落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

サマリー

細胞外マトリックスは、創傷治癒、炎症や腫瘍形成の間に、実質的なリモデリングを受ける。我々は、線維性のダイナミクスならびにエピ蛍光または二光子顕微鏡を用いて、高い空間分解能と時間分解能を有する網目状のマトリックス成分を可視化する新規な生体免疫蛍光顕微鏡法を提示する。

要約

組織形態を維持するための物理的な足場であることに加え、細胞外マトリックス（ECM）は、活発に開発および臓器の恒常性中に細胞および組織の機能の調節に関与している。それは、生物活性ECMタンパク質断片の放出を介してなど、生体力学的、生化学的、生物物理学的およびシグナル伝達経路を介して作用する組織の緊張を調節し、細胞移動のための経路を提供することによってこれを行う。腫瘍微小環境の細胞外マトリックスは、線維性および非線維状マトリックスタンパク質の分解、堆積および組織によって特徴付けられる、実質的なリモデリングを受ける。腫瘍微小環境の間質補強は、腫瘍の増殖および浸潤を促進し、血液やリンパ管のリモデリングを引き起こす可能性があります。マトリックスタンパク質のライブイメージングは​​、しかし、この点にマトリックス成分リットルの大部分を残して、多光子顕微鏡を用いて第二高調波発生によって検出することができる線維性コラーゲンに制限されるargely見えない。ここでは、薄い背側の耳の皮膚細胞外マトリックスタンパク質の免疫標識とエピ蛍光と2光子顕微鏡を用いて、生きたマウスでの露出した組織の生体内イメージングにおける腫瘍接種のための手順について説明します。我々の生体内イメージング法は、成長する皮膚腫瘍の文脈における線維性および非線維状基質タンパク質の両方の直接検出を可能にする。我々は、ローカルマトリックス収縮による血管リモデリングの例を示す。また、第二高調波発生を用いて検出、腫瘍の線維性マトリックスは、我々はまた、腫瘍細胞と腫瘍細胞とT細胞の相互作用の長期（12時間）画像を示し、例えば、テネイシンCとして新たに堆積され、マトリックス成分から空間的に別個であることがわかっ基底膜のコラーゲンIVに沿って移行。まとめると、この方法は、一意的にPROVもよく、経時的に腫瘍細胞の同時検出、それらの物理的微小環境および内因性組織の免疫応答を可能にする腫瘍の進行および最終的な成功または治療に対する耐性のメカニズムにIDEの重要な洞察。

概要

炎症性、転移性およびマトリックスリモデリング過程の生体内イメージングは、研究の重要な分野であると蛍光タンパク質^1,2を表現数々のトランスジェニックレポーターマウスモデルの作成 ​​を動機としている。による画質を低下させ、組織を通して光透過を制限する焦点外の蛍光シグナルに、撮像厚い組織は、共焦点又は多光子走査顕微鏡³で可能である。より速く、より安価で複雑 ​​なエピ蛍光顕微鏡を用いてのみ、例えばニワトリ漿尿膜⁴又はマウス耳真皮⁵とほぼ二次元の組織で可能である。ほとんどの画像化システムは、細胞型特異的様式で様々な蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを利用する。これらのタンパク質は、弱い毒性を提供するにもかかわらず、それらが免疫応答^を誘導する^6。さらに、特定の細胞サブタイプの間で切り替えたり、マークすることが困難であるこのような変化のようなIRの基礎または活性化状態は、新しい遺伝モデルの準備が必要です。蛍光タンパク質の発現は、一般的に細胞内区画に制限されるように加えて、それは通常、基底膜タンパク質又は組織ケモカイン堆積物⁷のような画像外の構造には不可能である。その代わりに、細胞外の抗原に対する抗体を用いた間接標識は、事実上すべての細胞型もしくはマトリックス特定のコンポーネント^8,9のための柔軟性を提供します。しかし、この標識アプローチの主な欠点は、補体系依存性細胞毒性および細胞と細胞外構造¹⁰の食作用を引き起こすことができ、抗原-抗体免疫複合体によって仲介される免疫毒性と関連している。

炎症または創傷治癒の間の腫瘍微小環境のではなく、正常組織の細胞外マトリックスは、実質的なリモデリングを受ける。腫瘍微小環境の間質補強はPROMOでき応力によって誘発されるシグナル伝達機構と、血液やリンパ管¹¹の原因のリモデリングにTE腫瘍の増殖および浸潤。しかしながら、マトリックスタンパク質のライブイメージングは​​、多光子顕微鏡を用いて第二高調波発生によって検出することができる線維性コラーゲンに限定される。最近では、光と画像化された細胞や組織構造⁵への免疫毒性の損傷のリスクを最小限に抑える新たな生体内イメージング法を公開しています。連続的な生体内の可視化の単一ラウンド2時間^12-17に30分の範囲である確立されたイメージング技術と比較して、我々の生体内免疫蛍光（IF）の技術は、12時間（長期^8）イメージングせた。なお、撮像時間は、我々の動物プロトコルで定義された制限に起因し、12時間に限らず、それが延長することができないという技術的な反指示がされていないことに注意することが重要であるかの血圧及び心拍等動物の重大な健康パラメータ速度は^、08を制御する。また、自動化された蛍光実体顕微鏡を使用することにより、我々は、単一の実験中に複数のフィールドから画像を収集することができましたし、機能的な血液やリンパ管でサポートされている皮膚の生理学的な文脈で発生したまれな免疫学的および再構築のプロセスを観察した。実体顕微鏡レンズは、比較的大きな2 cmの作動距離を有する2光子顕微鏡の光学系とは対照的に浸水を気化させる必要がないため、長期の撮像のみ蛍光実体顕微鏡下で行った。生体IFは、正常な皮膚の任意の細胞外マトリックス成分の免疫標識および検出を可能にした。この技術の設計は、有害な免疫毒性の^5を発生させることなく、生細胞および外科的に露出させ、マウスの真皮上の組織化行列要素の免疫染色を使用した革新的なコンセプトに基づいています。外科的手技自体は真皮に安全である脈管構造とは独立に神経支配されている耳、自律的に血液によって供給され、別々のリンパ循環により排出における2つのスキン層の分離にのみ依存している。私たちの実験は可能に血液やリンパ管および創傷治癒プロセス間の白血球の輸送を含む、少なくとも12時間かけて重要な病態生理学的なイベントの範囲の画像化。初版発行では、生体内イメージングの様々な分野における最先端の規格に当社の技術を比較した。したがって、我々は、初期のリンパ管^15を回収する代わりに、予想入る免疫細胞のユニークな視覚化を含む様々なタイプの白血球によって血管外遊出およびリンパ脈管内事象を観察した。また、他のグループ^9,18によって行わ観察を補完し、我々は、in vivoにおける CCL21の収集にまれにしか初期のリンパ管に強い不連続堆積物を形成することができることを見出した。

プロトコル

動物で実行されたすべての手順は、スイスの動物保護法、動物の保護に関する条例及び動物実験に関する条例に厳密に従っていた。具体的に、この研究を承認した：我々は、委員デ·サーベイランスドゥETATデ·ヴォー（2687許可番号）という名前の私たちの施設内動物管理使用委員会（IACUC）があることを確認します。

耳の1。腫瘍接種

1. DMEM + 10％FBS培地を用いて10 10cmペトリ皿中の培養B16-F10-GFPメラノーマ細胞。
2. 細胞が80〜90％コンフルエントである場合には、PBSで洗っし、トリプシン処理によってそれらを切り離す。 4℃で5分間、1,500×gで細胞をスピンダウン1mlのリンゲル液中でペレットを再懸濁し、1.5mlエッペンドルフチュー​​ブにそれを転送する。再びスピンとばかり、ペレットの上に留まる媒体の薄い層を除くすべての上清を除去します。厚い細胞スラリーで終わるように細胞を再懸濁。
3. KETの混合物で、マウスを麻酔アミン/ dorbene [メデトミジン]（75mg/kg-1mg/kg）と動物が十分に緩やかなつま先のピンチを実行することによって、麻酔をかけていることを確認します。ケースの移動中の0.1％ステップでイソフルラン濃度を増加する（ 例えば、足の引っ込め ）が観察される。全体の手順の間、直腸サーミスタ制御加熱パッド（37℃）上でマウスを維持し、適切な眼軟膏で目を保護します。
4. ハミルトンシリンジ（33ゲージ針、10ミリリットルのシリンジ容量）を準備します。針で先端キャップを外し、先端室の上に細胞懸濁液20μLをロードします。 5ミリリットルスラリーをシリンジ内にロードされるまで、プランジャーを引き戻す。先端室から過剰のスラリーを取り外し、先端キャップを閉じます。
5. 粘着テープを使用して、人差し指の先端に耳の近位端を固定する。 45°の角度では、ゆっくりと背側真皮と軟骨の間にハミルトンシリンジ針を挿入します。中に入ると、2〜3mm程度ための遠位ために耳の近位側に浸透。
   注：細胞注入の手順は、訓練を受け、認定された技術者が行ってください。さらに、このプロセスは、ゆっくりと順番に実行する必要があります。最初の針は、耳の皮膚に水平に配置し、耳の真皮にゆっくりと挿入。一度だけにして、針の端が皮膚にあり、プランジャーを押さなければならない。プランジ​​ャーを押すと、皮膚内の細胞の接種が開始されます。針の耳の真皮の2層、軟骨の層を通過させ、実験を行う人の皮膚に入るの万一、実験者の指に与え痛みは憂慮すべき兆候と考えられ、すぐに後退を引き起こすべきである実験者の皮膚から針の。その場合には、プランジャーが押されてはならず、皮膚はアルコールで滅菌する必要があります。あるいは、代わりに、指の無生物耳を安定化するために使用することができる。
6. 3μlの細胞スラリーを注入し、ゆっくりと耳から針を引っ込める。腫瘍細胞は7-9日間、固形腫瘍を形成し、蛍光実体顕微鏡を使用して、腫瘍増殖に従ってみましょう。
7. あるいは、組織マトリックスと腫瘍細胞との相互作用の初期の手順に従うように、露出され、染色された耳の真皮（ステップ3.3の後）にリンゲル液に懸濁10万腫瘍細胞の50μLを適用します。

2。耳の手術

1. 三日の実験の前に、マウスの頭を剃る、頭と耳（10〜15秒）の周りの毛を脱毛し、水ですすいでください。
2. 加湿酸素およびイソフルラン（3〜4％の誘導、1〜2％のメンテナンス）の混合物で、マウスを麻酔し、動物が十分に緩やかなつま先のピンチを実行することにより麻酔していることを確認します。ケースの移動中の0.1％ステップでイソフルラン濃度を増加する（例えば、足の引っ込め ）が観察される。全体の手順の間、直腸サーミスタ制御加熱パッド（37℃）上でマウスを維持して、その目を保護適切な眼軟膏。
3. 8接着ガラス組織学スライドで作られたプラットフォームを構築する。その背中の上でマウスの電源を入れ、ゆっくりとガラススライドのスタックに担癌耳を配置。スタックに耳の前方および後方の端を固定するための粘着テープの小さなストライプを使用してください。
4. メスを用いて、マウスの耳介の耳輪に沿って耳の腹側の皮膚をカット。湾曲したピンセットの助けを借りて、ゆっくりと腹側真皮と腫瘍が接種した背側真皮から軟骨をはがす。背側真皮を露出曲がったピンセットで腹部の皮膚や軟骨をやってのける。 NOTE：耳の主要な血管が切断されるか、または血液循環を15分以内に通常の流れに戻らない場合、耳がイメージングのために使用することができない。常にリンゲル液を使用することにより、ウェット開かれた耳の皮膚を維持し、カバーガラスを使って湿度を保護します。
5. 場合には永続的な出血フォーム腫瘍血管があり、100μlを加えることによって出血を止める5分間の耳の上にリンゲル液（102のNaCl、5mMのKCl、2のCaCl _2、28 mMの乳酸ナトリウム）中のトロンビン（5単位/ ml）。
6. リンゲル液約5ミリリットルで二回耳を洗浄し、滅菌ワイプで余分な液体を除去する。すぐに（任意の時点で開いて耳を乾燥させてください！）次のステップに進みます。

3。免疫蛍光染色

使用リンゲル液は、ヒト血清（1:10）、ヒトIgGにマウスポリクローナル二次抗体（1:50）、および125 IU / mlの（2.5 mg / ml）を、すべての染色ステップのアプロチニン（ブロッキングバッファー）を加えたもの。アプロチニンは、手術後に発生する可能性があり、最初の出血を制限するためにプラスミン促進凝固を阻害する。

1. 隆起の甲介にオープン真皮と耳の部分を折るし、滅菌ワイプと外側の未開封の耳の真皮を乾燥させます。前部と後部dorsumの複数形に外科接着剤の0.5μLを適用することにより、スライドガラスのスタックに耳を固定化Lエッジ。その後、そっとガラスに背側の耳の真皮をフラット化。
2. 露出された耳にブロッキング緩衝液を100μlの全容量で10μgの/ mlの濃度で細胞外マトリックス分子を標的とする一次抗体を適用します。耳の縁部上で乾燥さ染色液を防止するためにカバースリップで耳を覆う。 15分間インキュベートします。リンゲル液約5ミリリットルで二回耳を洗ってください。
3. 曝露耳にブロッキングバッファー100μLの全容量10μg/ mlの濃度で、適切な二次抗体またはストレプトアビジンコンジュゲートを（例えば594 nm以上647 nmのような高励起波長と蛍光団が生体内イメージングに有利である）を適用します。カバーガラスで耳をカバーし、15分間インキュベートする。リンゲル液約5ミリリットルで二回耳を洗ってください。

その場での腫瘍細胞と血液感染、活性化された脾臓細胞の4。相互作用

1. inoculatio後7日間コンジェニックマウスの背中の皮膚に、GFP-B16-F10黒色のnは、動物を安楽死させる、脾臓を収集します。 70ミクロンの細胞濾過器脾臓の機械的破壊と脾細胞を分離します。
2. レッドCMTPX細胞質染色（PBS中1μM）で37℃で8分間のラベル脾細胞を、4℃で15ミリリットルで4回洗浄し、すぐに耳だったマウスの尾静脈に200μlの無血清培地に注入7日前にB16-F10-GFPを接種。

実体顕微鏡を使用した5。生体内イメージング

1. 短期的なイメージング（最大2時間）の場合は、7.5（アスコルビン酸リンゲル液の最終のpHで140 mMのアスコルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES、4のKClおよび5mMのCaCl _2を含む新たに調製された無菌のアスコルビン酸リンゲル液を追加固定化された耳の上部の浸透圧は320 mOsmで）。カバーガラスで耳をカバーし、2倍のレンズを蛍光実体顕微鏡を使用して撮影開始。
2. 長期的画像化のための（2時間以上）、約0.5cm離れて耳から、カバースリップの下で（アスコルビン酸リンゲル液を含む容器に接続されている）、針の出口を配置します。常にカバースリップの下室にアスコルビン酸リンゲル液を提供するために1μL/分の速度で蠕動ポンプを使用してください。
3. 1Xレンズ2Xレンズまで（ワーキングディスタンス6センチメートル）（作動距離2cmに）変更します。収集ソフトウェアを開き、蛍光実体顕微鏡の設定を行います。カメラの設定は、画像の色深度として12ビットを選択して、5.1％（最大値）、0％（最小）からグレイスケール値のカメラ範囲を調整し、ガンマ補正を2に設定。
   1. セット獲得1（最小）〜1,000蛍光強度（最大値）、倍率280X、320Xに設定され（露光時間が1秒未満であるべきである）過剰または過小露出回避露光時間を調整するゲイン。撮像視野（通常10〜20）の数に応じて、取得サイクルの時間間隔を設定する必要があること2分の1をトゥイーン。漂白および光毒性を引き起こす可能性が時間を短縮。
4. 腫瘍細胞だけでなく、（例えば、図3のように）染色されたECMタンパク質が含まれているいくつかのフィールドを選択してください。電動ステージを用いて、経時的に（ 例えば、2分毎に）（例えば、 図3のGFPフルオロフォア647のような）適当な蛍光チャンネルの画像を取得する。
5. 実験後、動物実験ガイドラインに従ってマウスを安楽死させる。この場合、実験の最後に、瀉血（心臓内灌流）、続いて頸椎脱臼により麻酔したマウスを安楽死させる。

多光子顕微鏡を用いて6。生体内イメージング

1. シリコングリスを使用して、耳の付け根から始まり、耳の周りに約2センチ、直径2〜3mmの高さの円形の壁を構築します。全く漏れポイントがないことを確認してください。アスコルビン酸リンゲル液の円を塗りつぶす。
2. 場所マウスステージ上や加熱パッド（37°C）を接続します。
3. オープンな収集ソフトウェアおよび多光子顕微鏡の設定を行います。
4. 腫瘍細胞および（例えば、 図3のように）染色されたECMタンパク質を含有する四つの異なるフィールドまで選択。この例では、GFPを850 nmまでチューニングしたTi-サファイアレーザーは蛍光団647染色のため、その後の単一光子647に信号を送るとSHGと線維性コラーゲンを可視化する。 1.00 NAレンズと2ミリメートル作動距離で浸水HCX APO 20Xと（例えば、GFPおよび図3の蛍光団647など）は、適切な蛍光チャンネルの画像と時間をかけて第二高調波発生、 例えば 2分ごとに、獲得する。
5. 実験後、瀉血（心臓内灌流）が続く頸椎脱臼で麻酔マウスを安楽死させる。

結果

現在までに、生きている組織内の免疫染色は、一般的に高い染色の背景と免疫²⁰をもたらす免疫複合体の形成に使用されていません。これは、このようにして、後続の間接的な強い免疫染色を、これらの細胞の「目を見えにくくする」、組織マクロファージ上のFcγ受容体をあらかじめ遮断することによって克服された。標識は、細胞外であったように、光毒性およびフルオロ漂白は天然の抗酸化緩衝、等張アスコルビン酸（ 図1A）内の組織に浸漬することによって制御することができる。退色は今阻害さだけではなく、完全に防止することができるように、この方法⁵の我々の最初の記述以来、我々は（ 図1B）私たちの抗漂白および抗光毒性の手法を改善した。これは耳が固定化され、チャンバ内の酸化防止剤（100μl）を、大量の耳を埋め込むことによって行われる。ピクチャである場合には300秒一定の撮影時間は、撮影の10時間に対応している500ミリ秒ごとに1分（平均画像の設定）のために収集。

図1光退色および光毒性は、リンゲル緩衝液中でアスコルビン酸と塩化物を置換し、その溶液を、100μlの体積の露出耳を埋め込 ​​むことにより停止させた。 （A）組織を、コラーゲンIV、基底膜の成分に対するビオチン化抗体を用いて最初に染色した。染色は、後にストレプトアビジン-647（赤色）で検出し、次いで常に正常リンゲル液（上パネル）またはアスコルビン酸リンゲル液（下パネル）のいずれかで300秒間画像化した。写真は500ミリ秒ごとに1分（通常のイメージング設定）のために収集されたとき300秒一定の撮影時間は、撮影の10時間に相当する。円周率の最も明るい25％XEL強度値は緑色に着色している​​。免疫蛍光減衰の（B）の定量化（アスコルビン酸リンゲル内のリンゲル対50％、0％）。値は、初期蛍光に対して標準化した。免疫蛍光実体顕微鏡で収集した画像。 Aのスケールバーは、100μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

腫瘍転移細胞および腫瘍間質の間の相互作用を調査することは、腫瘍細胞の遊走および腫瘍免疫のプロセスを理解することが重要である。腫瘍関連間質が、腫瘍塊の最大90％を構成し、積極的に腫瘍の増殖および転移の広がり^21を調節するためである。しかしながら、リンパ管や血管のいずれかに向かってマトリクス駆動する腫瘍細胞の移動を^22を欠いている方法に機構的洞察。これは事実に部分的に起因していることを生体内IMマトリックスタンパク質の老化は二光子顕微鏡²³に第二高調波発生を用いた線維性コラーゲンの成熟した繊維の視覚化に限定される。したがって、我々は、細胞外マトリックス成分の直接可視化を含むように血液やリンパ管、周皮細胞、神経、筋肉、および脂肪細胞を含む組織の微小環境の視覚化のために我々の方法を適合。多くの構造は、例えば、コラーゲンIVまたはパールカン（ 図2A）が、特定の細胞表面マーカーのための直接染色、 例えば、LYVE1（ 図2BおよびC）およびポドプラニンのような基底膜成分に対する免疫染色後に形態学に基づいて区別することができる（ 図。） ^- 2C）、さらに初期、毛細血管、リンパ管、リンパコレクタから（LYVE1 ^+）（LYVE1を区別することができます。皮膚中のマトリックス結合CCL21の染色は、リンパコレクターIDEの基底膜上で、このケモカインの預金を明らかにしたパールカンの染色、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ 図2D）でntified。

図2。通常のマウスの耳に住んで染色の例。 （A）パールカンの染色、基底膜成分は、すべて、血液およびリンパ管、神経、筋繊維および脂肪細胞を示す。 （B）LYVE1染色は、初期のリンパ毛細血管網をマーク。 LYVE1とポドプラニンのため、（C）共染色、汎リンパマーカーは、初期および収集リンパ管のネットワークを示している。耳真皮さもなければ撮像視野をカバーする脂肪細胞の少ない数を有するように、背側の耳真皮は（光学切片なし）古典的なエピ蛍光顕微鏡を用いて画像化することができる。 （D）は CCL21スタイパールカン（赤）について染色リンパ基底膜上寧（緑）。免疫蛍光実体顕微鏡で収集した画像。 AおよびB中のスケールバーは1mm; C言語で、Dが100μmと50μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

最も重要なことは、通常、SHG、古典的なマトリックス検出方法²³によって検出することができない構造タンパク質を可視化することができる。例えば、我々はテネイシンC（ 図3A）、腫瘍形成の間に発現されるマトリックスタンパク質を見出し、創傷治癒および炎症^19は 、原線維コラーゲン（ 図3B）よりも、腫瘍間質の異なる場所に堆積される。このマトリックス不均一性は、腫瘍細胞の分布および転移した（ 図3C）に影響を与える可能性があります。

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図3背側の耳真皮は、ライブ多光子顕微鏡を用いて画像化することができる。腫瘍B16-F10の単一フィールド。腫瘍間質は、テネイシンC抗体で標識し、染色は抗ヤギ-594ロバ抗体で検出した。テネイシンC（赤色）の免疫蛍光ネットワークAに示されており、線維状コラーゲンはBで第二高調波発生（SGH）で検出した。これら二つのネットワークは、C（マージ）で腫瘍細胞（シアン）が重畳されている。テネイシンCでマークされた新たな腫瘍行列はSHG（緑）で検出し、線維性コラーゲンと重複していません。 44、4回のzステップ1.0ミクロンでZ-セクションを平均した画像は、16ビットの色深度モードで取得した。二光子顕微鏡で収集した画像。スケールバーは100μm。REF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg"ターゲット= "_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

異なる腫瘍マトリックス成 ​​分の免疫標識を、以下の（ 例えば、テネイシンC及びコラーゲンIV）腫瘍マトリックスから、我々は、腫瘍行列指向性リモデリング（ビデオ1）の制限された突然のイベントを同定できた。我々は傷^11,24治癒例で先に示したように、腫瘍微小環境内での開発力は、腫瘍の行列の伸縮に、結果のリモデリングと同程度に腫瘍血管の伸長につながる可能性があります。

ビデオ1。コラーゲンIV（赤）とテネイシンC（シアン）血管（矢印）を受動的に細長く、3腫瘍細胞（緑色）で標識された腫瘍転位マトリックスの拡大 。 teascin Cが豊富な腫瘍行列転位する血管（赤い水平に向けstructurの局所的な収縮E）イメージングの12時間の間、約100μmによる。免疫蛍光実体顕微鏡で収集した画像。 ビデオを見るにはここをクリックしてください。

これらの実験で使用した光子束を迅速²⁵酸化から保護されない蛍光色素を漂白するように、フルオロフォア標識と多光子顕微鏡を使用することは問題である。ここでは、同時であっても、高い光子密度2光子顕微鏡（ビデオ2）にフルオロフォアの最小限の光退色に免疫標識テネイシンC行列をイメージしながら、我々は2光子タイムラプス顕微鏡検査を行うことができることを示している。

2光子顕微鏡中のテネイシンC免疫蛍光（赤）の映像2。低レベルの光退色。B16-F10-GFP腫瘍細胞（シアン）は9日、接種後に開く背側の耳に画像化した。蛍光シグナルは、アスコルビン酸の適用によって保護された画像化された組織上にリンゲル液。第二高調波発生（緑色）11を有するC. 16ビット色深度画像をテネイシンで表される新規マトリックスと重なっておらず、4回のz工程1.9ミクロンでz軸切片の平均を15分間取得した。画像が収集された6 Z-平面で1分ごとに5秒を収集した。 ビデオを見るにはここをクリックしてください。

我々はまた、転移性腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用を画像化した。 8時間静脈内輸液した後に、腫瘍関連血管から溢出担癌マウスからCMTPX標識した脾細胞を、腫瘍のマトリックスに侵入し、積極的に長持ちする細胞接触（ビデオ2）を形成することによって、腫瘍細胞と相互作用した。フルオロフォア647で標識したコラーゲンIV構造は、イメージングの12時間の間に、光退色に耐性であった。

腫瘍からCMTPXで標識された脾細胞（B16-F10）-Bの映像3。相互作用個々の腫瘍細胞（GFP-B16-F10）でマウスを出穂。脾細胞は、コラーゲンIVのための組織染色後のIVを輸血された。コラーゲンIV-グリーン（647）、脾細胞 - 赤（CMTPX）、B16-F10シアン（GFP）。免疫蛍光実体顕微鏡で収集した画像。ビデオ再生時間は12時間。 ビデオを見るにはここをクリックしてください。

新たに単離された腫瘍細胞は、コラーゲンIV染色されたプレ露出耳真皮上に重層した。私たちは、組織に付着した後の細胞のいくつかのグループが、血管や脂肪細胞の基底膜に沿って集団的移行を開始したことを観察できた。

ビデオ4。腫瘍細胞が基底膜に沿って移動（赤647）、IV型コラーゲンについて染色した正常な耳の皮膚は、新たに継代B16-F10-GFP細胞を重層し、5時間画像化した。組織に付着したいくつかの腫瘍細胞が一緒に集団移住を開始しました血管や脂肪細胞の基底膜。免疫蛍光実体顕微鏡で収集した画像。ビデオ再生時間：5時間ビデオを見るにはここをクリックしてください。

耳真皮は、実質的に2次元であるため、また、我々は容易に代わりに遅く、高価な共焦点又は多光子顕微鏡により、高速蛍光実体顕微鏡を用いて大量のデータを収集することができる。しかしながら、それは我々の生体内で上記走査顕微鏡法のいずれかを使用することも可能であるIF製剤（ 図3、ビデオ1）。

ディスカッション

意義

ここでは、高解像度と線維性だけでなく、網目状のマトリックスタンパク質を含む様々な組織の微小環境構成要素の動的な可視化を可能にする新たな生体顕微鏡のアプローチを提示します。 （i）の生体内蛍光イメージングは、血液から又はリンパ管への溶質の漏れを追跡するために、 例えば 、微小循環の研究において使用されてきたが、免疫染色と組み合わされていない：このメソッドは、現在の生体内イメージング技術を上回るいくつかの利点を有する。 （ii）の遺伝的に修飾されたレポーターマウスの使用は、画像化される特定の細胞タイプを可能にするが、それらの可用性（または新しいものを作成するために相当な努力）を必要とし、研究することができる細胞型相互作用の数を制限する。 （iii）の細胞外マトリックスは、第二高調波発生を用いてインビボで画像化することができるが、この技術は、唯一の重要な細胞外成分を大量に残して、繊維状コラーゲンを検出することができる基底膜、フィブロネクチン、テネイシン、成長因子、ケモカインおよび現在の研究のための手の届かない組織グリコサミノグリカンのような。我々の方法は、これらの制限を克服し、標準的なイメージング技術は、成長因子（ 例えば VEGF ^26）およびケモカイン（CCL21 ^5,18及び図2Dに結合する他の細胞型、組織構造、ヘパリン硫酸の沈着のための免疫染色を配合し、さらに組み合わせることを可能にする）、または細胞外マトリックスタンパク質を同時に血液および/またはリンパの流れを追跡しながら。

制限事項

生体内のIFの落射蛍光イメージングは​​、厚い皮下組織（脂肪組織）を奪わ薄い皮フラップ、に制限されています。我々は、背側の耳の耳真皮は皮膚の比較的無害外科用展示に最適である、技術IF生体内で落射耳真皮に限定されず、 例えば、潜在的に適用できることがわかっている間つま先や新生児マウスの背中の皮膚の露出した皮膚。免疫蛍光の急速な抗体染色（15分）受動拡散に依存していないが、リンパ管が^27を閉塞している場合、したがって染色が観察されないことができ、機能性リンパ排液と間質液の流れを必要とする場合。それと並んで、リンパ管は強いし、漏れやすい血管系（負傷した血管、細動脈^）5を染色。背側と腹側の耳の皮膚フラップの分離は、軽度の手術ですが、それは様々な組織の細胞にいくつかの毛細血管や細胞死への損傷を引き起こす。 1は、 例えば 、細胞の生存に対する薬物の穏やかな効果を見て、完全に無傷の組織を調査する必要がある場合に問題になる可能性があります。また、光毒性および光退色から皮膚を保護する働きをする抗酸化剤の適用は、組織の酸化的ストレスまたは酸化窒素BIOLOG 例えば研究するための生体内免疫蛍光技術の使用を排除するY。

最後に、免疫複合体と組織常在性マクロファージの盲検化は、これらの細胞及び組織の免疫応答及び樹状細胞の活性化の研究などの影響をアクティブにすることができます。

修正とトラブルシューティング

組織の酸化的ストレスまたは酸化窒素の生物学を研究するために、アスコルビン酸は、実験出力を妨害しない他の組織適合性培地と交換しなければならない。研究の目的は、組織免疫応答および樹状細胞の活性化および遊走の機能および活性化である場合には同様に、皮膚免疫細胞上のFc受容体をブロックすることは避けるべきである。これは、Fcフラグメントに開裂（のF（ab）2抗体断片）を有する二次抗体の使用または検出試薬としてビオチン化抗体及び蛍光ストレプトアビジンを用いて行うことができる。

将来の応用

当社は、新規でユニークな内を提示二光子顕微鏡を用いて検出されたSHG-原線維および成熟コラーゲンとの組み合わせにおける移植皮膚腫瘍における細胞外マトリックスの画像非フィブリル成分に対する技術IF不可欠。落射蛍光画像上に多光子（または共焦点）顕微鏡法を使用する利点の1つは、z-スタッキング可能性があり、中結果、細胞外マトリックス内で発生するイベントの共局在空間、リンパ管又は血管内へ、例えば腫瘍脈管内する場合の標準的な落射蛍光顕微鏡法は、侵入細胞の形態学的変化から推測することができる。この技術は、はるかに広い可能性を秘めている。例えば、我々は、リンパ特異的光力学的治療²⁷によってリンパ管閉塞のメカニズムを調べるために生体内IFを使用している。この方法のさらなる潜在的な用途としては、炎症の間、皮膚免疫の研究、移植拒絶又は血液及びリンパの方法の機構に限定されるものではない腫瘍形成時のATIC血管増殖。

手順の重要なステップ

生理的な組織環境を維持するための重要な意味を持っている最も重要なステップは、背側真皮から腹側皮膚や軟骨の外科的分離である。切断または主要動脈または静脈を閉塞することは治療法や細胞運動⁸に対する細胞応答に影響を与えるであろう、過度の出血や地元組織低酸素につながる。外科接着剤で耳が公開する組織に接着剤をこぼしなどの注意を払って行う必要があり、固定化することは、血管の閉塞によって組織に永久的な損傷の原因となります。マウスの温度を37℃に調節し、維持しなければならない眼および肺が正常に実験中に加湿とどまるように加えて、加湿された酸素は、イソフルラン麻酔のために使用される必要がある。また、アスコルビン酸ナトリウムを新たに準備する必要があり、そのpHは、使用前にチェック。

要約するとntent ">、この生体内免疫蛍光は、マウスの皮膚における複雑な細胞の事象の分子イメージングと生理機能の実時間、地元の測定をブリッジします。それは簡単にポスト発達などの研究に適用することができるさらに、この方法は、大きな可能性を秘めている血液及びリンパ脈管形成の機構または種々の病原体により皮膚感染の初期段階を可視化する。その柔軟性と高スループット電位では、この生体内技術は著しく生物学の複数のフィールドに寄与することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス BALB
(8-12 週間	Charles River		Orleans,France
C57/Bl6 マウス (8-12 週間)	Harlan		Carshalton UK
Cell Line
B16 F10 OVA-GFPを発現する黒色腫
麻酔メンテナンス
イソフルオラン	株式会社ミンラッド	2222	Minrad Inc.、バッファロー、ニューヨーク
湿配信システム	Rothhacher GmBH		ベルン、スイス
直流温度制御システム	FHC Inc		Bowdoin, MA
実体顕微鏡
電動ステージを備えた蛍光実体顕微鏡。	M250 FA、Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar、ドイツ
1X レンズ (7.5X から 160X までの線形システム倍率)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar、ドイツ
2X レンズ (15.6X から 320X までの線形システム倍率)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar、ドイツ
LAS AF ソフトウェアで制御される DFC 350 FX カメラ	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Germany
光子顕微鏡
ライカ SP5 2光子増倍管電動ステージ	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Germany
HCX APO 20X/1.2 オイル浸漬
カメレオンウルトラレーザー
リンゲル緩衝液 (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, Germany
Aprotinin	エラスティン	AP92	エンズビル、ミズーリ
州トロンビン	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	タウフキルヒェン、ドイツ
アスコルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	11140-50G	タウフキルヒェン、ドイツ
ヒトIgGに対して産生されたマウス血清	Abcam	ab34834	英国ケンブリッジ
コラーゲンIV	Abcam	AB6581	ケンブリッジ、英国
Perlacan	RnD	ab79465	ミネソタ州ミネ
アポリス Tenascin C	RnD	AF3358	ミネアポリス、ミネソタ
ポドプラニン	RnD	AF3244	ミネアポリス、ミネソタ州
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbüttel,
Germany CCL21	RnD	AF457	Minneapolis, MN
Streptavidin Pacific Blue	Invitrogen	S11222	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 647	Invitrogen	S21374	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 488	Invitrogen	S11223	Grand Island, NY
ロバ アンチ ヤギ 594	Invitrogen	A21113	Grand Island, NY
アンチ ラビット 594	Invitrogen	A21207	Grand Island, NY
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, California
Histocryl (surgical glue)	Braun Aesculap	1050060	Tuttlingen, Germany
Cell Culture Reagents
ダルベッコ修正されたイーグル」中程度 (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Fetal wevine serum (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsin	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY (ニューヨーク州)