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方法論記事

代謝産物の調査のためのMALDI-質量分析イメージング

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DOI:

10.3791/51434

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2014年3月5日

 , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin- Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin- Madison

この記事について

サマリー

質量分析イメージング（MSI）は、生物学的プロセスに新たな洞察を提供することができ、ネイティブ環境で化合物を保持し、無傷の組織内の様々な化学種を発見し、識別するために使用することができる強力なツールです。本明細小分子の分析のために開発MSI方法が記載されている。

要約

そのような医薬品または内因性代謝産物などの小分子を研究する潜在的に1検討されて代謝経路の変化を引き起こす可能性が目的の組織の均質化を必要とする組織抽出物を使用するために使用される大部分の技術を含む。質量分析イメージング（MSI）は、生物学的組織サンプル1-5の完全なスライス内の分析物の空間的な情報を提供することができる強力な分析ツールです。この技術は、タンパク質、ペプチド、脂質、および内因性代謝産物などの小分子を含む様々なタイプの化合物を研究するために広く使用されている。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）-MSIでは、複数の代謝物質の空間分布を同時に検出することができる。ここでは、マメ科植物の根と根粒に非標的メタボロミクスのMSI実験を行うために特別に開発された方法が行われている生物学的プロセスへの洞察を明らかにする可能性が提示されている。ザ·ここに提示した方法は、サンプル調製からの画像取得のために、典型的なMSIワークフローを示し、および小分子を検出するために有用であるいくつかのマトリックス適用技術を実証行列適用工程に焦点を当てている。 MS画像が生成されると、関心のある代謝物の分析および同定は議論され示されている。ここに提示標準ワークフローを容易に異なる組織型、分子種、および計測のために修飾することができる。

概要

メタボロミクスの成長分野は、バイオマーカーの発見、植物や他の生物系における代謝経路を解読、および毒性プロファイリング4,6-10を含む多くの重要な生物学的なアプリケーションを持っています。生物学的システムを研究の主要な技術的な課題は、彼らに11を中断することなく、メタボローム経路を研究することです。 MALDI-MSIは、単一臓器12,13、さらには単一細胞14,15中の分析物の高感度検出を可能にし、無傷の組織の直接的な分析を可能にする。

試料調製は、再現可能かつ信頼性の高い質量スペクトル画像を生成する上で重要なステップである。画像の品質が大きく、組織包埋媒体、スライス厚、MALDIマトリックス、およびマトリックス適用技術などの要因に依存する。撮像用途のために、理想的な断面の厚さは一つのセル（試料の種類に応じて8〜20ミクロン）の幅である。 MALDIは、有機、クリスタリンの堆積を必要とする検体アブレーションおよびイオン化を支援するために、試料上の電子のマトリックス化合物、典型的には、弱酸、16の異なる行列が異なる信号強度、干渉イオン、および化合物の異なるクラスのイオン化効率を提供する。

行列適用技術は、質量分光画像の品質の役割を果たし、異なる技術が、分析物の異なるクラスに適している。三つの行列の適用方法は、このプロトコルで提示されています。エアブラシ、自動噴霧器、および昇華。エアブラシマトリックスアプリケーションが広くMALDIイメージングに使用されている。エアブラシ行列適用の利点は、比較的迅速かつ簡単であることである。しかし、エアブラシマトリックスアプリケーションの品質が大幅にユーザの技量に依存し、以下で再現可能と分析物の拡散、特に小分子17が発生しやすい。自動噴霧器システムは、マトリックス·アプリケーションをエアブラシと同様の機構を有するが、HAVEスプレーがより再現することは、マニュアルエアブラシアプリケーションで見られる多様性を除去するために開発されて。このメソッドは、時々、より時間のかかる伝統的なエアブラシ行列アプリケーションよりもすることができます。手動エアブラシと自動噴霧器システムの両方が溶剤系マトリックス適用方法である。昇華は、分析物の拡散を減少させるので、代謝物および小分子の質量スペクトルイメージングのためにますます人気になっている乾燥マトリックス適用技術であるが、より高い質量の化合物18を抽出して観察するために必要な溶媒を欠く。

代謝物の確実なIDは、一般的に、タンデム質量MS / MSスペクトルを基準に、文学、または理論スペクトルと比較されると検証のための（MS / MS）実験、続く推定される識別を得るために、正確な質量測定を必要とします。このプロトコル高分解能（M / Z 400で60,000の質量分解能）、液体クロマトグラフィー（中LC）-MSがウマゴヤシは 、生物学的システムとして根や根粒をtruncatula使用して、空間情報と内因性代謝物の自信を持って識別の両方を取得するために、MALDI-MSIに結合されている。 MS / MS実験はMALDI-MSIまたはLC-MSで組織抽出物に対して組織上で直接実行し、代謝産物の同定の検証のために使用することができる。

このプロトコルは、Mの内因性代謝物をマッピングするための簡単な方法を提供し、適合され、種々の組織タイプおよび生物系における小分子のMSIに適用することができるtruncatula、。

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プロトコル

1。計装

  1. MALDI-TOF/TOF MSI。 （材料/機器の表を参照）の小分子の分析のためのMALDI源を備えた質量分析装置を使用してください。目的の分析に応じて、正または負イオンモードでの買収を実行します。関心の質量範囲を指定し、イオン画像を生成するために、サンプルの表面を横切って、XとYの両方の次元が50μm間隔で500レーザーショット/スポットを集める。レーザーショットのラスタ幅及び数は、それぞれ、より高い空間分解能と最大信号強度を得るために調整することができる。 DHBマトリックスピークまたは質量スペクトルを校正するためにスライドに直接組織に適用される内部標準を使用してください。
  2. 高分解能LC-MS。 HILICカラムは目的の分析に依存して、C-18列、または順相（NP）のいずれかで逆相（RP）LCを用いたLC-MSで実行サンプル抽出物（材料/機器の表を参照）。移動相を使用し、特定のサンプルの種類に応じてグラデーション。試料の種類に応じて正又は負イオンモードでの取得を行う。

2。組織標本

  1. 結節に付着し、ルート3-4ミリメートル残して、植物からの根粒をトリミング。
  2. すぐに解剖した後、クライオスタットカップに組織を配置し、ゼラチン（脱イオン水に100ミリグラム/ ml）でカバーするために鉗子を使用しています。組織が無気泡とのカップの底に貼付されることが不可欠である。
  3. フラッシュは、ゼラチンが硬化するまで、ドライアイス/エタノール浴中にカップを置くことによって、組織を凍結して不透明になる。使用するまで-80℃で保存したサンプル。
  4. からサンプルを削除する-80℃の冷凍庫°、プラスチッククライオスタットカップを切り取ると過剰ゼラチンを切り落とす。 10月には組織に触れさせるものではないが、最適な切削温度（10月）のメディアのダイムサイズの量のクライオスタットチャックに包埋組織をマウントします。クライオスタット内の場所10月が凝固するまで、ボックス。
  5. チャックとゼラチンは、約15分間（-20または-25℃に設定）クライオスタットボックスに平衡化させる。
  6. バック（非ITOを暖めることによりITO被覆ガラス上に各スライスをマウントクライオスタット（材料/機器の表を参照）節組織に約1セルの厚さ（8月20日であって、組織のタイプに応じて）と解凍を使用あなたの手の背面のITO被覆スライドガラスの側）をコーティングした。凍結組織切片に近い温めスライドのITO被覆側を置き、スライスがスライド上に固執することができます。スライドに接近してセクションを配置すると、MSIの中に、より良い位置合わせを提供します。

3。行列アプリケーション

  1. MALDIマトリックスのエアブラシ応用
    1. すべてエアブラシ手順は、ドラフト内で実施されるべきである。
    2. メタノールで十分（材料/機器の表を参照）エアブラシ液容器とノズルをきれいにし、DHBマトリックス溶液（50％methanol/0.1％のTFA V中の150 mg / mlの/ v）の溶液で容器を充填する。
    3. 約35センチメートルサンプルからエアブラシを持って、10秒スプレーの持続時間と、各コートの間に30秒の乾燥時間をスライドの表面に、マトリックスの10から15のコートを適用します。
    4. マトリックス溶液から目詰まりを避けるために終了したら、メタノールで十分に再びエアブラシを清掃してください。
  2. MALDIマトリックスの自動スプレー応用
    1. 自動噴霧器システムの製造業者が提供するスタートアップの指示に従ってください。
    2. 40ミリグラム/ mlで用いた根粒における代謝産物のMSIのためのマトリックスとしてDHB（50％methanol/0.1％TFA体積/体積）には、約80°C、1250ミリメートル/分の速度で、50流量、温度を設定するμL/分、および24へのパスの数。最高のカバレッジのためには、ノズルを90°回転させ、および/または、各パスの間にノズル1.5ミリメートルを相殺することをお勧めします。スプレー法を開始します。
      Siなどデなお、ここで使用される特定の噴霧器システムは、溶媒の速い蒸発するためのノズルを加熱する。溶媒が蒸発するように、マトリックスの濃度が速やかに増加する。エアブラシと自動噴霧器を試料に印加する行列は、同程度の濃度を有する。
    3. 自動噴霧器システムの製造業者が提供するシャットダウンの指示に従ってください。
  3. MALDIマトリックスの昇華応用
    1. （材料/機器の表を参照）を昇華室の底部に300ミリグラムDHBを量る。
    2. 組織切片は、両面に、導電性テープで下に向けてコールドフィンガー（昇華室の上部）に、スライドガラスを貼り付けます。でも、マトリックス沈着を生成しても導電性のための両面テープとスライドの裏面全体をカバーしています。
    3. Cクランプと一緒に昇華室の上半分と下半分をクランプ。真空や広告を接続するトップリザーバにD氷や冷たい水。
    4. 室温の加熱マントルに昇華室を配置します。
    5. 真空ポンプの電源をオンにします。 15分待ってから、加熱マントルをオンにします。加熱マントルを10分間かけて120℃に到達する必要があります。
    6. 10分後、熱、真空に近いバルブ（SO室内を真空下に残っている）を無効にし、真空ポンプをオフにしてください。
    7. 室は、室温に真空圧を解放バルブを開放し、試料を除去することができます。昇華室の大きさは、スライドガラスに昇華マトリックスの量を決定します。小さな室（150 mlビーカーのサイズ）DHB約100mgを使用し、スライドガラスを切断する必要とする一方、より大きな昇華チャンバ（400ミリリットルのビーカーのサイズ）DHB約300mgのを使用することにより、itチャンバー内に収まります。

4。画像収集

    <李>マーク」教示点」として使用するWiteOut修正液ペンでサンプルの各角に+パターン。 MALDIスライドアダプタプレートにスライドガラスを置き、スキャナを用いて、試料の光学像を取る。
  1. 50μmのラスタ化ステップサイズと等しいかまたはラスター化ステップサイズより小さいレーザ径測定器会社が提供するソフトウェアを用いて画像取得ファイルを設定する。この特定の楽器で、最小のレーザーの設定は、40〜50ミクロンの直径が約10μmと小さなレーザー設定のレーザー径を与えます。
  2. ソフトウェアに光学像をロードし、光学像でプレ​​ートを揃える。
  3. 一般的なマトリックスクラスターイオン、内部標準、または較正ミックスを使用して取得を開始する前に、測定器を校正します。
  4. 「ブランク」として使用されるスライド上の純粋なマトリックスのスポットを含むMSIを用いて分析されるべき組織の領域を、指定する。
  5. ACを開始アクイジション·。

5。画像生成

  1. ベンダーが提供する市販のソフトウェアで画像ファイルを開き、イオン画像を抽出。他のオープンソースソフトウェアは、MSIデータ処理19で利用可能です。

6。代謝物の同定

  1. ベンダー固有のソフトウェアを使用して、質量スペクトルから関心のある特定のm / zを （材料/機器の表を参照）を選択します。分析物ピークがマススペクトルおよびイオン画像から選択された場合、分析物が生成される具体的な組織部に局在化マトリックスイオンと区別することができる。
  2. 目的の分析のリストを生成し、MS / MS実験を行う。分析物のサンプルリストのための代表的な結果に、表1と表2を参照してください。
  3. （利用可能な場合や、高解像度のMALDI-MS）正確に得るために高分解能質量分析計で標的LC-MS解析を行うまた、大容量の関心の分析物の測定と特性断片化パターンを得るために、標的分析物のLC-MS/MSを行う。
  4. ターゲット分析物の推定識別を決定するために、データベース検索を実行します。代謝物データベースの例としては、METLIN、ChemSpider、PubChem、KEGG、およびHMDBを。
  5. 精密質量データベース検索から推定される識別を確認するために、標準、文学、および/または断片化予測ソフトウェアのMS / MSスペクトルをターゲット分析物からのMS / MSと一致しています。

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結果

MSIの実験の概要を図1に示す。実験の最初に、サンプル調製は重要な工程である。結節は、植物の根からトリミングし、ゼラチン中に埋設されている。それが凍結されている間組織は、無気泡、クライオスタットカップに対して平らにプレスされている必要があり、それが区分されている間、これは組織のより容易かつ適切な整合性を確保します。組織はスライスされている場合には、適切な厚さで組織を切断することが重要である。切片の薄すぎ切片の厚すぎる組織から抽出され、検出された検体の数を減少する一方、組織の完全性を台無しに、裂ける。マトリックスおよび適用技術の選択は、検出された検体の種類を決定する。行列の組み合わせを使用すると、相補的な結果を提供することができる。三つの行列適用技術はこの研究で提示されている。エアブラシ技術は高速で、そうである低分子のMSIのために典型的には適切ではありません分析対象物の拡散の原因。自動噴霧器システムおよび昇華がより小さなマトリックス結晶、より良好な再現性、少ない検体の拡散を提供する。2 ウマゴヤシtruncatula根粒部の光学像を示...

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ディスカッション

上述のように、試料調製は、MSIのワークフローの中で最も重要な工程である。不均一な組織を埋め込むと、いくつかのケースでは困難または不可能であることが切片なります。セクションのサイズ及び適切な平衡時間は、組織の完全性を維持し、折り畳みおよび涙を避けるために重要である。マトリックスおよび適用技術の選択は、検出されるべき分析対象物の種類を決定する役割、空間分解能、及び結果の再現性を再生する。マトリックスまたは塗布技術の組み合わせを使用すると、相補的な結果を提供することができる。

このメソッドは、Mの内因性代謝物の非標的MSIのために特別に設計されましたtruncatula根粒組織が ​​、容易に他の組織型および生物学的質問に適合させることができる。小分子MSIのための推奨行列適用方法は昇華し、自動噴霧器である。 TISSU上に堆積された溶媒の量を増加させる一つは、脂質、ペプチドなどのMSIを実行するように選択する必要があり、eは、自動噴霧器法を調整することにより、分析物の抽出を増加し、より高い質量化合物の検出を可能にする。他のタイプの...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

著者は、 ウマゴヤシtruncatulaサンプルを提供するためのウィスコンシン大学マディソン校での栽培の部門の博士ジャン=ミシェル·ANEを承認したいと思います。この作品は、全米科学財団（NSF）からの資金によって部分的にサポートされていた補助金哲0957784、ウィスコンシン大学大学院ウィスコンシン同窓会研究財団（WARF）とRomnes学部研究フェローシッププログラム（LLまで）。 EGは、NSF大学院研究フェローシップ（DGE-1256259）を認めている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ゼラチンDifco214340熱で溶解
クライオスタット- HM 550Thermo Scientific956564A
酸化インジウム錫 (ITO) コーティング スライドガラス Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0.8 mm (幅 x 長さ x 厚さ)
2,5-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) マトリックス ICN BiomedicalsPI90033
エアブラシPaasche エアブラシ会社TG-100Dと 75 ml スチール容器
自動マトリックス噴霧器システム - TM-SprayerHTX Technologies, LLCHTX.TMSPです。H021-U装置を設置すると、特定の起動とシャットダウンの指示が与えられます
昇華装置 Chemglass Life ScienceCG-3038-01
Vacucumポンプ- Alcatel 2008理想的な真空製品P10976究極の圧力= 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOFブルカーダルトニクス276601
FlexImagingブルカーダルトニクス269841「ベンダー専用ソフトウェア」の一例
MALDI LTQ OrbitrapThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMASZ高精度質量測定のための高解像度 MALDI 装置
Q ExactiveThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR精密質量測定のための高分解能 LC-MS 装置

参考文献

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