ヒト血清から小非コードRNAの分離

サマリー

このプロトコルは、ヒト血清から低分子RNAを抽出するための方法が記載されている。私たちは、DNAアレイで使用するために、がん血清からマイクロRNAを分離してもシングルプレックス定量PCRするために、このメソッドを使用している。プロトコルは、高品質のRNAを得るために変更を加えてフェノール及びグアニジニウムチオシアネート試薬を利用する。

要約

RNAおよびその発現の分析は多くの研究室では一般的な機能です。重要なのは、哺乳動物細胞で発見されたマイクロRNAのような低分子RNAの登場です。これらの小さなRNAは、強力な遺伝子調節因子は、成長、開発、死などの重要な経路を制御し、大きな関心される体液中のそれらの発現に向けられてきた。これは、がんや血清バイオマーカーとしての可能性アプリケーションとしてのヒトの疾患での調節不全が原因です。しかしながら、血清中のmiRNA発現の分析は問題となり得る。ほとんどの場合、血清の量が制限され、血清は、小さなRNAが唯一の0.4から0.5パーセント^1を構成する総RNAを少量含まれています。このように血清から品質のRNAの十分な量の単離は、今日の研究者にとって大きな課題となっています。この技術的な研究では、DNAアレイまたはqPCR分析のどちらかのために十分なRNAを得るために、ヒト血清のわずか400μLを使用する方法を示しています。 Aこの方法のdvantagesは、その単純さと高品質のRNAを得る能力である。それは、小さなRNAの精製のための特殊な列を必要とせず、一般的な研究室で見つかった一般的な試薬およびハードウェアを利用しています。我々の方法は、同時に、高品質のRNAを得ながら、フェノールの混入を排除するために、フェーズロックゲルを利用する。また、さらに、分離工程の間に、すべての汚染物質を除去するために追加のステップをご紹介します。このプロトコルは、血清から最大100 ngの/μlの総RNAの収量を単離するのに非常に有効であるだけでなく、他の生体組織に適合させることができる。

概要

近年、ヒト疾患の早期発見のための新規なバイオマーカーを発見するためのプッシュ成長があった。注目は、潜在的なマーカーのようなマイクロRNA ^2（miRNAまたはのmiR）などの小さなRNAを使用して注目されている。これらの小さなRNAは、血清や研究などの体液で発見され、彼らが劣化し弾力性であり、様々な環境条件³の範囲に渡って安定しているが示されている。これらの機能は、血清中のmiRNAもしくは循環所与の理想的なバイオマーカー^4,5である。現在、生物学的液体から小さなRNAの単離には主に2つのアプローチがあります。第二のアプローチは、フェノールとグアニジンチオシアネート試薬⁷との長年のプロトコルを使用しながら、最初のアプローチは、小さなRNA ⁶と結合^し 、溶出するために、列ベースの技術を使用しています。我々は、ヒト血清からの低分子RNAを単離するための、シンプルで効果的な、列のないプロトコルを開発した。単離されたRNAは、直ちにですDNAオリゴヌクレオチド配列とRNAの塩基配列決定を含む下流の用途でately使用可能。

血清からRNAを単離するために、フェノールベースの​​方法を使用するときに我々はいくつかの問題に直面していたため、このプロトコルが開発されました。伝統をChomczynskiアプローチは頻繁にほとんどの商用ベンダーから入手可能な試薬の範囲で最も研究室で使用されています。しかしながら、それらの普及を考慮し、ストリンジェントなガイドラインは、一貫して、特定の血液または血清中に、体液からの高品質のRNAを産生するために開発されていない。

血清からRNAを単離に関連する一般的な問題は、低RNAの収量と分離、特にフェノールの際に使用する試薬の混入が含まれています。我々のアプローチは、例えば、定量的PCR（qPCR）およびRNA配列決定などの下流の分析のための高品質のRNAを提供するために、これらのフェノールの汚染物質を除去する。我々はさらに、miRNAアレイ上で、このRNAをテストしている。

プロトコル

注意：健康な患者や癌患者からのヒト血清サンプルを、ロイヤルプリンスアルフレッド病院シドニー（プロトコル番号X10-0016およびHREC/10/RPAH/24）技術大学から認可された人間の倫理的なプロトコルの下でインフォームドコンセントが得られたシドニー。血清試料は、種々のシドニーの病院から手術前に患者から採取し、-80℃で貯蔵中に入れた

血清から1。スモールRNAの単離

総RNAを、トリ-LS試薬RTプロトコルの修正版を用いてヒト血清から調製した。

1. アイスで凍結した血清サンプルを解凍した後、ラベルされたマイクロ遠心チューブに新たに解凍血清400μlのを転送します。
2. RNaseを含まないH ₂ O100μlの血清を希釈し、1 mg / mlの濃度でプロテイナーゼKを追加します。
3. プロテイナーゼKでタンパク質消化を可能にするために20分間37℃でインキュベート
4. TO、完全な可溶化を確実にトライ試薬RT LSの1.5倍のボリュームを追加し、4 - ブロモアニソールを100μl。
5. 簡単に説明すると、ホモジネートを反転5秒間繰り返しピペッティングを行い、ラベル2ミリリットルヘビーフェーズロックチューブに移す。
6. 4℃で20分間12,000×gでホモジネートを紡ぐ
7. 慎重に新鮮なDNA Lobindチューブに得られた水溶液を少なくとも1ミリリットルをデカントします。有機および間期は、フェーズロックチューブの白色ゲルの下に閉じ込められなければならない。
8. 、水溶液にグリコーゲンの5.0μL（5 mg / ml）を100％イソプロパノール500μl加え転倒混和し、-20℃でO / Nインキュベート
9. O / Nインキュベートした後、4℃の遠心機で12,000×gで20分間遠心分離器のサンプルを。
10. 透明な上澄みを捨て、4℃の遠心機で16,000×gで2分間の「フラッシュ」スピンを行う。
11. 慎重に透明なゾルを削除ピペットを用いてペレットを取り囲むution。
12. 10分間、10,000×gで、70％エタノール及び遠心1mlでペレットを洗浄。洗浄溶液をデカントし、洗浄ステップを繰り返します。

溶液中に2。RNAの再懸濁

1. ペレットが完全に溶解するの確保、RNaseを含まないH ₂ O10μlにペレットを再懸濁します。 RNAが完全に可溶化されていることを確認するために、サンプルを5分間55℃に加熱することができる。この時間の間、繰り返してピペッティングで試料を混ぜる。高い全RNAの収量については、同一患者からの2 RNA調製プール。
2. UV-可視分光光度計を用いて再懸濁RNAを定量し、2100バイオアナライザを用いてRNAの品質を評価する。ダウンストリームのアプリケーションで使用するために-80℃でプールされたRNAサンプルを格納します。

結果

図1は、血清から単離されたRNAの典型的なUV /可視スペクトルを示している。このプロファイルから、我々はそれぞれ、両方の270 nmおよび230 nmにおけるフェノール及び有機汚染物質との280 nmでタンパク質の混入を指摘した。残留グアニジンチオシアネートも260 nmで注目された。汚染物質を減らすために、最適化の一連の工程は、標準的なトライ試薬RT-LSプロシージャに作製した。我々は、総RNAの収量の両方を増加させ、汚染（黒線、 図1A）を低減するグリコーゲンの5 mg / mlのようにした。

さらに我々は、イソプロパノールを除去した後にRNAペレットを取り囲む洗浄緩衝液の約100〜300μlのがあったことを観察した。追加の遠心分離スピンをプロトコルに追加し、残渣を洗浄溶液を注意深く除去した。これは、280nm（赤線、 図1B）への270 nmのからプロファイルシフトをもたらした。我々は、この「フラッシュ」のスピンはフェノール汚染を減少させたと推定270 nmで280 nm...

ディスカッション

マイクロRNAの集団は、血清中に見出される総RNAの約0.4から0.5パーセントを構成する。さらに、ヒト血清中に見出される高タンパク質含量もある。 RNAを改善し、タンパク質とフェノールの両方を低減するために、我々はいくつかのステップを追加して、伝統的なアプローチをChomczynski ^9を変更した汚染する。

全RNAを、標準的なトライ試薬RT-LS（モレキュラー·リサーチ·センター）を用いて血清から単離した我々の実験室で行われたときしかし、この方法は、様々な汚染物質の低量でのRNAが得られた。

図1は、230nmの280nmでのタンパク質の混入の証拠を有するUV分光光度RNAプロファイルを、270nmでのフェノールの汚染、および他の有機汚染物質を示している。試薬、グアニジンチオシアネートもまた、260nmで検出した。

低血清RNA収量の問題に対処し、汚染を減少させる、optimizat一連のイオン工程は、標準的...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
RNase free H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491
Heavy Phase Lock tube	5PRIME	2302830	2 ml 容量
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5 ml容量
グリコーゲン	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg/ml
RNAグレード イソプロパノール	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
冷蔵遠心分離機	John Morris
Nanodrop UV-Vis 分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック USA
RNAグレードエタノール	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent, アメリカ