多成分タンパク質複合体は、細胞機能および開発中に重要な役割を果たしている。ここでは、後続の構造-機能分析のための架橋された複合体の精製に続いてインビボ架橋後のショウジョウバエ胚から天然のタンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。
多成分タンパク質複合体は、細胞機能および開発中に重要な役割を果たしている。ここでは、後続の構造-機能分析のための架橋された複合体の精製に続いてインビボ架橋後のショウジョウバエ胚から天然のタンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。
多くの細胞プロセスは、マルチサブユニットタンパク質複合体によって制御される。頻繁にこれらの複合体は、一過性に形成し、組み立てるためにネイティブ環境が必要です。したがって、これらの機能性タンパク質複合体を同定するためには、細胞溶解およびその後の精製の 前に、生体内でそれらを安定化することが重要である。ここでは、 ショウジョウバエの胚から大真正タンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。この方法はin vivoで容易に細胞膜を通過することができ、低濃度のホルムアルデヒドを用いて架橋することによって、胚の内側の複合体の胚の透過化と安定化に基づいている。続いて、関心対象のタンパク質複合体は、ゲル精製し、そして質量分析によって分析免疫精製される。我々は、生殖系列発達のために必須であるチューダータンパク質複合体の精製を使用してこの方法を説明する図である。チューダーは、複数のチューダードメインを含む大規模なタンパク質である - 小さな標的タンパク質のメチル化アルギニンまたはリジンと対話モジュール。この方法は、異なる生物及び組織由来の天然タンパク質複合体の単離のために適合させることができる。
マルチサブユニットタンパク質アセンブリおよびDNA-又はRNA-タンパク質複合体の単離は、タンパク質複合体、DNA結合性調節タンパク質又はRNA結合タンパク質のRNA標的によって認識される、ゲノム遺伝子座を同定するために行われる。別の方法は、転写因子またはクロマチンタンパク質（のChIP-seqの）1と所与のRNA結合タンパク質（CLIP-seqの）2に関連するRNA標的によって認識されるDNA部位のゲノムワイドな同定を可能にする。 RNA由来のcDNAまたはDNA標的のライブラリーは、その後、深く配列決定される。これらの方法には、化学的またはUV誘導に研究複合体のタンパク質成分に対する抗体を用いて免疫沈降（IP）に続いて複合体を安定させるために、架橋を使用しています。
生物の開発中に、多くのタンパク質複合体を一過形成する。したがって、デベロッパーを制御する分子メカニズムを理解するために、インビボでのこれらの複合体の組成および機能を分析することが重要であるelopment。それは、in vitroで相互作用する成分の本来の濃度と細胞生化学的環境を再現することは事実上不可能であるため、このようなin vivoでの解析は、in vitroでのアプローチよりも優れているでしょう。ここでは、我々は成功してショウジョウバエの胚から、大きなタンパク質複合体....
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1。大アップルジュース - 寒天プレートの準備
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ウェスタンブロット（ 図2）、続いて（ 図1に示されている）、7％工程ゲル-架橋および架橋TUDタンパク質複合体の精製に成功したの有効性は3％でSDS-PAGEにより分析した。
3％の使用目的 - 7％ステップゲルを複合体の残りの未架橋TUDタンパク質および濃度の架橋TUDタンパク質複合体の効果的な分離に基づいている。上述した我々のインビボ架橋条件で、TUDタンパク質の大部分は依然として残っている未架橋の可能性がある。これ自由TUDタンパク質は、SDS-PAGEによる分離するまで、IPの間に架橋された複合体と同時精製でしょう。明らかに保持することなく、7％のボーダー - サイズが大きくても、未架橋TUDタンパク質（285 kDa）は、3％を越え移行されます。大きな分子量を有する架橋TUDタンパク質複合体は、目に得られた、難易ゲル国境を越えて移行を有するのに対しE複合体は、「トラップ」との国境に近い境界線や「テーリング」に集中しているため、自由TUDタンパク質から分離されている。
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ホルムアルデヒドは、一般的に、タンパク質 - タンパク質及びタンパク質 - 核酸相互作用を同定するための架橋剤として使用されている。一緒に下流の質量分析手法との互換性との良好な溶解性および細胞膜透過性は、ホルムアルデヒド、細胞内架橋アプリケーション3,15-17のための理想的な候補薬剤を作る。特に、正常ヴァーサ、 ショウジョウバエ 11において重要な生殖細胞RNAヘリカーゼに関連付けられたmRNAを同定するために使用した。近接して存在する唯一の分子は、標的タンパク質の相互作用パートナーの特異性を強化する、適当な条件下で架橋されることを意味し、市販の架橋剤のうち、 - （2.7オングストローム、2.3）、さらに、ホルムアルデヒドは最短のスペーサーアームのいずれかを有する。上述の理由により、ホルムアルデヒドは、我々のプロトコルにおいて、架橋剤として選択した。しかしながら、これは、uと除外すべきではないショウジョウバエの胚のためのin vivoアプリケーション内の他の架橋剤のsefulness。しかし、明らかなTUDはジチオビス（スクシンイミジル.......
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著者らは、開示することは何もありません。
我々は、この研究とその技術のヘルプはジョーダン·デイビス、ヤンヤン林、エリックSchadlerさんとJimiao鄭に感謝します。この作品は、AlaへのMCB-1054962を付与NSFのキャリアによってサポートされていました
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ショウジョウバエ寒天 | 実験室科学(http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | リンゴジュースプレートが壊れやすくなる原因となるため、水と寒天の混合物を長期間オートクレーブしないでください |
| メチル4-ヒドロキシ安息香酸 | シグマ(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | 別名:TEGOSEP |
| 人口ケージ | フライスタッフ(http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| 細いナイロンメッシュ | フライスタッフ(http://www.flystuff.com/) | 57-102 | コレクションバスケットを作るときは、ハヤブサチューブキャップの開口部よりもわずかに大きいメッシュをカットして、密閉性 |
| ダウンスホモジナイザー | シグマ(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | ホモジナイザーを氷の上で冷やし、使用前に冷たく溶解したバッファーで事前にすすぎますタンパク質の分解を防ぎます |
| テアーゼ阻害剤カクテル | ロシュ(http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBSは、濃縮プロテアーゼ阻害剤ストック溶液を調製するために使用できます |
| 抗HAアガロースビーズ | MBLインターナショナル(http://www.mblintl.com/) | 561-8 | キットには、HAペプチドとスピンカラムも含まれています |
| HAペプチド | MBLインターナショナル(http://www.mblintl.com/) | 561-8 | PBSで2 mg / mlに調製 |
| スピンカラム | MBL インターナショナル (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | スピンカラムは、 |
| イソプロパノール | フィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/) | ||
| トリトン X-100 | フィッシャー・サイエンティフィック (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| ヘプタン | フィッシャー・サイエンティフィック (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | 使用前にナノ純水で10倍から1倍に希釈 |
| ホルムアルデヒド | ッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| グリシン | バイオラッド (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | バイオラッド(www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| 尿素 | バイオラッド (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| フェニルメタンスルホニルフッ化物 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | イソプロパノールに200 mMのストック溶液を調製し、溶解バッファー中に2 mMの作業濃度に希釈します |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15 mlチューブ | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| 漂白剤 | Clorox ブランド | 等量のナノ純水で希釈して 50% 漂白剤 | |
| を作る 50 ml チューブ | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| 最上層ふるい | フィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| 最下層ふるい | フィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
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