マウスの脳に直接薬剤送達のための異粘膜移植手順

サマリー

ヒト視鏡頭蓋底再建のマウスモデルは、鼻粘膜移植片を用いて、脳と鼻の間の半透過性界面を作成することが開発されている。この方法では、研究者は、全身投与された場合に他の方法で血液脳関門によって除外された高分子量治療薬の中枢神経系への送達を研究することを可能にする。

要約

脳への治療薬の送達は、血流から脳組織への極性および高分子量化合物の通過を制限する血液脳関門（BBB）の存在によって妨げられる。ヒトでのいくつかの直接の受け渡しの成功は、経頭蓋カテーテルの移植を介して達成された。しかし、この方法は非常に侵襲的であり、数々の合併症を伴うです。より侵襲性の低い代替物は、ヒトにおける内視鏡経鼻腫瘍除去手術後の頭蓋底の欠陥を修復するために使用される鼻粘膜のような外科的に移植され、半透膜を介して脳に投与するためであろう。この膜も薬物伝達が効率的にBBBをバイパスして、脳と脳脊髄液に直接拡散する。このアプローチに触発され、マウスでの外科的アプローチは、頭蓋外の手術のBBB欠損上移植されたドナー中隔粘膜を使用して開発した。このモデルは、効果的に示されている脳内への高分子量化合物の通過を可能にする。数多くの薬剤候補がBBBを通過することができないので、このモデルでは、神経精神疾患に対する新しい治療法の前臨床試験を実施するための貴重なものです。

概要

神経および精神疾患の治療に重大な中枢神経系^1-3に到達するすべての潜在的な薬剤の95％以上を阻止する血液脳関門（BBB）の存在によって妨げられる。全身的に送達されたとき、それがBBB ^4-6に浸透することができないため、例えば、神経栄養因子（GDNF）、グリア由来の脳に直接注射した場合に、パーキンソン病を治療するのに有効であることが示されている、しかし、効果がない。

多数の接近は、この問題を回避しようとするために開発されている。 neurotheraputicsの全身送達の改善は、脳毛細血管内皮上にある輸送タンパク質に選択的な抗体を含有する薬物複合体を使用することによって実証されている。しかしながら、この方法は、医薬品^7,8の幅広い適用可能であることが示されていない。さらに、BBBの浸透開口部はクリニック使用されています。関心⁹の脳領域へのより直接的な配信とは対照的に、同盟国、しかし、この方法は、全身薬物投与の影響を受けている。相当な努力が直接脳に^{10月12日を}対象と^したのを期待して経鼻配信を最適化するようになってきた。いくつかの成功が達成されてきたが、決定的な結果は、例えば、インスリン^、13,14などの内因性受容体を有する薬物のために得られている。さらに経鼻デリバリーのメカニズムは、嗅覚ニューロンの取り込みを介して、または血流¹¹を通って脳への間接的なエントリを示唆する証拠と議論されています。植込み型カテーテルを使用する直接、経頭蓋配達がこの手順では、侵襲性が高いと多数の合併症^15,16と関連し、達成された。現在までに、脳内に高分子量化合物を送達するためのない一般的な、低侵襲性の方法は存在しない。

マウスの外科的処置は、本明細書で提示さそれは、脳で半透過性のインターフェイスを作成します。これは、マウスでの外科的開頭欠損上粘膜外植片^17を移植することによって達成される。この手順を使用して、それは500 kDaの最大水溶性化合物は、時間と分子量依存的に¹⁸の両方において、中枢神経系（直接脳実質内へ、並びに脳脊髄液への）に送達することができることが示されている。 BBBを迂回するこの方法は、経鼻内視鏡手術^19,20次の頭蓋骨に穴を修復するために血管新生粘膜移植片を使用していますヒトで頭蓋底の欠陥の修理のためのモデルです。

プロトコル

手術前に行われるためにすべての手続きが動物実験委員会および追加倫理的または法的当局によって承認され、人道的な動物の治療プラクティスを使用していることを確認してください。これは、無菌手術の条件を用いて動物実験委員会は、法を承認した使用して、マウスを麻酔し、手術中に獣医軟膏をマウスに目を潤滑し、術後のケアを提供することを含む。手順の側面が承認されるかどうかを疑問点については、手術を続行しないでください。ここに実行されたすべての手順は、ボストン大学機関動物実験委員会によって承認された。

1。動物の作製および外科用品

1. 手術中に使用されるすべての外科器具をオートクレーブ。
2. 実行されるべきであるすべての技術は動物の規制当局によって承認されていることを確認します。

粘膜移植片の2。収穫

1. として同じような年齢の遺伝的に同一のマウスを選んだ実験マウスと（ここでは、頸椎脱臼が続くイソフルラン窒息）動物実験委員会に承認の方法でそれを安楽死させる。
2. 外科はさみを使用して、頭蓋骨を露出させ、マウスの頭部の鼻部分の周りの皮膚を取り除きます。
3. 空気式ドリルで、横方向に鼻の領域と垂直に2ラインを結ぶの目に沿って、第三の側面に位置する2そのうち3行をマーク。
4. 周囲の組織から鼻中隔を分離するために、腹側にドリルダウンします。広いパスが、しかし、それはまた、より困難に膜を単離することであろう粘膜への損傷を防止する。正中線に近い狭いカットを推奨します。
5. それに付着した組織から遊離隔壁を切断し、滅菌生理食塩水に格納するはさみを使用する。この時点では、移植片は、接続された組織を除去するクリーンアップすることができます。理想的な状況は、損傷を受けていない粘膜軟骨中隔の両側に露出させることである。一GR後方には、2匹のマウスのための膜は、膜の表面積が開頭術部位をカバーするのに十分である設け供給することができる。これは、移植片が、可能な限り迅速に使用され、研究者は、すぐに移植片が分離されているように、ステップ3に進むことをお勧めします。

粘膜移植片の3。外科的移植

1. 標準、無菌マウスの外科的処置を使用して、立体解析フレームにマウスを麻酔し、マウントします。げっ歯類の麻酔器を使用して純酸素で約2％イソフルランを使用してください。
2. 耳のバーや鼻ホルダーと定位固定装置にマウスを固定。目に眼軟膏を適用し、3ラウンドのベタジンおよび75％エタノールで頭皮をスクラブ。ハサミやヘアトリマーのいずれかを使用して、頭の上に毛皮を削除します。かみそりの刃で頭蓋骨を露出させ、ヘッドを水平に。投薬される脳の場所の上に開頭を行います。例えば、線条体をターゲットとする場合は、1.25ミリメートルを切る空気圧ドリルを使用。;：（0.88ミリメートルML 1.00ミリメートルのAPを中心とする）頭蓋骨の直径の円形の穴。滅菌生理食塩水掘削面積を湿らせ、頭蓋骨を削除するためにカミソリの刃を使用しています。
3. 慎重に針の先端を使用して硬膜を除去します。さらに、この湿った表面に硬膜組織接着剤の最小量を適用することによって達成することができる。この層が硬化した後、剃刀ブレード先端との横方向の動きは、膜を除去するために使用することができる。
4. 離れて傷と反対側上皮側を維持するために細心の注意を取って脳表面上の粘膜を配置します。これは、最高のピンセットで開頭術部位に隣接する頭蓋骨の表面上に隔壁全体を転送することによって行われる。外科はさみの先端を使用して、軟骨のOffおよび頭蓋骨と脳の表面に膜を引っ張る。膜が乾燥したり、任意の吸収性材料で触れないようにしてください。グラフトは、寛大に開頭Sのすべての骨の端と端が重なる必要があります映像情報メディア学会。
5. ニトリルの無菌枚で移植をカバーしています。これは、治癒の間に皮膚移植片の付着を防止するように作用する。ニトリルは、全体の粘膜を覆うのに十分な大きさであればよい。必要であれば過度の膜をトリミング。それは、移植片に接触した後、ニトリルのいずれかの運動は避けてください。
6. 実行中の5-0無菌縫合糸で皮膚を閉じ、マウスが次のステップに進む前に3-7日間回復しましょう​​。皮膚閉鎖時のニトリルバリアまたは粘膜移植を混乱しないように注意してください。

投与液の4。管理

1. 定位フレームに、麻酔したマウスを固定した後、ハ​​サミで縫合糸をカットし、頭蓋骨の周りの余分な皮膚を取り除く。
2. ニトリル障壁を除去して頭蓋骨の表面を清掃してください。移植が表示されるまでの領域をきれいに滅菌生理食塩水と綿棒を使用しています。 dよりも大きく成長した場合に移植片をカミソリで切断する必要があるかもしれない表面積をesired。
3. 実験は数日より長くなる場合には、頭インプラントを補強するために、少なくとも2つの頭蓋骨用ねじを埋め込むことが賢明である。
4. エッジが頭蓋骨に接触しているように、移植片の上にうまく配置します。ウェルと頭蓋骨の間の接合部にシアノアクリレート系接着剤を塗布。滅菌生理食塩水とよくを満たし、漏れがないことを確認してください。ウェルをカット注射針から作られる。
5. 所定の位置にうまくを確保するために頭蓋骨に骨セメントを適用します。
6. ピペットで井戸から生理食塩水を除去します。その接着剤が必要なソリューションを追加するインチ漏洩していません検証するだけでなく、数回洗浄する。この場合には、蛍光デキストラン50μlのに使用される。これは、類似の極性の水溶性化合物はデキストランと同様に動作することが期待される。疎水性化合物または懸濁液の送達は、この方法で検討されていません。
7. に固定され、ニトリルの円形の部分を使用してウェルのトップにキャップシアノアクリレート接着剤を用いてトップ。接着剤は、ウェル内容物と接触しないことを確認してください。

粘膜送達の5。分析

1. 所望の時間が経過した後に、マウスを麻酔し、エバンスブルー色素の溶液でウェル内容物を交換する。この色素は、移植片が無傷であったことを確認するために使用されている。
2. 30分後、頻繁にマウスを麻酔、色素溶液を除去し、断頭を経由して安楽死させる。
3. 手動でインプラントを除去し、手術用はさみを用いて脳を削除します。所定の位置に移植しないように注意してください。
4. 一旦除去、フラッシュ凍結イソブタンの溶液中に脳をドライアイス浴中で冷却した。
5. 50μMで最適な切削温度（10月）ソリューションとスライス脳に埋め込む。
6. 顕微鏡スライド上で直接目的のスライスを配置します。
7. 画像次第のOCT溶液を乾燥させたように蛍光顕微鏡を使用してスライス。

結果

十分な大きさの鼻中隔の外植片を得ることがその後のステップのために重要である。これは、 図1aに示されたドナーマウスの頭蓋上の位置で穿孔することによって達成することができる。 図1bに示すように、この経路に沿って切断して十分なサイズの外植片を生成する。掘削深さが十分に深くない場合には、移植片は切り捨てられ、それが脳の表面を覆うように十分な大きさの膜を得ることは困難であろう。より多くの組織は、鼻中隔に残り、次のステップはより困難になりますので、より横方向を示唆したパスよりも掘削はお勧めできません。事前の粘膜の転送するには、セプタムの表面がすべての余分な結合組織をきれいにする必要があります。これが完了すると、粘膜には、軟骨の表面に表示されるはずです。 図1cは、組織は、洗浄後にどのように見えるかを示しています。

MEMBを転送する前に、RANEは、開頭術および硬膜切除は、脳の表面を露出させるために実行される必要がある。後硬膜切除出血が停止した後にのみ膜を転送することができます。

ディスカッション

ここに記載されている手順の最も困難な段階は、脳の表面に適切なサイズの粘膜を正常に転送することです。収穫され、鼻中隔が十分に大きく、十分に洗浄された場合は、この手順が大幅に容易になる。中隔の腹側の部分が切り捨てられた場合、新たな移植片が得られるはずである。掘削角度は、粘膜ドリルによって損傷を受けないことを保証するために、マウスの頭部に対して垂直であるべきである。広い推奨値よりも掘削パスが取られている場合は、中隔に接続されている余分な組織を除去するためにはるかに困難になります。結合組織のいずれかの大規模な作品ではなく緩いそれらを引くしようとするよりも鋭いハサミカットで削除する必要があります。組織の小片は、組織が粘膜に接続されていない設けはさみの先端でこすることによって除去することができる。洗浄工程の終わりに、依然として結合した膜と軟骨表面が露出されるべきである。 OCCAsionally中隔の軟骨は、それが背側エッジに接続されている骨から切り離され得る。これは、それが次のステップでそれを使用することが可能であるような場合は、しかし、それは2つの理由のために、より困難である。骨は、洗浄し、それを転送する際に、外植片を保持するのに便利なハンドル...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス	Taconic	C57BL / 6
ソフルラン	Piramalヘルスケア学生
細かいはさみ	ファインサイエンスツール	91461-11
空気圧ドリル	MTI歯科	333-CB
ドリル
ビット鉗子	ファインサイエンスツール	91106-12
0.9%塩化ナトリウム注入USP	アボット研究所	4925
ポリスチレンペトリ皿	フィ	ッシャー08-757-12	一時的にグラフトを保管するための
ビーズ滅菌器	ファインサイエンスツール	18000-45
/イソフルランシステム	SurgiVet	V720100
温度制御システム	PhysitempTCAT-2LV
小動物定位固定装置	KOPF	モデル940
眼軟膏
電気シェーバー
綿先端アプリケーター	フィ	ッシャー23-400-106
7.5%プロビドンヨウ素			ベタジン外科用スクラブ
70%エタノール
外科用ブレードステンレス	フェ	ザー2976#10
メスハンドル - #3	ファインサイエンスツール	10003-12
			蓋骨Vetbond
組織接着剤	3M	1469SB
針	クトン、ディキンソンアンドカンパニー	305176	針先を切断し、同様に使用
シリンジ	ベクトン、ディキンソン・アンド・カンパニー	309597
ニトリル手袋	デンビル・サイエンティフィック社	G4162	井戸閉鎖とグラフトの保護用
5-0 ナイロン縫合糸
学生 ハルシー ニードルホルダー	ファインサイエンスツール	91201-13
シアノアクリレート接着剤			commecicially 利用可能な瞬間接着剤
歯科用セメントキット、1ポンド、ピンク不透明	Stoelting	51458
イソブタン(2-メチルブタン)	Aldrich	M32631	ドライアイスバス用
ドライアイス

イ酸素頭ベ