完全にPを削除ピペットを用いてBST洗浄溶液。使用するまで-80℃で保存胚。

4。タンパク質試料の調製と免疫沈降

  1. 2ミリリットルの溶解緩衝液中でDounceホモジナイザーを用いて500μlの架橋された胚を均質化する（0.5 M尿素、0.01％SDS、2％トリトン-X 100、PBS中の2mMのフッ化フェニルメタンスルホニル[PMSF]、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）。
    注意：特に指定のない限り、このRTで、次の手順を実行します。
  2. 1.5ミリリットル遠心管に溶解液を移し、ゆっくりと徹底的な溶解を確実にするために15分間の回転台に揺する。細胞破片をペレット化し、5分間16,000×gで溶解液を遠心分離する。清潔な15mlチューブに上清を保存します。
  3. 40μlの抗HAアガロースビーズを上清にスラリー化し、2.5時間、回転プラットフォーム上でインキュベート追加する。
  4. 5分間2500×gで遠心分離することにより、ビーズを沈殿。上清を除去しますが、適切を残すチューブ内のximately 250μL。残りの上清中にビーズを再懸濁し、10μmの孔のフィルターを用いて1.5ミリリットルスピンカラムに移す。
  5. 10秒間12,000×gでスピンカラムを遠心して、フロースルーを捨てる。
  6. 200μlの洗浄緩衝液（0.1 Mグリシン、1 MのNaCl、1％のIGEPAL CA-630、0.1％のTween-20、PBS中）を添加することによりビーズを洗浄する。 10秒間12,000×gでカラムを遠心し、洗浄を捨てる。洗浄を2回繰り返します。
  7. ビーズに40μlの溶出緩衝液（2 mg / mlのPBS中のHA-ペプチド）を追加し、穏やかに撹拌しながら15分間37℃で5分毎にインキュベートする。 10秒間、12,000×gでカラムを遠心し、溶出液を収集します。
  8. 抗HA抗体13を用いたウエスタンブロット解析により複合体の溶出を確認してください。

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結果

ウェスタンブロット（ 図2）、続いて（ 図1に示されている）、7％工程ゲル-架橋および架橋TUDタンパク質複合体の精製に成功したの有効性は3％でSDS-PAGEにより分析した。

3％の使用目的 - 7％ステップゲルを複合体の残りの未架橋TUDタンパク質および濃度の架橋TUDタンパク質複合体の効果的な分離に基づいている。上述した我々のインビボ架橋条件で、TUDタンパク質の大部分は依然として残っている未架橋の可能性がある。これ自由TUDタンパク質は、SDS-PAGEによる分離するまで、IPの間に架橋された複合体と同時精製でしょう。明らかに保持することなく、7％のボーダー - サイズが大きくても、未架橋TUDタンパク質（285 kDa）は、3％を越え移行されます。大きな分子量を有する架橋TUDタンパク質複合体は、目に得られた、難易ゲル国境を越えて移行を有するのに対しE複合体は、「トラップ」との国境に近い境界線や「テーリング」に集中しているため、自由TUDタンパク質から分離されている。

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ディスカッション

ホルムアルデヒドは、一般的に、タンパク質 - タンパク質及びタンパク質 - 核酸相互作用を同定するための架橋剤として使用されている。一緒に下流の質量分析手法との互換性との良好な溶解性および細胞膜透過性は、ホルムアルデヒド、細胞内架橋アプリケーション3,15-17のための理想的な候補薬剤を作る。特に、正常ヴァーサ、 ショウジョウバエ 11において重要な生殖細胞RNAヘリカーゼに関連付けられたmRNAを同定するために使用した。近接して存在する唯一の分子は、標的タンパク質の相互作用パートナーの特異性を強化する、適当な条件下で架橋されることを意味し、市販の架橋剤のうち、 - （2.7オングストローム、2.3）、さらに、ホルムアルデヒドは最短のスペーサーアームのいずれかを有する。上述の理由により、ホルムアルデヒドは、我々のプロトコルにおいて、架橋剤として選択した。しかしながら、これは、uと除外すべきではないショウジョウバエの胚のためのin vivoアプリケーション内の他の架橋剤のsefulness。しかし、明らかなTUDはジチオビス（スクシンイミジル...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

我々は、この研究とその技術のヘルプはジョーダン·デイビス、ヤンヤン林、エリックSchadlerさんとJimiao鄭に感謝します。この作品は、AlaへのMCB-1054962を付与NSFのキャリアによってサポートされていました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ショウジョウバエ寒天実験室科学(http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1リンゴジュースプレートが壊れやすくなる原因となるため、水と寒天の混合物を長期間オートクレーブしないでください
メチル4-ヒドロキシ安息香酸シグマ(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501別名:TEGOSEP
人口ケージフライスタッフ(http://www.flystuff.com/)59-104
細いナイロンメッシュフライスタッフ(http://www.flystuff.com/)57-102コレクションバスケットを作るときは、ハヤブサチューブキャップの開口部よりもわずかに大きいメッシュをカットして、密閉性
ダウンスホモジナイザーシグマ(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETホモジナイザーを氷の上で冷やし、使用前に冷たく溶解したバッファーで事前にすすぎますタンパク質の分解を防ぎます
テアーゼ阻害剤カクテル ロシュ(http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBSは、濃縮プロテアーゼ阻害剤ストック溶液を調製するために使用できます
抗HAアガロースビーズMBLインターナショナル(http://www.mblintl.com/)561-8キットには、HAペプチドとスピンカラムも含まれています
HAペプチドMBLインターナショナル(http://www.mblintl.com/)561-8PBSで2 mg / mlに調製 
スピンカラムMBL インターナショナル (http://www.mblintl.com/)561-8スピンカラムは、
イソプロパノールフィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/‎)
トリトン X-100フィッシャー・サイエンティフィック (www.fishersci.com/‎)BP151-500
ヘプタンフィッシャー・サイエンティフィック (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625使用前にナノ純水で10倍から1倍に希釈
ホルムアルデヒドッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/‎)BP531-500
グリシンバイオラッド (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSバイオラッド(www.bio-rad.com/‎)161-0301
尿素バイオラッド (www.bio-rad.com/‎)161-0730
フェニルメタンスルホニルフッ化物Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1Gイソプロパノールに200 mMのストック溶液を調製し、溶解バッファー中に2 mMの作業濃度に希釈します
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
15 mlチューブUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
漂白剤Clorox ブランド等量のナノ純水で希釈して 50% 漂白剤
を作る 50 ml チューブBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
最上層ふるいフィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
最下層ふるいフィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
を確保します プロBP26324 フィ(代表)

参考文献

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