方法論記事

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

DOI：

10.3791/51408

⸱

2014年5月29日

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1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

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単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。

要約

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幹細胞集団の不均一性は、異なる系統に向けてその分化の傾向として、幹細胞生物学の詳細な理解を妨げる。単一細胞トランスクリプトーアッセイは、個人差を解剖するための新しいアプローチすることができます。我々は、単一細胞のqRT-PCR法を開発し、この方法は、いくつかの遺伝子発現プロファイルにうまく機能することを確認した。単一細胞レベルでは、OCT4並び順各ヒト胚性幹細胞、:: EGFP陽性細胞は、OCT4高発現であるが、NANOGの発現の異なるレベルを有する。我々の単一細胞の遺伝子発現アッセイは、不均質集団に質問するのに有用であるべきである。

概要

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ほとんどの高等真核生物の個体数は、プールされた人口の分析をこのように不均一であり、それはそれらの細胞の機能を解釈することは困難であることが多い。集団内の個々の細胞は微妙に異なっていてもよく、これらの違いは、全人口1,2の性質及び機能に重要な影響を有することができる。特に、ヒト胚性幹細胞（hESC）は微妙に独特のやり方3、4系統の仕様に多能性と多様な電位の異なるレベルを引き起こす、不均一であることが知られている。例えば、異なる細胞表面抗原は、未分化の多能性幹細胞を分類するために使用することができ、5オースティンスミス基は、それらの形態、分化傾向と経路6シグナルの依存性をもとにして、マウス胚性幹細胞における多能性の異なるレベルを提案した。この現象は、ヒト胚に仮定されたnicの幹細胞を7。全体的な研究は、異なる幹細胞株ではなく、個々の単一の幹細胞の中で行われたのに対し、それは潜在的に全ての体細胞系統に向かって分化能力に影響を与える単一細胞レベルで多能性の異なるレベルを分析することは非常に興味深いかもしれない。

細胞および分子不均一性は、 '単一細胞トランスクリプトーム」と呼ばれる、転写プロファイリングによって決定し、遺伝子発現レベルを8月10日を定量化するための新しいアプローチを強調している可能性があります。個々の細胞における遺伝子発現レベルの分析のために、我々は、単一細胞の定量的RT-PCRの、単純で堅牢なプロトコルを開発した。我々は最小限の技術的変動および相違点で、その結果、各単一細胞溶解物の半分だけでなく、ヒトES細胞の段階希釈した全RNAを比較することによって、我々のプロトコルの有効性と実現可能性を確認した。さらに、我々は均質なPを分離するために遺伝的レポーターラインを使用ジーンターゲッティングシステムを使用してhESCのopulation。 OCT4遺伝子座（OCT4-2A-EGFP-PGK-ピューロ構築物）およびTALENプラスミドの対を標的化するためのドナーベクター11を使用した。ドナーベクターとTALENプラスミドのペアは、私たちのクレオを使用してヒトES細胞（H9、WA09）に導入し、ヒトES細胞のクローン選択プロトコルおよびメンテナンスは私たちの日常的プロトコル12に基づいて実施された。我々は、この遺伝的レポーターラインは、OCT4にOCT4発現のために、EGFPを表現:: EGFPのhESCを確認した。

私たちの結果は（OCT4によって並べ替え:: EGFP強陽性細胞）は、個々のヒトES細胞は、OCT-4の発現レベルが高いが、Nanog発現の異なるレベルを保持することを実証している。したがって、我々の単一細胞の遺伝子発現アッセイは、多能性幹細胞の集団の不均一性を研究するのに有用であるべきである。

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プロトコル

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96ウェルプレートの1の調製

  1. 9μlの単一細胞溶解溶液に単セルDNase1の1μLを混ぜる。
  2. 96ウェルPCRプレートの各ウェルに10μlの混合溶液を入れた。

FACS精製のために2。の切り離したhESC

  1. ヒトESメディアで中和し、37℃で20分間、1ミリリットルをAccutase 60 mmディッシュ、、からOCT4 :: EGFP ES細胞株を取り外します。
  2. FACS緩衝液1ml中に細胞集団を調製し、1×10 6細胞/ mlに細胞を調節する。
  3. 35μmのセルストレーナーキャップチューブを介して細胞試料を渡す。
  4. 細胞選別の前に氷の中にチューブに保管してください。

96ウェルプレートの各ウェルにおけるFACS精製した単一細胞の3。溶解

  1. 訓練されたオペレータとのセルソーターにEGFP陽性細胞のためのサンプルをソートします。 96ウェルPCRプレートの単一のセルLysis/DNase1液に単一のセルを置く。必要に応じて、9サンプル6ウェルプレートは一月未満-80℃の冷凍庫に保存することができる。
  2. 細胞溶解を室温でサンプルを5分間インキュベート。
  3. 溶解反応を停止させる停止溶液1μLを加える。
  4. 室温で2分間インキュベートする。

4。逆転写

  1. 20μMのSMA-T15、SMA-Aの各0.5μlのアリコートに追加します。
  2. 各ウェルに4μL5Xバッファー、2μlのDTT、1μL逆転写酵素、および1μlのdNTPを追加します。
  3. サーマルサイクラーに逆転写を行う。
    1. 90分×42℃の熱プログラムを設定し、85℃×5分で逆転写酵素を不活性化する。

5。増幅

  1. 各逆転写されたサンプルにExoSAP-IT試薬4を添加する。
    1. ExoSAP-IT試薬を不活性化する15分間、15分間および80℃で、37℃でサンプルをインキュベートする。
  2. PCR反応混合物Wを準備するSMA-P2（2 nM）のi番目
  3. 各逆転写されたサンプルにPCR反応混合物10μlを追加します。
  4. 変性の20サイクル（30秒94°C）からなる増幅を行う、アニーリング（30秒、57°C）、及び（10分間68°C）伸長。

6。定量RT-PCR性能

  1. 各ウェルに2倍のSYBR Green PCRマスターミックス、1μLの増幅したcDNA、2 nMのプライマー、および7μlの水を10μlを加える。
    1. ×40サイクル30秒、3秒、95℃に続いて、プログラムを設定し、60℃。
  2. 技術的なエラーのために二重に行う。

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結果

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効率的かつ堅牢な単一細胞RNA増幅

ヒトES細胞の中で転写変動を最小限に抑えるために、我々は、OCT4を使用:: FACS精製用のEGFPのhESCクローン。 SMA-T15（GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT）プライマーを用いてSMA-A（ACATGTATCCGGATGTGGGで固定96ウェルプレートにOCT4 :: EGFP陽性細胞を選別した後、各細胞を溶解緩衝液で溶解し、完全長cDNAにポリ（A）+ RNAに変換）SMARTテンプレートスイッチング技術を用いることによって。過剰オリゴヌクレオチドは、SMA-P2とのcDNAのPCR増幅（GACATGTATCCGGATGT）13の18〜20サイクル行った後、ExoSAP-IT試薬で消化し ​​た。我々は定量RT-PCRの鋳型（ 図1）を作成するために増幅されたcDNAを使用していました。細胞の低量および単細胞3、図14、図15を用い...

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ディスカッション

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単一細胞遺伝子プロファイリングは、単一のセルまたは集団全体の機能性を予測するための主要なツールである可能性があります。技術的な制限により、全遺伝子プロファイリング解析は、人口の平均値に制限されています。個々の細胞亜集団との間の遺伝子発現パターンおよびレベルの変動は、誤った解釈を引き起こすことが提案されている。このような多様な細胞の側面はヒトES細胞で見つけることができますし、その異質性は多分化能と運命特定処理を維持するための微妙に異なる能力を引き起こします。

我々は開発し、個々の細胞における遺伝子発現の研究​​のために、単純でロバストな方法を提供する単一細胞の定量的RT-PCRのための検証。我々のプロトコルを検証するために、FACS精製した単一細胞の溶解物を半分に分け、精度をチェックするためにこの方法を適用した。単セルとの結果が連続的に希釈し、全RNAサンプルで確証された、我々は一貫性のある結果bを発見etween細胞溶解物の各半分（ 図4）。しかし、我々のプロトコルで、いくつかの制限があります。検出できない場合があり、我々は40以上の遺伝子の発現...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

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私たちは、原稿上で貴重な議論のためにイ·ラボのメンバーに感謝したいと思います。李研究室での作業は、細胞研究基金（TEDCO）を幹ニューヨーク幹細胞財団のロバートソン研究者賞からメリーランド州からの補助金によって支えられている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェルPCRプレートUSA scientific1402-8900
Ambion Cell Lysis KitLife Technologies4458235
SMARTScribe 逆転写酵素Clonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq DNAポリメラーゼ High FidelityInvitrogen11304
10 mM dNTP Mix、PCR グレードInvitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS バッファー45 ml PBS、5 ml a-MEM、100 μl DNase、フィルター滅菌済み
35 μm細胞ストレーナーキャップチューブBD Biosciences352235

参考文献

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qRT PCR OCT4 EGFP

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