レチノイン酸によるマウスの主骨芽細胞の治療は、骨細胞の形態学的および分子的特徴をもつ分岐した細胞の均質な集団を生成します。この方法は、培養中の一次骨細胞を取得し、維持することの難しさを克服し、トランスジェニックモデル由来の細胞を研究することが有利である。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
骨細胞培養の必要性は、骨の研究者のコミュニティによく知られている。一次骨細胞の単離は困難であり、低細胞数を生成する。したがって、最も広く使用される細胞系は、骨細胞様MLO-Y4細胞株である。
ここで説明する方法は、形態学的および分子骨細胞の機能と分岐した細胞の均質な集団を生成するために、レチノイン酸の使用を意味する。
マウス頭蓋冠骨芽細胞からの単離後、全トランスレチノイン酸（ATRA）を細胞培地に添加され、セル監視を倒立顕微鏡下で毎日行われる。最初の形態学的変化は、治療の2日後に検出可能であり、差別化は、一般的に骨芽細胞マーカーのレギュレーションダウンとアップレギュレーション骨細胞特異的分子の細胞外マトリックスを産生する能力が失われ、樹状突起の漸進的発展に伴い、5日間で完了する。 コンテンツ ">毎日のセル監視が原因初代細胞の固有の変動性に必要とされており、プロトコルは、異なるマウス系統から得た細胞への最小限の変化に適応し、トランスジェニックモデルに適用することができる。
この方法は、実行が容易であり、特別な器具類を必要とせず、それは非常に再現性があり、かつ急速に無制限の生物学的用途のためのこれらの細胞の使用を可能にする、細胞外マトリックスの完全な非存在下で成熟した骨細胞集団を生成する。
概要
骨細胞、最も豊富な骨細胞型は、深く骨格内に位置する高度に分岐した細胞は最終分化している。成熟した骨細胞の細胞体は、骨小腔に含まれており、多様な形状を有する;丸みを帯びた骨細胞は、骨梁1に、より頻繁であるのに対し、細長い細胞体と骨細胞は、皮質骨で発見されています。分枝樹状突起は、他の骨ではなく、他の骨の細胞型、骨髄、血管及び関連する周皮細胞を有するだけでなく、複数の連絡先を行う複雑なウェブを形成する、細管と呼ばれる小さなチャネルにおいて細胞体から延びて存在する。小腔と細管間質液中に含まれる介して、骨細胞はまた、最終的に循環系に接続されているので、それらはローカルでなく、イベントだけでなく、全身に影響を与えることができ、その逆もその挙動は、局所および全身の両方の変化によって調節することができる2。
ザ·骨細胞の研究は、最近、このような組織および細胞特異的なトランスジェニック動物の生成、強力な顕微鏡技術のハイスループット分子スクリーニング3,4の使用などのいくつかの技術的な進歩のおかげで勢いを得ている。しかしながら、これらの細胞の知識は、主に、in vitroモデルにおいて適切な相対的希少性のために、依然として不完全である。実際に、骨細胞が原因の深い位置の取得と文化の中で維持するためには、常に困難であった、そしてそのような分化した細胞の種類を特徴づける低レベルの増殖している。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
全ての動物実験は、科学的な目的のために使用される動物の保護に関する国内および欧州の現行の規制に従って行ったとミラノ大学の倫理委員会によって審査され、承認された。
初代骨芽細胞の1。分離
この方法では、わずかな修正を加えて、Dodig ら 14によって記載された手順に従います。
- 0.1％コラゲナーゼPおよび0.05％トリプシンHBSS培地に（2.5％トリプシン、10X、無フェノールレッドから開始）（ハンクス平衡塩溶液、無カルシウム、マグネシウム、またはフェノールレッド）を追加することで、メディアを消化準備します。
- （手順はわずか1などのマウスに適用することができます）3〜4日齢のマウスを使用してください。
- 断頭により犠牲に。 70％エタノールでスプレーヘッド、氷上に保つ。ピンセット及び解剖/外科ハサミで皮膚や筋肉層を除去する。
- 優しく頭頂骨を削除し、2等分に矢状縫合に従うことによって、それらを分離する。骨は縫合糸および任意の接着性組織を含まず、手続きが完了するまでHBSS培地を含むウェルプレート内の個々の骨片を配置していることを確認してください。
- HBSSを捨て、各ウェルに37℃で15分間消化培地を追加
- 上清を捨てる。
- ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
結果は5〜10の独立した実験から得られた。
細胞形態学
AA / GPは初代細胞は主に玉石のような機能、成熟骨芽細胞の特性を持って処理した。散在枝状細胞は、（ 図1Aの赤い矢印で示すように）可能性がいくつかの骨を表す、見出すことができる。
ATRA処理によって、細胞が急速に一般的に2日後に観察される波及効果を、表示を開始。 図1（b）に示すように、分枝細胞は樹状突起を拡張するためのスペースが必要になります。 ATRAが進むとの処理としては、波及効果が次第に数と複雑さの増加、1Cおよび1Dフィギュア 。ローダミン標識ファロイジンによるフィラメント状アクチンのファロイジン染色は、 図2によって標識される細胞プロセスを強調している。
基質産生
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
最後の年で骨細胞は、骨の中の最も中心的な細胞として浮上している。研究の進歩は、徐々に骨様々な疾患のための新規およびより良い治療を設計するために多大な価値が以前に実証されていない又は疑われていない骨細胞の特性の数を明らかにしている。しかしながら、骨細胞生物学の調査は骨細胞様細胞株MLO-Y4が利用可能になる前に骨芽細胞が長期にわたってサロゲート細胞として使用されているような程度にin vitroモデルの限られた利用可能に罹患されている。さらに最近では、条件的に不死化細胞株は、スクレロスチンとFGF23を表現後半骨細胞を分枝する分化させることができる、同じグループ16、紹介されました。これらの細胞株の極値問合せ下にないが、それは非常によく一次細胞は、よりin vivoでの状況に似ており、一次骨frを取得する可能性を提供することが知られている特定の分子経路についての機能的研究を行うためにトランスジェニック動物をOM。
単離及び第5,6、続いて、ラット及びマウスの骨17,7からニワトリの骨.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
資金はMDに「PROGETTO concorso伊IRCCS病院周辺マッジョーレ総合病院2009年から2010年」、およびAssociazioneバンビーノNefropatico ABN Onlus、ミラノから提供された
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コラゲナーゼ P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | 37°C;C 使用前の |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | 37°C;C 使用前のC |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| ストレプトマイシン/ペニシリン | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| アスコルビン酸 | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| グリセロール 2-リン酸二ナトリウム塩水和物 | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | ATRAを光から保護する |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | P6148 | PBSに溶解し、使用前にろ過してください。常にケミカルフードの下で作業してください。 |
| DAPI | シグマ-アルドリッチ | 32670 | 二次抗体に加えることが可能 |
| アリザリンレッド | シグマ-アルドリッチ | A5533 | |
| ヤヌスグリーン | シグマ-アルドリッチ | 201677 | |
| 過塩素酸 | シグマ-アルドリッチ | 176745 | 注意して使用(皮膚と目の保護を推奨) |
| HCl | Sigma-アルドリッチ | 320331 | 注意して使用してください(皮膚と目の保護をお勧めします) |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| 解剖ハサミ、ストレート、10 cm湾曲 | World Precision Instruments | 14394 | |
| 手術用ハサミ、14 cm、ストレート、S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| 培養フラスコ | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| 顕微鏡 | ツァイス アポトーム | ||
| 分光計 | Safas Xenius |
参考文献
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
