方法論記事

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

DOI：

10.3791/51396

⸱

2014年10月13日

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, University of California, Los Angeles, 2Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 3Departments of Physiology & Biophysics and Ophthalmology & Visual Sciences, Dalhousie University, 4Departments of Neurobiology and Medicine, Jules Stein Eye Institute, CURE-Digestive Diseases Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

この記事について

サマリー

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免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。

要約

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本論文では、ツール、試薬、およびのために必要とされる実践的な手順を説明します。免疫組織化学のためのホールマウント網膜の1）成功した​​準備をして、網膜内カルシウムシグナル伝達を媒介する電位依存性カルシウムチャネル（VGCC）の研究のための2）カルシウムイメージング神経節細胞。われわれが記述するカルシウムイメージング法は、神経節細胞層内に変位アマクリン細胞の非特異的荷重に関する問題を回避する。

概要

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現在の1,2チャネルCaは全細胞のこれらの成分の薬理学的遮断を介して決定される網膜神経節細胞（RGC）は、L、N - 、P / Q-およびT-型VGCCを発現する。 VGCCは伝達物質放出、遺伝子転写、細胞調節とシナプス可塑性の3,4,5に関与している膜貫通多量体タンパク質である。チャネルの生物物理学的および薬理学的特性を確立するサブユニットを形成する大規模な、膜貫通α1細孔、2δサブユニットと細胞内のβサブユニットα、主に細胞外の補助：機能VGCCsはサブユニットの少なくとも3つの別個のクラスで構成されています。異なるα1サブユニットと、後者の2つのフォームヘテロメリック複合体および原形質膜6へのチャネルのゲーティング動態および人身売買を変える。

ここ数十年にわたり、多くの技術は、タンパク質expreを研究するために使用されてきたそのような免疫組織化学、酵素免疫測定法、ウエスタン分析およびフローサイトメトリーなどのssion、。これらの技術は、関心対象の所与のタンパク質の検出のための特異的抗体の使用を必要とし、異なる組織における特定のタンパク質の局在化および分布のための強力なツールを提供する。抗体が容易でない場合に、in situハイブリダイゼーション 、cDNAマイクロアレイおよびリボヌクレアーゼ保護アッセ....

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プロトコル

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全ての実験は、実験動物のヒューマンケアと使用に関する米国公衆衛生サービス規定とカリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）の動物研究委員会によって発行された実験動物の福祉のためのガイドラインに従って実施した。 3-5週齢の間にオスとメスの成体Sprague-Dawleyラット（チャールズリバー研究所、マサチューセッツ州ウィルミントン）を使用した。

ホールマウント網膜および免疫組織化学プロトコルのための1。動物および組織の準備

  1. 解剖顕微鏡、非常に微細な先端、はさみ、セルロース濾紙、プラスチックピペット顕微鏡スライド2鉗子：以下の材料やツールを準備します。
  2. 深くギロチンで断頭続い1〜3％イソフルランで動物を麻酔によって、閉じたチャンバー内にラットを安楽死させる。細胞外溶液を含むペトリ皿にアイリスハサミと場所一対の目を削除します。 A、エイムズ·ミー休止diumまたは生理的溶液を推奨します。
  3. [フルオ-4でRGCの埋め戻しが必要な場合は、オプションのステップ]。ステップ2.3から2.4に記載されているようにフルオ-4ラベリングを実行します。
  4. 解剖顕微鏡（光強度：1.6×10 8の光子/ mm 2の⋅sec）を使用して、眼球の前部を切断することによって角膜を除去します。ピンセットで内側の網膜表面からレンズおよび硝子を外します。硝子体を除去するには、1の鉗子でしっかりと....

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結果

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特異的抗体を用いて免疫標識は、網膜内の関心のある特定のタンパク質の局在を研究するためのプラットフォームを提供し、カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞とその軸索のカルシウム動態にVGCCsの寄与の研究を可能にする。

選択したRGC 19を標識する神経節細胞タンパク質RBPMS（複数のスプライシングとRNA結合タンパク質）に対する抗体を使用することによって、私たちのFluo-4標識は神経節細胞（ 図1）に制限されていることを示すことができた。この技術から予想され得るような切り株注入は、全ての神経節細胞の標識化にはつながらない。

ウサギポリクローナル抗体は、商業ベンダー（ 表1）により、RBPMSポリペプチド（RBPMS 4-24）、GGKAEKENTPSEANLQEEEVRのN末端 ​​に対して作製された。 RBPMSは、哺乳動物の間で高度に保存され、ポリペプチド配列を使用免疫化のために（NCBIタンパク質銀行、.......

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ディスカッション

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網膜神経節細胞とその軸索のカルシウム動態を解析するために、網膜wholemountsにおける神経節細胞へのFluo-4の局在化、2）カルシウムイメージングを示すために1）免疫組織化学：この記事では、2つの異なる技術を記載している。

wholemountsを用いた免疫組織化学は、げっ歯類網膜20-23におけるタンパク質の局在を明らかにするために使用されてきた。ただし、いくつかの制限があります。染色の質は、そのそれぞれの抗原および関心のある特定の層に網膜組織に浸透する能力を認識する抗体の能力に大きく依存する。これらの問題は、最大7日間、一次抗体でのインキュベーション時間を増大させるのTriton-Xの濃度を増加させ、および/または神経節細胞層を介して抗体の拡散を可能にするためにろ紙ことなく網膜をインキュベートすることによって向上させることができ、光受容体。他の制限はduratiです上および固定の濃度。他の抗体は、短い固定期間を必要としながら、いくつかの抗体は、組織は1時間固定した場合より良い仕事。特定の抗体は、4％PFA固定で最適に動作しながら、同様に、他の人が.......

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開示事項

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著者は全く開示がない。

謝辞

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私たちは、カルシウムイメージングプロトコルへの貢献のために博士S.ステラとヘレンヴォンに感謝します。私たちは、インタビューのシーンを撮影するための博士K.シートに感謝します。私たちは、原稿の彼女のコメントに博士アーリーン平野に感謝します。この研究開発プロジェクトは、遠隔医療·先端技術UCLAの医学デビッドゲフィン学校で著者によって実施され、米国陸軍医学研究および資材コマンド（USAMRMC）により授与され、投与された請負契約により可能になるとW81XWH-10-2-0077：契約番号の下MDフォートデストリックで研究センター（TATRC）、、。これらの研究のためのサポートも、NIH EY04067およびVAメリットレビュー（NB）から来た。 NCBは、VAのキャリア研究員である。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ストレートハサミWPI14124-G解剖ツール
ストレート鉗子WPI501985解剖ツール
湾曲した虹彩はさみWPI504487解剖ツール
セルロース濾紙ミリポアHABP04700
冬眠 AInvitrogenA12475-01media
ベクタシールドベクトルH-1000Mounting Media for Fluorescence
>Fluo-4 pentapotassiumInvitrogenF-14200
IsofluraneAbbott Laboratories05260-05麻酔
顕微鏡スライドFisher Scientific22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal 顕微鏡Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) 対物レンズレンズツァイス
アレクサ フルーア 488 ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L) 抗体分子プローブA-11034二次抗体
RBPMSProSci, Poway, CAウサギ ポリクローナル抗体 RBPMSのN末端に対して生成された ポリペプチド(RBPMS4-24)、GGKAEKENTPSEANLQEEEVR、商業ベンダー(ProSci、Poway、CA)による。

参考文献

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  1. Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
  2. Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ga....

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