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方法論記事

単セルの精度で神経共培養の調製

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DOI:

10.3791/51389

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2014年5月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften, ISAS, 2Department of Biochemical Engineering, University College London, 3Institute for Life Sciences, University of Southampton

この記事について

サマリー

生体材料コーティングのチップ内のプラズマパターニングのための単一ニューロンマイクロ流体アレイ化と水のマスキングのためのプロトコルが記載されている。高度に相互接続された共培養細胞は、最小限の入力を用いて調製することができる。

要約

Campenot室のマイクロ流体の実施形態は、神経科学のコミュニティから大きな関心を集めている。これらの相互接続された共培養プラットフォームは、感染および疾患の伝播に発達および機能的神経生物学に及ぶ、様々な問題を調査するために使用することができる。しかし、従来のシステムは、重要な細胞の一次ドーパミン作動性黒質、スパイラル神経節、およびショウジョウバエキイロニューロンなどの少量の細胞を研究するための不適切な入力（コンパートメントごとに何千）、および高スループット実験のための非現実的が必要です。緻密培養物はまた、非常に局所的に二つの文化を相互接続するいくつかの増殖物（<10％）で、交絡している。 （I）、マイクロ流体、単一のニューロンが方法を配列し、プラズマパターニング生体材料コーティングはREGIするための（II）水マスキング法：本論文では簡単なマイクロ流体とパターニングプロトコルはこれらの課題に対処が記載されているSTERニューロンとコンパートメント間の伸長を促進する。最小限のニューロン共培養物は、高レベル（> 85％）intercompartment接続を用いて調製した単一細胞精度の高スループット神経生物学実験のために使用することができる。

概要

神経組織は非常に複雑である。空間的に細胞接触を通じて、特に軸索と樹状突起増生によって定義層や区画内とプラスチックの接続と一緒に注文された異種の細胞の混合物である。新技術は、より深い洞察力や病気、開発、健康的な機能の中心UNRAVELメカニズムを獲得する大きな実験的な自由を与えることが必要である。 Campenot室1,2、最近微細加工の実施例3,4は、選択的に異なる体細胞集団と、それらの神経突起増生を撹乱する能力を備えたネットワーク接続された神経細胞の共培養のex vivo製造に使用することができる。これらのマイクロ流体デバイスは、たとえば、化学、5,6またはレーザー軸索切断6-8、タウオパチー9、ウイルス伝播10,11、および軸索4におけるmRNAの局在後の軸索の変性と再生を研究するために使用されてきた。

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神経生物学者の範囲を拡大するために、技術開発を最小限の神経細胞の共培養を準備する必要があります。これは、単一の細胞と細胞内の精度でシステムの調査のための神経回路網の解きほぐしを可能にします。最小限の細胞数の要件は、パーキンソン病、耳から螺旋神経節、末梢ニューロンに関連するドーパミン作動性黒質細胞を含む希少細胞タイプを分析し、幹細胞の可能性を開く。これ以外に、携帯経済は3Rのイニシアティブに関連しています。これらのマイクロ流体プラットフォームは、大規模な毒性スクリーニングまたは他のハイスループットを用いて、動物のニューロンを必要とするデータに富む一連の実験を考えることができる。

本論文では、マイクロ流体デバイスの製造および使用のためのプロトコルが記載されている。 その場 biomateri 内と組み合わせたマイクロ流体アレイ化他のパターニング方法は、最小限の細胞数を用いて高度に相互接続神経細胞の共培養の登録に使用することができる。マイクロ流体アレイ化は、差動フロー· ​​アプローチの微細構造トラップは流体回路（ 図1のSEM像と一緒に示されている）内に配置されることにより、12月15日 、に基づいています。神経突起伸長チャネルへの入口-パス0→1は、微細構造化アパーチャの直線状のアレイにニューロンを搬送するためのより低い流動抵抗（R 2> R 1）を有する。単一のセルによるトラップの占有率が局部的に近隣のトラップに、その後の細胞を捕捉するための流線をそらすために流れを妨げる。アレイ内のトラップの完全な占有は、過剰なニューロンの除去のための操作のバイパスモードを生成するために蛇行路（0→2）に流線をそらすために、流体の比（R 1> R 2）を切り替える。

figure-introduction-1
図1。マイクロ流体回路。マイクロピラーメニスカス固定有する二重層区画化ニューロン共培養アレイのA）神経突起伸長チャネルによって相互接続された培養チャンバに隣接有する単一ニューロン整列のために微分抵抗流体回路を、B、C）SEM画像である。この設計では、三叉状ニューロントラッピング構造は、神経突起増殖物の束形成を促進するために使用した。図や王立化学協会（RSC）の許可を得て複製伝説12。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

平面基板上のマイクロパターン神経回路網の製造は容易にexamplのために（達成することができ我々のグループからのESは、Frimat ら 16と平家ら 17）を参照してください。しかし、PDMSデバイス内およびマイクロ流体チャネルへのこれらのマイクロメートルスケール整列の要件を、生理活性物質パターンをカプセル化することは、主要な技術的課題を提起する。セクション3.1にするためのプロトコルは、チップ内、またはその場で 、生体材料のパターンの製造は、提示されている。これらのパターンは、長い培養時間スケールの間にニューロンの登録を有効にして、区画間の増生を促進する。メニスカスピニング微細構造ニューロン部位および神経突起伸長のチャンネルを配列して、所謂水マスクを整列させるために使用される。露出表面は生体材料のパターンを定義するために解砕されるのに対し、水マスクは、プラズマ処理の間、接着分子コーティングを保護する。また、プロトコルは、細胞培養のために、異なる共培養区画の選択的治療のために必要な流体の単離のために設けられている。

ve_content ">プロトコルは同様に、 その場での生体材料のパターニングに蒸発し、表面張力現象を利用し、簡単です。ポリレプリケーション（ジメチルシロキサン）（PDMS）マイクロ流体デバイス18のためのソフトリソグラフィーのユーザーフレンドリーな原則を活用するように設計されており、唯一の安価なハンドヘルド型プラズマ源を必要とする。マイクロ流体回路を効果的にプログラム正しい底部ポートに材料を分配し、上方から吸引するだけで問題これらの操作を行うセル負荷と区画特定の治療法。この方法では、神経生物学者を与えることを意図している自分の研究室でマイクロ流体デバイスを準備し、使用する自由。

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プロトコル

プロトコルは、神経科学者を対象としており、 図2にまとめた。そのためには、商業や機関の施設に委託されたPDMS複製に使用SU-8マスターズの微細加工をお勧めします。 2レイヤーマスクのデザインは、化学のウェブサイト12の王立協会の補足説明（ZIP形式）として自由にご利用いただけます。重要なのは、最初のSU-8層は、2.5〜3.0ミクロンの深さまで製造され、25〜30ミクロンの深さに二する必要があります。これらは、効果的なニューロン整列のために必要な重要な寸法です。 3ミクロンの高さの限界は、二つの区画12との間を搬送または移行されたニューロンを防止することも必要である。

PDMS中の1。マイクロ流体デバイスの複製

  1. 10:1の比率で硬化​​剤（184）で十分にPDMSプレポリマーを混合し、通常、20分間真空デシケーター中での混合物を脱ガス。代わりに、ミックスを入れて50ミリリットルファルコンチューブ内TUREと低gを使用してください 脱気のための遠心分離。
  2. 80℃のホットプレート上で2層の微細構造、SU-8のウエハを配置し、ウエハ上の各デバイスに、ポリマーフレームを合わせます。 ≥5ミリメートルの深さのフレームに、PDMSを注ぎ、> 1時間が終了し、熱硬化性を確保することができます。
  3. 硬化した後は、ホットプレートからウエハを取り外し、平らな面に冷却します。
  4. 優しく賞ウェハからフレームとPDMSをする剛性のメスで（離れて、SU-8の微細構造から）1コーナーから保護メガネと仕事を着用してください。
  5. フレームからPDMSモールドを取り外し、過剰PDMSのデバイスをトリムするはさみを使用しています。 PDMSの薄膜は、ポリマーフレームとウェーハ表面との間に広がるときに、いわゆるフラッシングがしばしば製造される。
  6. 残りPDMSは、ウェハ全体に塗布し、貯蔵中にウェーハを保護するために硬化させることができる。前その後のデバイスの成形にこれを削除し、そうすることで任意のPを削除表面から汚染物質を明確に。

2。デバイスアセンブリおよび相互接続

  1. 直径3mmの生検パンチを使用して6インタフェースポートを準備します。良好な光の条件にして、マイクロ流体チャネルとポートの配置を支援するために上に向けて、微細構造化機能を備えた、暗い表面に取り組んでいます。
  2. 微粒子のための装置を点検してください。可逆粘着テープを使用して、これらを削除します。
  3. マイクロ流体回路は、ガラスカバースリップ上に取り付け薄いPDMS層を使用してカプセル化されている：これらは、可撓性のベース上にPDMS硬化剤混合物（10:1、601）を少量（〜0.5ml）に注ぐことによって調製される、細菌学的グレードのペトリ皿。優しく、PDMS層上にカバースリップを押して数分のためのホットプレートと熱的に治療上の場所。すぐに冷却した後、ペトリ皿からカバーガラス-PDMS重層を切り出して、賞にメスを使用しています。必要に応じて、はさみでトリミング。
  4. プラズマ結合のPDMSデバイスおよび良好なシールを生成するために、支持層：最適な条件は、機器固有のものです。たとえば、40秒間0.2ミリバール、酸素雰囲気中で70 Wおよび40 kHzで動作するプラズマ炉は、優れたPDMS-PDMS結合を生成する。プラズマ処理後は、一緒に両方の部分を押して、完全に結合する分に向けて出発。
  5. ポンプやシリンジとインタフェースするように、シリコンチューブ（3.2ミリメートル外径1.6ミリメートルID）を使用してください。

3。生体材料のパターニングおよびマイクロ流体操作

その場での生体材料のパターニング、ニューロン培養物と流体的処置のためのプロトコルは図2に示されている。

figure-protocol-1
図2図示のマイクロ流体プロトコル。 A）PL と、PLL-G-PEGパターニング ;細胞接着層の添加（ 例えば 、PL、緑）、蒸発水整列マスクB）露出PLの大気空気プラズマ処理を産生有する。 2アンテナ端子はピンクの星を示すプラズマ導入アンテナと、使用されている。吸引によりC）PBS（青）洗浄は、PLでプラズマ処理された地域の汚染を避けるために使用されたPLL-G-PEGの。D）テイクアウト （赤。）による被覆する吸引プラズマ処理された領域がE） セル負荷 ;静油圧駆動流を用いて吸引の両方に隣接する区画へのニューロンの同時マイクロ流体アレイ化、F）メディア（ピンク）灌流G） 絶縁流体トリートメント 。試験剤（黒）の周辺治療を吸引し、吸引によって底部中央入口から配信さH）中央処理により下部に隣接する入口から配信。化学の王立協会の許可を得て複製図と凡例（RSC）12。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

PDMSマイクロ流体チャネルとを接合直後の血漿（5°≤接触角）高親水性である。このような表面は、分化したヒトSH-SY5Yニューロン様細胞のような細胞株の付着及び培養に適している。一次ニューロンなどルンドヒト中脳細胞株（LUHMES）ポリアミンコーティング、ポリリジン（PL）又はポリオルニチン（PO）のいずれかとして神経前駆細胞株の培養物のex vivo培養のために、静電アンカーとして必要とされる。さらに、ラミニンやフィブロネクチンなどの接着タンパク質は、多くの場合、インテグリンのインタフェースコーティングとして必要とされる。しかし、PLと、POコーティングが容易にアレイ·サイトへのマイクロ流体供給を妨げ、また、不要なせん断応力を課し、神経細胞と結合する。この問題を解決するために、チップ内の生体材料パターニングは、トラップサイトと伸長マイクロチャネルでの接着材を定位させることが求​​められる。これはまた、インターコンパートメント接続の開発を促進し、地元の絡み合いを低減します。プロトコルはまた、タンパク質およびニューロンが長い培養中の所望の位置に制限されるように、隣接領域へのPEG材料の添加を含む。以下のプロトコルは、 図3に記載されています：

figure-protocol-2
図3。水は、プラズマステンシルにより生体材料のパターニングのためのマスク。プラズマステンシルのための場所で水メニスカスをピン止めされたPDMSマイクロピラーと水マスク処理のA）のイラスト。垂直面におけるメニスカスの曲率が無視されてきた。b）水マスク赤色染料で可視化し、メニスカスPによって位置決めタンパク質の血漿ステンシル。 日後に画像化されイニング。C）パターン化されたPL-FITCコーティング）付加プラズマパターン化されたPL-FITCコーティングに拒否し、細胞撥PLL-G-PEG-TRITC。これは、SH-SY5Y細胞の登録のために、また、LUHMES細胞のための付加的なフィブロネクチン層をパターニングするために使用した。図や王立化学協会（RSC）の許可を得て複製伝説12。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

  1. プラズマステンシルによるその場生体材料パターニングするための水のマスキング
    1. まもなくプラズマ接合ピペット後下部中央ポートに、PLまたはPO（100μg/ mlで1X PBS）の0.5μlのボリューム。ほんの数秒以内に全体のマイクロ流体回路は、毛管作用により充填する。ポリAに完全に被覆することで数分の親水PDMS表面に向けて出発地雷。
    2. 1分間（ 図2C参照 ）×PBSで吸引駆動の洗浄により未結合のポリアミン分子を除去する。
    3. ポートからすべてのPBSを削除し、顕微鏡で照明することにより、デバイスを加熱する。これは、急速な水マスク形成用のポートからの蒸発が増加します。水マスク（ 図3Aに示され、 図3Bに記載されている）を、約5分以内に確立される。
    4. 水マスキングが完了したことを確認するために顕微鏡によってデバイスを点検します。アレイ部位の上流リザーバ構造は水マスク（〜15分）の安定性を延長するために、マスク設計に含まれることに注意してください。
    5. ポート（ 図2B）にステンレス製のピンを挿入します。これらは、大気圧手持ちコロナ放電又はテスラ発生器によって生成されたプラズマ（2 MHzで動作する、 例えば 、30kVの信号）19,20が空いているマイクロ流体チャネルに結合するために使用される。 Tの先端を指す彼は、1ピンとプラズマの先端に近い筋は≤1秒間マイクロチャネルを扱うプラズマ。プラズマパターニングを観察するために、低光条件を使用してください。
    6. 洗浄工程の水のマスクを削除します。上側の3ポートから並列吸引を使用してください。並列吸引を達成するための吸引ポンプに4ウェイアダプタで接続されたシリコンチューブの4同じ長さを使用してください。吸引を開始し、マイクロ流体回路を介して、PBSを描画するために下の3ポートにPBSを分注する。このように、PDMS -ポリアミン物質のコントラスト（ 図3C参照 ）が生成される。マイクロ流体回路から、PBSを避難し、ネイティブ、疎水性の状態を復元するために数時間を残す。これは、細胞接着にPDMSが完全に非許容にする。
    7. ラミニンやフィブロネクチンなどの追加の接着材料は、場合は、以下のステップが必要であり、すぐに水のマスクを除去した後に実行する必要があります必要になること：ピペットのグラフト共重合ポリ-Lの10μl容量-リジン-ポリ（エチレングリコール）（PBS中のPLL-gの -PEG、100μg/ mlの）両方の底部に隣接するチャネルに、2分間の上側隣接チャンネルから吸引した。
    8. 流れを中断することなく、PBS緩衝液で交換することにより、過剰なPLL-G-PEGを除去。 PEG部分はタンパク質吸着および細胞接着17,21を防止するために作用すると、これは選択的に被覆する、非ポリアミンコーティングされた領域。
    9. その後、ポリ - アミンコーティングと共局在することができるように、ラミニンやフィブロネクチンなどの接着タンパク質：これらのECMタンパク質のピペット10μlの容量（通常は10μg/ ml）を3つのすべての一番下のポートへ。デバイスは、タンパク質溶液を充填し、良好な品質のコーティングを製造するために1時間インキュベートされるまで、トップスリーポートからの吸引物。
    10. 下の3ポートから、PBSを吸引することにより、過剰なタンパク質を除去。
  2. マイクロ流体シングルニューロンアレイ化
    1. appropriとプライムデバイスメディアを食べた。下の3ポートに20μlのボリュームを追加し、上部の3ポートからパラレル吸引により急速にメディアとマイクロ流体回路を埋める。吸引ポンプに等しい長さのシリコンチューブを経由して結合するための4ウェイチューブコネクタ3上部のポートを使用します。
    2. （ 図1の0,1）に隣接する入口ポートの各々に脱凝集し、細胞懸濁液を20μl（1×10 6細胞/ ml）を添加する。
    3. 流量調整と吸引ポンプを装備または上位3ポートからの穏やかな吸引用の注射器を使用しています。完全なニューロンアレイ化は、一般的に1分を必要とします。
    4. その後のマイクロ流体デバイスで配列するためのピペットで4隣接ポートに残っている余分なニューロンを収穫します。
    5. チューブを外します。メディアにすべてのポートを入力し、インキュベーター内のデバイスを配置します。数時間以内に細胞が生体材料のパターンに完全に接着性になる。
  3. ニューロン文化、セレクティブフルイディック治療、および免疫nostaining
    1. （2ミリメートルの柱の高さの差が適切に遅い）静水圧のフィードを使用して定期的に灌流して、メディアを交換します。
    2. 代わりに、標準的な細胞培養と同様に（2-3日）を定期的にメディアを交換し、メディア内のマイクロ流体デバイスを沈める。
    3. 次のように神経細胞培養区画または中央神経突起伸長コンパートメントのいずれかに選択的な流体治療が達成されています。興味のあるチャンネルの一番下のポートに被験物質の20μLを分注して、真上ポートから吸引除去する。長い治療のための流量調節器を使用して流量を減少させ、必要に応じて、被験物質を補充する。
    4. 免疫染色のプロトコルは、各分子標的および関連試薬によって異なります。遅い流速が使用されたニューロンへの剪断誘発損傷の潜在的危険性に対抗するためである。これは通常のプロトコルの時間を延長する、完全にシステムを灌流するために増加、アプリケーションの時代になる。ハイ（2ミリメートル重量例えば ）異なるカラムの高さにポートを使用してdrostatic灌流試薬を送達するために使用した。ポンプを使用して、より迅速な試薬添加および除去は、実験の時間スケールを減少させるために使用することができる。下の3ポートからの試薬を描画するために、上3ポートに吸引ポンプを接続します。

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結果

水マスキングエクスプロイトは、表面張力。気液界面での圧力耐性が[曲率半径に反比例figure-results-1マイクロ流体寸法で非常に安定インターフェイスを生成する。マイクロピラーを効果的な場所に水マスクを固定。水マスク形成は、加熱によって増加率は、マイクロ流体ポートからの蒸発によって駆動される。低倍率（4X - 10X）からの熱を使用して、顕微鏡照明、水マスクは、通常、≤5分で構築した。蒸発は、水マスクの最終的な崩壊をもたらす。 〜15分（血漿ステンシルのための実用的な）と水マスクの寿命を増加させるために、18 nlのリザーバ構造は、培養区画の上流に配置されている。水マスク形成と崩壊の速度を変えることができ、断続的な観測は、プラズマT適した時期を特定することをお勧めしますreatment。それにもかかわらず、複数のデバイスを同時に製造することができる。

プラズマステンシルは、〜1秒を必要とします。長い処理の使用は、ポリアミンコーティングの過...

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ディスカッション

マイクロ流体アレイ化技術は、最小限の文化を確立するための単精度ニューロンの取り扱いが可能になり、その種の最初のものです。マイクロ流体構造を用いて細胞のパターンを揃えるその場生体材料のパターニング方法において 、強力なアプローチと相まって、これらのミニマルな文化が減少した地元の絡み合い高intercompartment接続レベルを有する。これらの特徴は、区画間の伝送の効率的な研究のために使用することができ、シンプルなデザインで修飾が可視化および定量分析のために個々の軸索を単離する可能性を有する。例えば、次世代のトライデント構造がバンドルを形成する複数の軸索の確率を低減するニューロンごとに1つの伸長チャネルに置き換えることができる設計する。これらの機能は大幅に含め、神経科学の様々なアプリケーションに利益をもたらすことができる。ナノ微粒子の毒性24とマンガン伝播25、アクティビティSYNてんかんchronization、このようなプリオン26、アルツハイマー病9におけるアミロイドβ（AB）の送信、およびパーキンソン病

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

著者らは、SEMイメージングのためのSU-8の作製とマリア·ベッカー（ISAS）のためのウルリッヒマルクグラーフ（ISAS）に感謝しています。研究は財政的にドイツ学術振興（DFG WE3737/3-1）、BundesministeriumエリーゼBildungウントForschung助成金（BMBF 0101-31P6541）でかつMinisteriumエリーゼイノベーション、WissenschaftウントForschung DESランデスノルトライン·ウェストファーレンによってサポートされていました。平家Hardelaufおかげインターナショナルライプニッツ研究科「システム生物学ラボオンチップ」の財政支援のために。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PDMS シルガード 184ダウ コーニング
PDMS エラストシル RT 601ワッカー
カバースリップVWR630-1590130-160 mm 厚さ
3 mm 生検パンチ甲斐 医療ハンドル 注意して - 非常に鋭い
タイゴン チューブフィッシャー サイエンティフィックS-50-HL1.65 mm 内径 3.35 mm
1 ml シリンジ (InkjektおよびOmnifix)ブラウン6064204
4ウェイチューブコネクタVWRまたはフィッシャーサイエンティフィック
フローレギュレーターハーバード装置722645
0.5mmピンドレスメイキング部門
PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g [3.5]-PEG(5)ストレージの安定性は問題になる可能性があります
ポリD-リジンSigma-AldrichP6407
Polylysine-FITCSigma-AldrichP3069
PolyornithineSigma-AldrichP4957
フィブロネクチンSigma-AldrichF2006
LamininSigma-AldrichL2020
PBSSigma-AldrichP4417
倒立蛍光顕微鏡
吸引ポンプの例 KNF Neuberger, LaboportN811KVP
ハンドヘルドコロナ排出装置Leybold-Heraeus, USAVP23あなたの国の安全基準に準拠していない可能性があります
フェムトプラズマオーブンDiener 電子
真空デシケーターまたは遠心分離機
外径

参考文献

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