生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデルインビボ

サマリー

血管新生は、正常組織工学におけるアプローチの鍵となります。したがって、信頼性の高い技術は、組織構築物における血管網の発達を評価するために必要とされる。ここでは、可視化し、 生体内で血管新生を定量化するためのシンプルで費用対効果の高い方法を提示する。

要約

不十分な血管新生は、組織工学構築物の臨床的成功を制限する主な要因の一つであると考えられている。血管新生を改善することを目指す新たな戦略を評価するために、信頼できる方法は、可視バイオ人工足場への新しい血管の内殖を行い、結果を定量する必要がある。過去数年にわたり、私たちのグループは、透視によって血管の直接可視化を可能にし、デジタルセグメンテーションを通じて定量化する可能性を提供する、完全な皮膚欠損モデルを導入しています。このモデルでは、人は外科的にマウスの背中に完全な皮膚欠損を作成し、テスト材料に置き換えます。目的の分子または細胞は、それらの潜在的効果を研究するために、そのような材料に組み込むことができる。自分の選択した観測時間の後、材料は、評価のために外植される。両側性の創傷は、目の内部の比較を行う可能性を提供するでの学習に必要な動物の数を減少させるだけでなく、個人間で成果物を最小限に抑えます。他のアプローチと比較して、私たちの方法は、簡単で信頼性が高く、費用対効果の分析を提供しています。私たちは、別の生体材料、バイオ活性化のアプローチの血管新生をテストする際に、高解像度のスクリーニングを行うためのルーチンツールとしてこのモデルを実装している。

概要

ここ数十年では、組織工学は、体自身の細胞¹を組織欠損に代わる新たな治療オプションを開いた。組織再生の生理学的プロセスをサポートするために、足場を創傷床からの細胞が成長し、欠陥^2,3を復元することができるシナリオを提供し、生分解性構造として設計されている。

不十分な血管新生は、バイオ人工足場⁴の臨床的ブレークスルーをバック保持している主な障害であると考えられている。細胞の内方成長で、栄養と酸素が増加し、材料の血管新生の需要が不可欠となる。不十分な血管新生または遅延は、したがって、組織工学製品⁵の中心壊死につながることができます。また、血管が免疫コンピテント細胞を提供し、再生領域における代謝残留物を除去する。高い感染率と低い再生は唯一である足場^6,7の血管新生を増加させることによって回避することを目的としている組織工学において観察不十分な血液灌流の結果の一部。

生体材料自体と足場の微細構造の重要な役割に血管新生のフォーカスを改善することを目指していくつかの戦略。 ^8,9を復元することにより（再）、 再生に修理から治癒過程をシフトに最も近い生理学的特性を有する組織を生成する際に新たなアプローチを開発するための集中的な研究努力がある。その再生能力に関しては研究し、評価した生体材料は、コラーゲン、フィブリン、キトサンおよびアルギン酸^10,11が含まれていた。これらの生体材料は、組織の脱細胞化、自己集合、ラピッドプロトタイピングやエレクトロ¹²のような異なる戦略を用いて新たな足場を構築するための骨格として使用され、組み合わせることができる。 ENHするためにボディの自身の再生能力をANCE、足場は、生物活性化することができます。組換え血管新生増殖の組み込みは、足場の血管新生を改善することが示されている¹⁴のような因子のために¹³または遺伝子をコードするベクター因子。幹細胞の使用は、広く間葉ストローマ細胞および内皮前駆細胞が、最も注目^を集めている^15,16血管新生を改善するための有望な戦略であることが示されている。他のアプローチは、移植前¹⁷にプレハブ血管網が含まれている構造物を構築しようとします。足場の設計とその生物活性化に集中的な取り組みにもかかわらず、戦略は、臨床的に有意なレベルでの血管新生を改善していないと、大規模な火傷での皮膚代替物を除いて、臨床ルーチンへの生体工学材料の翻訳はためらいがちに^18を行われている。

理由の一つなぜ血管新生人工組織構造物を依然として未解決の問題であり、in vivoでのアプローチにおける新技術の成功を評価することが困難である。 インビトロ実験は、足場の血管新生の可能性の重要な洞察を提供し、適切な動物モデルは、このような材料の生体適合性などの重要なパラメータを研究するために必要とされる、治療の安全性および有効性と、特に重要な、組織の血管新生ができるが構築する。したがって、in vivoでの血管ネットワークを視覚化し、定量するための信頼性の高いツールが不可欠である。

本研究では、外植足場内部の血管網の可視化および定量化を可能にする、シンプルで信頼性の高い方法を提示する。この方法は、組織の透視やデジタルセグメンテーションに基づいています。この方法は非侵襲的であるため、ターゲット材料のさらなる分子および組織学的分析を可能にする。

プロトコル

足場の調製

1. 12ミリメートル生検パンチを使用して、足場のサンプルを生成します。
2. 足場内に生物活性分子または細胞を導入するために、穏やかに滅菌ガーゼでそれらを絞ることによって足場をドレイン。次いで、目的の生物活性分子または細胞を含む溶液の160μLを加えることによって足場を再水和する。そのようなMTTアッセイなどの代謝アッセイを通して細胞と生物活性化の成功をダブルチェックしてください。
3. 必要に応じて、ステップ1.2で説明したように、再び再水和を介して、フィブリン - トロンビン溶液またはヒドロゲル中に、例えば、それらを提供することにより、足場の内部でテストすべき化合物または細胞を固定。
   注記：化合物または細胞が機械的に材料に付着していない場合、このステップでは、便利であることができる。一つは、また、化合物の放出動態を制御することができます..
4. カット時によって、全ての実験および対照群ではそれぞれの足場の下に置かれるチタン化メッシュを、準備しますgのうち円形の小片、直径約14ミリメートル。
   注：チタン化メッシュが創傷床から再生された組織を区切るために必要な物理的境界として機能します。

2。動物

1. 提示されたモデルの実装に先立ち、対応する動物保護法を参照し、地元当局からの許可を得る。本研究では、すべての実験は、現在のドイツの動物福祉の行為に応じて、マウスを用いて行ったし、オーバーバイエルン（RegierungフォンOberbayern）特別区政府によって承認されました。
2. 動物や歪みを慎重に選択します。モデルはマウスで確立されたが、それは、ラット、ウサギまたはブタのような他の一般的な動物に変換することができる。
3. あなたは毛皮動物で作業している場合には、足場の移植前の動物の背中を剃る。
   注：この作品は20グラムと25グラム、しかし異なる年齢とbの間の体重の生後6〜8週のマウスを使用していますODY重みを使用することもできる。

3麻酔

1. 無菌条件下で動作を行う。動物の正常な体温を維持するために、加温マットを使用する。
2. 以前は吸入麻酔動物は0.05〜0.1ミリグラム/ kg体重、皮下8時間毎の用量でBuprenorphinを受ける。
3. 吸入麻酔（イソフルラン）の下で動物を置きまたは同等の標準的な手順を適用します。優しく動物のつま先を絞ることによって、または皮膚ピンチのいずれかを介して麻酔を確認してください。
4. exsiccosisを防止するために、0.5ミリリットルの動作の開始時に生理的食塩水を皮下注射する。

スキンの4切除

1. 腹臥位で動物を置き、先端の細いパーマネントペン（ 図1A）、マウスの背中の正中線をマーク。
2. 切除範囲を定義します。 ふぃぎゅに示す領域内の欠陥を置きます1Cを再び。欠陥があまりにも尾側に配置された場合、動物はドレッシングや足場を除去する傾向であることに注意してください。
3. の10mm生検パンチ（ 図1B）を使用してバイラテラル欠陥の周りを作成する。パンチを慎重に皮膚に押し付けされるべきであり、皮膚を通って完全に切断するのに使用してはなりませんが、切除領域（ 図1C＆1E）を描写する。
4. 静かにピンセットでマークされた肌を持ち上げ、微細手術用ハサミ（ 図1F）を使用してマークされた円に沿って切開する。出血の場合には、慎重に、滅菌ガーゼで圧迫する。切除のステップバイステップの説明は、 図1に示されている。
   注：欠陥が肌の弾力性に起因する欠陥の拡大を補償するために、足場を生成するための1より小さくパンチを使用して作成されます。

5。足場移植

1. ティタのためのスペースを作るためにデバイスをメッシュ2-4ミリ（ 図2A）のための創傷境界で、皮膚とその下の組織の分離を拡張します。
2. 創傷床の上に直接欠損部にメッシュをチタン化し、傷のエッジ（ 図2AおよびB）の下に置きます。
3. メッシュの上に直接足場を置きます。
4. 足場（ 図2C）にわたって少しの縁を残して、4〜6つの結び目を、隣接する巻回エッジに足場を縫合する。
   注：生分解性縫合糸の使用は避けてください。
5. 創傷領域（ 図2D）の監視を可能にしながら足場を保護するために、欠陥の上にドレッシング透明傷口を縫合。

6。術後ケア

1. ドレッシングや足場の相互操作を回避するために、ケージごとに1つのマウスを保管してください。
2. 運動活動、体重、苦痛の徴候、許容範囲を観察することによって、日常的に動物の一般的な状態を評価するドレッシングと自動傷に。また、出血、感染症の局所および全身兆候およびドレッシングの位置のための創傷領域を監視します。
3. 動物の苦痛を最小限にするために、0.05〜0.1ミリグラム/ kg体重または同等の鎮痛薬の用量で毎日Buprenorphinを注入する。
4. マウスは創傷被覆材を除去または損害賠償場合は、麻酔下でそれを交換するか、再接続します。

足場の7。安楽死や植

1. 希望の時点で、ペントバルビタール（150mgの/ kg）を過剰投与により動物を生け贄に捧げる。
2. 足場および可能性（ 図3A）、バック、マウスの皮膚の多くを含むべきである油性マジック、と皮膚切除のサイトをマークします。
3. ハサミやメスでマークされた線に沿って皮膚を切開。下にある組織から鈍準備（FIを通じて、足場およびチタン化メッシュを含む全体の肌を、デタッチグレ3B）。
4. ペトリ皿に伸ばし移植組織を置きます（ 図3CおよびD）

血管網の8。可視化と定量化

1. 徹照：
   1. 白色光（100ワット、標準の電球）の強力なソースの上にシャーレを搭載することにより、透視デバイスをセットアップします。
   2. デジタル画像を得るために、イルミネーターの上にデジタルカメラを固定します。
   3. 逆さまに透視デバイス上のペトリ皿上のサンプルを置きます。
   4. マクロモードでの完全な足場の写真を撮るだけでなく、正常な皮膚の等しいサイズの領域。さらにデジタル解析用のTIFF形式で画像を保存してください。
   5. さらに生化学的または組織学的分析のために組織を保存します。
2. デジタルセグメンテーションおよび定量：
   1. FRを求めることができるVesSeg-Toolソフトウェアを、ダウンロードしてインストールします：における電荷のee http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 。
   2. VesSeg-Toolソフトウェアで画像を開きます。
   3. デジタル解析（画像→選択）のための足場で覆われた画像の領域を選択します。
   4. オプション「ヒステリシスしきい値」（計算血管強化→トップハット変換→画像→血管強調フィルタ→ヒステリシス閾値処理）を使用して血管のコントラストを増やします。
   5. 血管マップ（画像→血管強調フィルタ→ヒステリシス閾値化→しきい値の境界線）のセグメント化を進めます。でも、リモートで血管様であるすべてのピクセルなので、第一の閾値（「船舶保険」）を選択して、容器とラベルされます。第二の閾値（「背景カバレッジを」）を選択したので、特に血管様であるピクセルのみが容器としてラベル付けされます。
   6. 非捕捉血管を追加するために、通常はそのような毛や縫合糸など細長い、血管様構造体である一般的な偽陽性構造を排除するために手動で自動分割案を確認してください。
   7. 血管の長さと血管（バイナリ画像統計→画像→画像の統計量）でカバー全体の面積を計算します。
      注：血管の長さを計算するために、結果として得られる血管マップ内の血管が1画素²⁰の幅でラインに間引く。
3. 天然組織に100％の値を割り当てる、足場と同じパラメータの下でネイティブ皮膚領域を分析し、その値に足場を関連付ける。白画素の割合が、正常組織では60％と足場30％である場合、例えば、それは足場の50％の血管新生を表す。注：白い船カバレッジが足場の周りの正方形の面積に割り当てられている。白画素カバレッジconsiの数を調整円の面積は、正方形（4×R ^2）よりも有意に小さい（πさ×R ^2）であることをダリング。

結果

信頼性のある国間の完全な皮膚欠陥、皮膚は、研究中の生体材料（ 図2）で置き換えることができるマウス（ 図1）で作成することができる。ここでは、大きな合併症は、感染や異物反応の巨視的兆候もないが、手術手順の間または後に観察されない。マウスはそれを削除する際にまれに、足場は失われます。創傷収縮は、（ 図3）が観察されなかった。組織透視は、天然の組織と移植された足場（ 図4）の両方を含め全組織サンプルにおいて、幅が最大で30μmの血管構造の明確な可視化を可能にした。デジタルセグメンテーションの後、船は簡単に移植後希望の時間に定量することができた。例えば、2週間、移植後、62.28±8.6％の血管新生レベルが観察された（平均値の平均値±標準誤差であり、n = ^8）21。全体として、約25分＆＃160;動物あたり（2足場）を移植のために必要とされる、組織の収穫と描いて一つのサンプルのデジタル解析のために10分間、5分。最後の点として、この方法は、さらなる分析のために外植された組織の品質に影響...

ディスカッション

生体材料内の血管新生の過程を研究するための新しい信頼性の高い方法の開発が求められて組織工学構築物中の血液灌流を改善するのに成功したアプローチを確立する必要がある。 ex vivoで可視の足場血管新生を製造するための一般的な方法は、高解像度のツールを提供する顕微鏡の使用を含む。ほとんどの場合、しかし、この方法は、小さな組織領域の分析に制限され、高価で時間がかかる傾向がある。また、多くの場合、血液灌流血管が非機能的なもの²²と区別できない精巧な標識および染色の方法を含んでいる。血管の機能性を評価するために使用されている方法は、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング及び陽電子電子トモグラフィである。これらの方法は、非常に高価な装置および低分解能²³の欠点を有する。血管新生を可視化するための別の一般的に使用される戦略である組織²⁴の化学的腐食に続いて血管キャストを使用すること。この方法は、血管網の代表的な三次元構造を得ることを可能にするが、結果は、人工灌流および組織のレベルに応じてそのようなタンパク質またはRNA分析などのさらなる生化学的研究のために使用する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
デジタルカメラ	リコー、ハノーバー、ドイツ	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	滅菌ガーゼ (10 cm x 10 cm)
二層コラーゲンベースの足場 (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
イソフルラン、吸入麻酔用液体ガス	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nu Mic マウス, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	株コード 088	Athymic ヌードマウス、6 から 8 週齢、体重 20 から 25 g
ブプレノルフィン(0.3 mg / ml)	Essex Pharma GmbH、ミュンヘン、ドイツ
チタンメッシュ(15 cm x 15 cm)、エクストラライト	PFM Medical AG、Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißドイツ、ハイム	B1332020110614	フィブリン-トロンビン溶液
透明粘着剤ドレープ(30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10