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方法論記事

共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定

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DOI:

10.3791/51395

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2014年4月28日

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1Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Biophotonics Core Facility, Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel

この記事について

サマリー

細胞内pHの測定にはいくつかの方法がありますが、細胞質と細胞小器官のpHを同時に測定できる方法はほとんどありません。ここでは、生細胞のレシオメトリックイメージングにより、細胞質と小胞のpHを同時に測定するための迅速かつ正確な方法論について詳しく説明します。

要約

細胞内pHは厳密に制御されており、細胞質と細胞小器官の間のpHの違いが報告されています1。細胞のpHの調節は、タンパク質、DNA、RNAの合成、小胞輸送、細胞増殖、細胞分裂などの生理学的プロセスの恒常性制御にとって非常に重要です。細胞のpH恒常性の変化は、有害な機能変化を引き起こし、さまざまな疾患の進行を促進する可能性があります2。細胞内pHの測定にはさまざまな方法がありますが、細胞質と細胞小器官のpHを同時に測定できる方法はほとんどありません。ここでは、生細胞3の共焦点顕微鏡を用いて細胞質と細胞小器官のpHを同時に測定するための迅速かつ正確な方法について詳しく説明します。この目標は、選択的な細胞コンパートメント分割を持つ2つのpH感知レシオメトリック色素を使用することで達成されます。例えば、SNARF-1は細胞質内で区画化されていますが、HPTSはエンドソーム/リソソーム細胞小器官内で区画化されています。HPTSは細胞質のpH指示薬として一般的に使用されていますが、この色素は、ピノサイトーシス3,4に取り込まれた後、エンドソーム-リソソーム経路に沿った小胞を特異的に標識することができます。これらのpHセンシングプローブを使用して、エンドサイトーシスコンパートメントと細胞質コンパートメント内のpHを同時に測定することができます。HPTSの最適な励起波長はpHによって異なりますが、SNARF-1では最適な発光波長が変動します。SNARF-1およびHPTSをロードした後、細胞を異なるpH較正溶液で培養し、各プローブのpH標準曲線を作成します。共焦点顕微鏡による細胞イメージングにより、アーチファクトやバックグラウンドノイズを除去できます。HPTSのスペクトル特性により、このプローブは、弱酸性のエンドソームコンパートメントの測定や、エンドソーム/リソソームオルガネラのアルカリ化の実証に適しています。この方法は、データ解析を簡素化し、pH測定の精度を向上させ、外部の課題に対する細胞応答中のpH調節に関連する基本的な問題に対処するために使用できます。

プロトコル

携帯pHの校正のためのソリューションの1。準備

  1. キャリブレーションに使用される5溶液を調製するために5つの別々の50mlコニカルチューブに以下の化合物を追加します。
    • 塩化ナトリウム（1MのNaClの1ミリリットル）（1MのNaCl = 10 mlのH 2 O中0.58グラム）
    • 塩化カリウム（1 MのKCl 6.75ミリリットル）（1 M KClを10 mlのH 2 0で0.75グラム=）を
    • グルコース（1 M D-グルコース1mlの（1M）の10ml H 2 O中のD-グルコース= 1.80 g）を
    • 硫酸マグネシウム4（0.05ミリリットルの1M硫酸マグネシウム）（10ミリリットルのH 2 O中の1MのMgSO 4 = 1.20グラム）
    • 20のHEPES（1MのHEPES 1ミリリットル）（1 M HEPES = 10 mlのH 2 O中2.38グラム）
    • 塩化カルシウム（1M CaCl 2を 0.05ミリリットル）（10ミリリットルのH 2 O中の1MのCaCl 2 = 1.47グラム）
      二重蒸留H 2 O（蒸留H 2 O）のすべてのソリューションを準備します。
  2. のddH 2 Oを35ミリリットルで、各ソリューションを完成させ、これまで磁気撹拌機で混ぜるlutionが達成される。
  3. 5.5、6.0、6.5、7.0および7.5のpH値を得るために、1 N KOHまたは1N HClで各溶液のpHを調整する。その後、50ミリリットルの最終容量を脱イオン水で音量を調整します。
  4. 対策5ニゲリシンのmgおよびストック溶液ナイジェリシン10 mMのを準備するために無水エタノールを670μLに追加します。
    注意：ナイジェリシンは非常に毒性であり、細心の注意（手袋、保護メガネとマスク）で処理する必要があります。ナイジェリシンが完全に溶解するまで反転により溶液を混合する。
  5. 各校正液に10 mMのナイジェリシン（最終濃度10μM）の0.05ミリリットルを追加します。ニゲリシンは、細胞膜透過性を増加させ、細胞外K +濃度の脱分極の存在下で、細胞内および細胞外pHの平衡化を引き起こすイオノフォアである。
  6. 較正溶液は、4℃で1ヶ月まで保存することができる

2。細胞の調製

  1. 生物学的な職場の安全の下でyはフード、10％ウシ胎児血清および抗生物質を補充した増殖培地2mlにある35ミリメートル×10mmの培養皿中の種子細胞。 24時間後に約50％コンフルエンスを確実にするために必要な細胞の量を使用する。
    注：我々の実験では、HT-1080細胞株およびプレート培養皿あたり1×10 5個の細胞を使用しています。
  2. キャリブレーションに使用する実験とプレート5追加の培養皿のために必要な培養皿の数を決定します。
  3. 少なくとも24時間、37℃/ 5％CO 2インキュベーターに置き培養皿。

3。のpHセンシングプローブの調製を

  1. のddH 2 0での蛍光pHプローブ8-ヒドロキシピレン-1,3,6トリスルホン酸三ナトリウム塩（HPTS /ピラニン）の1Mストック溶液を準備します。この溶液を室温で保存し、光から保護されなければならない。
  2. 1 mMの5のストック溶液を調製 - （および6） - カルボキシseminaphthorhodafluorアセトキシメチルエステル酢酸（C-SNARF-1 AM; therea呼ばれるFTER SNARF-1）のDMSO 1.76ミリリットルでSNARF-1 1mgを溶解することにより。徹底的に繰り返さピペッティングにより混和する。 SNARF-1溶液は-20℃で保存し、光から保護されなければならない。

4。細胞標識

  1. 16時間生細胞イメージングの前に、完全培地の2ミリリットルを含む各培養皿に1M HPTS原液2μL（最終濃度1 mm）を追加します。
  2. インキュベーターに培養皿を返します。 HPTSプローブは、したがって、ラベルにプローブはピノサイトーシスによって取り込まれなければならない小器官、細胞非透過性である。この条件は、HPTSによる細胞のインキュベーションは、血清添加培地中で行われることを必要とする。
  3. HPTSとのインキュベーション後、滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、少なくとも2時間、無血清培地2mlを加える。 SNARF-1とのインキュベーションは、血清は、プローブの取り込みを防ぐことができるため、無血清培地中で行う必要がある。
  4. AFを得るために、1 mMのSNARF-1のストック溶液10μlを追加inal 510μMの濃度と細胞は薄暗い光の下で、37℃で20分間インキュベートすることができます。 C-SNARF-1濃度およびインキュベーション時間は、細胞型に応じて変化し得る。
  5. インキュベーションの最後に、滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、無血清培地2 mlを加える。

pHの調節因子の5。追加

  1. 方法は、細胞内のpHの変化を検出することができるかどうかを評価するために、細胞内pHを調節する異なる試薬を使用することができる。
    • フィロマイシンA1、V型ATPaseの5の特異的阻害剤
    • + / H +交換アイソフォーム1（NHE-1）6 NA
    • NH 4 Clで、細胞内のpHが7を増加弱塩基
    1. 上記の試薬のストック溶液を準備します。
      • フィロマイシンA1：100μMの原液を得るために、DMSOを160μlにバフィロA1の10μgのを追加
      • EIPA：obtaiメタノールの1.67ミリリットルにEIPA 25mgを追加50 mMの最終濃度はna
      • NH 4 Cl を 1 mMの最終濃度を得るためのddH 2 O 10ml中の塩化アンモニウム0.53gを溶解する。

      注：すべての原液を-20℃で保存し、光から保護しなければならないフィロマイシンA1を除いて4℃に保たれている必要があります。
    2. 後述するように別々の培養皿に、試薬の1つを追加します。
      • 100μMのフィロマイシンA1（最終濃度100 nm）で2μL
      • 50 mMのEIPA（最終濃度25μM）の1μL
      • 1M 塩化アンモニウム（最終濃度20 mM）を40μlの
    3. 37℃で30分間、細胞をインキュベート
  2. 画像取得に進みます。

6。生細胞イメージング顕微鏡の仕様および取り込み設定

  1. 使用して生細胞イメージングを行う40Xの目的は、スペクトル反転走査型共焦点microscoに搭載された電動XYステージ、環境的に制御（温度、湿度、CO 2）ステージインキュベーターでガラス底培養皿を収容するチャンバを備えたPE。
  2. ここで使用した共焦点装置（オリンパスFV1000）が装備されている。
    • ダイオードレーザーは405nm
    • 40 mWのアルゴンレーザー（458 nmの、488 nmの、515 nm）を
    • ヘリウムネオンレーザー（543 nm）と
    • 蛍10X目標、NA0.4
    • LUCPLFLN 40X目標、NA0.60
    • PLAPONSC PLAN APO 60X油目標、NA1.4
    • ダイクロイックミラーDM 405/458/488/543
    • SDM 560およびSDM 640ダイクロイックフィルター
    • BA655-755バリアフィルタ
    • ビームスプリッタBS20/80
    • 画像収集および分析のためのデータ解析ソフトウェア、
  3. ステージのインキュベーターを37℃に温めており、顕微鏡が設定されると、以前に共焦点ステージイメージング室にHPTSとSNARF-1とインキュベートした培養皿を置く。
  4. A関心領域の位置を押え上げは、ソフト取得の設定は、図1を調整する。
    • 2仮想チャネルセットを設定します。
    • 525 nmおよび570での543 nmおよび放射コレクションのSNARF-1の励起 - - 600 nmの505で405 nmおよび放射コレクションでHPTSの励起に対応している第一段階を開始する。
    • 525 nmおよび640で543であり、発光のコレクションのSNARF-1の励起 - - 650 nmの505で458 nmおよび放射コレクションでHPTSの励起に対応している第二段階を開始します。
    • 共焦点開口は、デフォルトでは175程度に設定し、最適な絞り値を手動で300程度に設定される必要がある。
    • 0.4ミクロンの厚さの連続水平光学切片（800×800ピクセル）を積層して画像を撮影。

注：40Xの目的は、同時に複数のセルを観察することが有用であるとオルガネラの閲覧に適しています。しかしながら、空間分解能と信号強度があるベティrは、60X油対物レンズを用いて達成した。さらに、2つの色素の間には励起または発光のクロストークは存在しない。

pHのセンシングプローブの7。校正

  1. キャリブレーションの前に、以前にHPTSとSNARF-1とインキュベートした培養皿から培地を除去し、滅菌PBSで2回洗浄した後、5キャリブレーションソリューションの1の2ミリリットルを追加します。
  2. 共焦点段階室に培養皿を置きます。
  3. 以下の設定に応じてタイムラプス画像取得に進みます。
    1. 実験用の画像や間隔期間の回数を設定します。
      注：私たちは通常、最大30分間の画像間の1分間のインターバルを使用しています。
    2. 各画像の取得との間で閉じるようにシャッターをプログラムします。
  4. 表計算ソフトで分当たりの蛍光強度を記録し、蛍光強度が安定している時間を決定する。 20分 - 細胞内のpHは、15日以降は通常安定している。
  5. REPEATは、残りの各校正液のための新しい培養皿を用いて、7.4に7.1を繰り返します。

8。データ収集

  1. キャリブレーションが行われた後、フィールド当たり15〜20個の細胞を含む4-5ランダムに選択されたフィールドからのサンプルデータを取得する。 2つの画像は、フィールドごとに得られる。HPTS標識（小胞）とSNARF-1ラベル（細胞質ゾル）のための第二のために1。
  2. バックグラウンド蛍光（細胞外領域）をデジタル両方のプローブの蛍光画像から減算される。それぞれの保存された画像からの標識小胞および細胞質ゾルは、バイナリマスクを使用して選択される。各pH感知プローブは、蛍光強度を数値スケール（0-4,095階調スケール）で測定される。細胞小器官または細胞質内のすべてのピクセルの平均強度が計算され、値は、蛍光比を計算するために使用される。

9。データ解析

  1. 様々なソフトウェアパッケージは、データ分析のために市販されている。 すなわちFLUOVIEWソフトウェア。
  2. スプレッドシートでは、レコードの値と次のように蛍光比を計算する：HPTSの場合には、R =（458nmの F / F 405 nm）を、SNARF-1の場合、R =（F 644ナノメートル / F 584 nmの ）。
  3. このようなグラフパッドプリズムなどの科学的なグラフ作成ソフトウェアを使用してデータをプロットします。プロットは、pH（X軸）の関数としての蛍光比（Y-軸）を描くべきである。カーブフィッティングは、非線形回帰を使用して達成される。
  4. ステップ8.2で説明したように、サンプルの蛍光強度を収集し、蛍光比を計算する。 pH値に比率を変換するために較正曲線を使用する。

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結果

細胞内のエンドソーム/リソソーム細胞区画の両方におけるpHの同時測定のために、レシオメトリック蛍光性pH感知プローブSNARF-1及びHPTSを用いた。 HPTSはエンドソーム/リソソーム区画のレシオメトリックpH測定を可能にするのに対し、SNARF-1は、細胞質ゾルコンパートメントに制限されています。 16時間HPTSとセル負荷は、エンドソーム/リソソーム4での選択的局在することができます。 pHが感知プローブを装填HT-1080細胞から記録された蛍光の典型的な例は、 図2Aに示されている。 HPTSはエンドソームやリソソームのコンパートメントの両方を標識することを示す証拠はアレクサ546コンジュゲートトランスフェリン（エンドソーム）または蛍光lysotrophicプローブ（リソトラッカーディープReddye）との共染色により得られた。データは明らかに、HPTSは両区画図2（a）に染色されたことを示した。

上述の方法を用いて、生きた細胞の細胞内pH値を用いて決定した各pH感受性色素のレシオメ...

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ディスカッション

異なる細胞区画の生細胞イメージングで定量的なpH測定を正確に外部の課題に対する細胞応答におけるpH変化を測定するために必要とされる。しかしながら、残る主要なハードルの一つは、簡単かつ具体細胞区画を標的化することである。この点において、いくつかの研究は、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクション8-10によって細胞に導入する細胞内pH指示薬としてのHPTSの使用を強調している。これらの技術は重大な欠点がある、すなわち、エレクトロポレーションは、細胞に広範な被害が発生し、マイクロインジェクションは、特別な装置や技術的なスキルを必要とします。興味深いのは、ヒントンら 、以前にHPTSは、ピノサイトーシスのプロセスによって及びSNARF-1およびHPTSの組み合わせはサイトゾルおよびエンドソーム/リソソーム区画3のpHをモニターするために使用することができることを細胞に取り込まれ得ることを報告している。私たちは、リソソーム/エンドソームcompartm中のpHの変化を記録するために、このプロパティを使用しているライブHT-1080細胞のENT。 HPTSは、蛍光団結合トラン...

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

原稿を批判的に読んでくださったジル・デュピュイ博士に感謝します。

資金調達

この作業は、カナダ衛生研究所、助成金#MOP-126173の支援を受けました。C.M.Dは、Fonds de la Recherche en Santé(FRSQ)が資金提供するCentre de Recherche Clinique Étienne LeBelのメンバーです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
校正
塩化ナトリウムフィッシャーL-11621
塩化カリウムフィッシャーM-12445
D-グルコース (デキストロース)フィッシャーD16-1
硫酸マグネシウムフィッシャーM65-500
HEPESシグマ アルドリッチH3375
塩化カルシウム二水和物ッシャーM-1612
イオン水N / AN / A
NigericinCalbiochem481990吸入または皮膚との接触により有毒
4°Cで光から保護してください。C
培養皿 & 空; 35mmBD Biosciences354456
pH センシング プローブ
8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸 (HPTS)ライフ テクノロジーH-348室温で光から遠ざけてください
5-(および-6)-カルボキシ SNARF®-1、アセトキシメチルエステル、アセテートライフ テクノロジーC-1271-20°Cの光と湿度から遠ざけてください。C
ジメチルスホキシド (DMSO)フィッシャーBP231-1 有害
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 100X
塩化カリウムFischerM-1244520 g
リン酸ナトリウム 一塩基性FischerS369-1115 g
リン酸カリウム 一塩基性J.T Baker3246-0120 g
脱イオン水N/A/A
オートクレーブに持ってきて、pH を 7.4に調整します
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 1X
PBS 100XN/A N/A50 ml
塩化ナトリウムFischerL-1162140.5 g
脱油水N/AN/AL
pH 調節器
Bafilomycin A1Sigma-AldrichB-1793
5-(N-エチル-N-イソプロピル)アミロライド(EIPA)Sigma-AldrichA3085
アンモニウムッシャーA649-500
用溶液フィ脱 N 1 L 5 塩化フィ

参考文献

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