共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定

サマリー

細胞内pHの測定にはいくつかの方法がありますが、細胞質と細胞小器官のpHを同時に測定できる方法はほとんどありません。ここでは、生細胞のレシオメトリックイメージングにより、細胞質と小胞のpHを同時に測定するための迅速かつ正確な方法論について詳しく説明します。

要約

細胞内pHは厳密に制御されており、細胞質と細胞小器官の間のpHの違いが報告され^{ています1。}細胞のpHの調節は、タンパク質、DNA、RNAの合成、小胞輸送、細胞増殖、細胞分裂などの生理学的プロセスの恒常性制御にとって非常に重要です。細胞のpH恒常性の変化は、有害な機能変化を引き起こし、さまざまな疾患の進行を促進する可能性があります²。細胞内pHの測定にはさまざまな方法がありますが、細胞質と細胞小器官のpHを同時に測定できる方法はほとんどありません。ここでは、生細胞³の共焦点顕微鏡を用いて細胞質と細胞小器官のpHを同時に測定するための迅速かつ正確な方法について詳しく説明します。この目標は、選択的な細胞コンパートメント分割を持つ2つのpH感知レシオメトリック色素を使用することで達成されます。例えば、SNARF-1は細胞質内で区画化されていますが、HPTSはエンドソーム/リソソーム細胞小器官内で区画化されています。HPTSは細胞質のpH指示薬として一般的に使用されていますが、この色素は、ピノサイトーシス^3,4に取り込まれた後、エンドソーム-リソソーム経路に沿った小胞を特異的に標識することができます。これらのpHセンシングプローブを使用して、エンドサイトーシスコンパートメントと細胞質コンパートメント内のpHを同時に測定することができます。HPTSの最適な励起波長はpHによって異なりますが、SNARF-1では最適な発光波長が変動します。SNARF-1およびHPTSをロードした後、細胞を異なるpH較正溶液で培養し、各プローブのpH標準曲線を作成します。共焦点顕微鏡による細胞イメージングにより、アーチファクトやバックグラウンドノイズを除去できます。HPTSのスペクトル特性により、このプローブは、弱酸性のエンドソームコンパートメントの測定や、エンドソーム/リソソームオルガネラのアルカリ化の実証に適しています。この方法は、データ解析を簡素化し、pH測定の精度を向上させ、外部の課題に対する細胞応答中のpH調節に関連する基本的な問題に対処するために使用できます。

プロトコル

携帯pHの校正のためのソリューションの1。準備

1. キャリブレーションに使用される5溶液を調製するために5つの別々の50mlコニカルチューブに以下の化合物を追加します。
   • 塩化ナトリウム（1MのNaClの1ミリリットル）（1MのNaCl = 10 mlのH _{2 O}中0.58グラム）
   • 塩化カリウム（1 MのKCl 6.75ミリリットル）（1 M KClを10 mlのH ₂ 0で0.75グラム=）を
   • グルコース（1 M D-グルコース1mlの（1M）の10ml H _{2 O}中のD-グルコース= 1.80 g）を
   • 硫酸マグネシウム_4（0.05ミリリットルの1M硫酸マグネシウム_）（10ミリリットルのH _{2 O}中の1MのMgSO ₄ = 1.20グラム）
   • 20のHEPES（1MのHEPES 1ミリリットル）（1 M HEPES = 10 mlのH _{2 O}中2.38グラム）
   • _塩化カルシウム（1M CaCl _2を 0.05ミリリットル）（10ミリリットルのH _{2 O}中の1MのCaCl ₂ = 1.47グラム）
     二重蒸留H <....

結果

細胞内のエンドソーム/リソソーム細胞区画の両方におけるpHの同時測定のために、レシオメトリック蛍光性pH感知プローブSNARF-1及びHPTSを用いた。 HPTSはエンドソーム/リソソーム区画のレシオメトリックpH測定を可能にするのに対し、SNARF-1は、細胞質ゾルコンパートメントに制限されています。 16時間HPTSとセル負荷は、エンドソーム/リソソーム⁴での選択的局在することができます。 pHが感知プローブを装填HT-1080細胞から記録された蛍光の典型的な例は、 図2Aに示されている。 HPTSはエンドソームやリソソームのコンパートメントの両方を標識することを示す証拠はアレクサ546コンジュゲートトランスフェリン（エンドソーム）または蛍光lysotrophicプローブ（リソトラッカーディープReddye）との共染色により得られた。データは明らかに、HPTSは両区画図2（a）に染色されたことを示した。

上述の方法を用いて、生きた細胞の細胞内pH値を用いて決定した各pH感受性色素のレシオメ.......

ディスカッション

異なる細胞区画の生細胞イメージングで定量的なpH測定を正確に外部の課題に対する細胞応答におけるpH変化を測定するために必要とされる。しかしながら、残る主要なハードルの一つは、簡単かつ具体細胞区画を標的化することである。この点において、いくつかの研究は、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクション^8-10によって細胞に導入する細胞内pH指示薬としてのHPTSの使用を強調している。これらの技術は重大な欠点がある、すなわち、エレクトロポレーションは、細胞に広範な被害が発生し、マイクロインジェクションは、特別な装置や技術的なスキルを必要とします。興味深いのは、ヒントンら 、以前にHPTSは、ピノサイトーシスのプロセスによって及びSNARF-1およびHPTSの組み合わせはサイトゾルおよびエンドソーム/リソソーム区画³のpHをモニターするために使用することができることを細胞に取り込まれ得ることを報告している。私たちは、リソソーム/エンドソームcompartm中のpHの変化を記録するために、このプロパティを使用しているライブHT-1080細胞のENT。 HPTSは、蛍光団結合トラン.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
校正
塩化ナトリウム	フィッシャー	L-11621
塩化カリウム	フィッシャー	M-12445
D-グルコース (デキストロース)	フィッシャー	D16-1
硫酸マグネシウム	フィッシャー	M65-500
HEPES	シグマ アルドリッチ	H3375
塩化カルシウム二水和物	ッシャーM-1612
イオン水	N / A	N / A
Nigericin	Calbiochem	481990	吸入または皮膚との接触により有毒
4°Cで光から保護してください。C
培養皿 & 空; 35mm	BD Biosciences	354456
pH センシング プローブ
8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸 (HPTS)	ライフ テクノロジー	H-348	室温で光から遠ざけてください
5-(および-6)-カルボキシ SNARF®-1、アセトキシメチルエステル、アセテート	ライフ テクノロジー	C-1271	-20°Cの光と湿度から遠ざけてください。C
ジメチルスホキシド (DMSO)	フィッシャー	BP231-1	有害
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 100X
塩化カリウム	Fischer	M-12445	20 g
リン酸ナトリウム 一塩基性	Fischer	S369-1	115 g
リン酸カリウム 一塩基性	J.T Baker	3246-01	20 g
脱イオン水	N/A	/A
オートクレーブに持ってきて、pH を 7.4	に調整します
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 1X
PBS 100X	N/	A N/A	50 ml
塩化ナトリウム	Fischer	L-11621	40.5 g
脱油水	N/A	N/A	L
pH 調節器
Bafilomycin A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-エチル-N-イソプロピル)アミロライド(EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
アンモニウム	ッシャーA649-500

用溶液フィ脱 N 1 L 5 塩化フィ