生体材料コーティングのチップ内のプラズマパターニングのための単一ニューロンマイクロ流体アレイ化と水のマスキングのためのプロトコルが記載されている。高度に相互接続された共培養細胞は、最小限の入力を用いて調製することができる。
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この記事について
サマリー
要約
Campenot室のマイクロ流体の実施形態は、神経科学のコミュニティから大きな関心を集めている。これらの相互接続された共培養プラットフォームは、感染および疾患の伝播に発達および機能的神経生物学に及ぶ、様々な問題を調査するために使用することができる。しかし、従来のシステムは、重要な細胞の一次ドーパミン作動性黒質、スパイラル神経節、およびショウジョウバエキイロニューロンなどの少量の細胞を研究するための不適切な入力（コンパートメントごとに何千）、および高スループット実験のための非現実的が必要です。緻密培養物はまた、非常に局所的に二つの文化を相互接続するいくつかの増殖物（<10％）で、交絡している。 （I）、マイクロ流体、単一のニューロンが方法を配列し、プラズマパターニング生体材料コーティングはREGIするための（II）水マスキング法：本論文では簡単なマイクロ流体とパターニングプロトコルはこれらの課題に対処が記載されているSTERニューロンとコンパートメント間の伸長を促進する。最小限のニューロン共培養物は、高レベル（> 85％）intercompartment接続を用いて調製した単一細胞精度の高スループット神経生物学実験のために使用することができる。
概要
神経組織は非常に複雑である。空間的に細胞接触を通じて、特に軸索と樹状突起増生によって定義層や区画内とプラスチックの接続と一緒に注文された異種の細胞の混合物である。新技術は、より深い洞察力や病気、開発、健康的な機能の中心UNRAVELメカニズムを獲得する大きな実験的な自由を与えることが必要である。 Campenot室1,2、最近微細加工の実施例3,4は、選択的に異なる体細胞集団と、それらの神経突起増生を撹乱する能力を備えたネットワーク接続された神経細胞の共培養のex vivo製造に使用することができる。これらのマイクロ流体デバイスは、たとえば、化学、5,6またはレーザー軸索切断6-8、タウオパチー9、ウイルス伝播10,11、および軸索4におけるmRNAの局在後の軸索の変性と再生を研究するために使用されてきた。
ENT」>神経生物学者の範囲を拡大するために、技術開発を最小限の神経細胞の共培養を準備する必要があります。これは、単一の細胞と細胞内の精度でシステムの調査のための神経回路網の解きほぐしを可能にします。最小限の細胞数の要件は、パーキンソン病、耳から螺旋神経節、末梢ニューロンに関連するドーパミン作動性黒質細胞を含む希少細胞タイプを分析し、幹細胞の可能性を開く。これ以外....
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プロトコル
プロトコルは、神経科学者を対象としており、 図2にまとめた。そのためには、商業や機関の施設に委託されたPDMS複製に使用SU-8マスターズの微細加工をお勧めします。 2レイヤーマスクのデザインは、化学のウェブサイト12の王立協会の補足説明（ZIP形式）として自由にご利用いただけます。重要なのは、最初のSU-8層は、2.5〜3.0ミクロンの深さまで製造され、25〜30ミクロンの深さに二する必要があります。これらは、効果的なニューロン整列のために必要な重要な寸法です。 3ミクロンの高さの限界は、二つの区画12との間を搬送または移行されたニューロンを防止することも必要である。
PDMS中の1。マイクロ流体デバイスの複製
- 10:1の比率で硬化剤（184）で十分にPDMSプレポリマーを混合し、通常、20分間真空デシケーター中での混合物を脱ガス。代わりに、ミックスを入れて50ミリリットルファルコンチューブ内TUREと低gを使用してください 脱気のための遠心分離。
- 80℃のホットプレート上で2層の微細構造、SU-8のウエハを配置し、ウエハ上の各デバイスに、ポリマーフレームを合わせます。 ≥5ミリメートルの深さのフレームに、PDMSを注ぎ、> 1時間が終了し、熱硬化性を確保することができます。
- 硬化した後は、ホットプレートからウエハを....
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結果
水マスキングエクスプロイトは、表面張力。気液界面での圧力耐性が[曲率半径に反比例
マイクロ流体寸法で非常に安定インターフェイスを生成する。マイクロピラーを効果的な場所に水マスクを固定。水マスク形成は、加熱によって増加率は、マイクロ流体ポートからの蒸発によって駆動される。低倍率（4X - 10X）からの熱を使用して、顕微鏡照明、水マスクは、通常、≤5分で構築した。蒸発は、水マスクの最終的な崩壊をもたらす。 〜15分（血漿ステンシルのための実用的な）と水マスクの寿命を増加させるために、18 nlのリザーバ構造は、培養区画の上流に配置されている。水マスク形成と崩壊の速度を変えることができ、断続的な観測は、プラズマT適した時期を特定することをお勧めしますreatment。それにもかかわらず、複数のデバイスを同時に製造することができる。
プラズマステンシルは、〜1秒を必要とします。長い処理の使用は、ポリアミンコーティングの過.......
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ディスカッション
マイクロ流体アレイ化技術は、最小限の文化を確立するための単精度ニューロンの取り扱いが可能になり、その種の最初のものです。マイクロ流体構造を用いて細胞のパターンを揃えるその場生体材料のパターニング方法において 、強力なアプローチと相まって、これらのミニマルな文化が減少した地元の絡み合い高intercompartment接続レベルを有する。これらの特徴は、区画間の伝送の効率的な研究のために使用することができ、シンプルなデザインで修飾が可視化および定量分析のために個々の軸索を単離する可能性を有する。例えば、次世代のトライデント構造がバンドルを形成する複数の軸索の確率を低減するニューロンごとに1つの伸長チャネルに置き換えることができる設計する。これらの機能は大幅に含め、神経科学の様々なアプリケーションに利益をもたらすことができる。ナノ微粒子の毒性24とマンガン伝播25、アクティビティSYNてんかんchronization、このようなプリオン26、アルツハイマー病9におけるアミロイドβ（AB）の送信、およびパーキンソン病
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
著者らは、SEMイメージングのためのSU-8の作製とマリア·ベッカー（ISAS）のためのウルリッヒマルクグラーフ（ISAS）に感謝しています。研究は財政的にドイツ学術振興（DFG WE3737/3-1）、BundesministeriumエリーゼBildungウントForschung助成金（BMBF 0101-31P6541）でかつMinisteriumエリーゼイノベーション、WissenschaftウントForschung DESランデスノルトライン·ウェストファーレンによってサポートされていました。平家Hardelaufおかげインターナショナルライプニッツ研究科「システム生物学ラボオンチップ」の財政支援のために。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PDMS シルガード 184 | ダウ コーニング | ||
| PDMS エラストシル RT 601 | ワッカー | ||
| カバースリップ | VWR | 630-1590 | 130-160 mm 厚さ |
| 3 mm 生検パンチ | 甲斐 医療 | ハンドル 注意して - 非常に鋭い | |
| タイゴン チューブ | フィッシャー サイエンティフィック | S-50-HL | 1.65 mm 内径 3.35 mm |
| 1 ml シリンジ (InkjektおよびOmnifix) | ブラウン | 6064204 | |
| 4ウェイチューブコネクタ | VWRまたはフィッシャーサイエンティフィック | ||
| フローレギュレータ | ーハーバード装置 | 722645 | |
| 0.5mmピン | ドレスメイキング部門 | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g [3.5]-PEG(5) | ストレージの安定性は問題になる可能性があります |
| ポリD-リジン | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polylysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| Polyornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| フィブロネクチン | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 倒立蛍光顕微鏡 | |||
| 吸引ポンプ | の例 KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| ハンドヘルドコロナ排出装置 | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | あなたの国の安全基準に準拠していない可能性があります |
| フェムトプラズマオーブン | Diener 電子 | ||
| 真空デシケーターまたは遠心分離機 |
参考文献
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of....
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再版と許可
