慢性腎臓病患者における血管機能の評価

サマリー

血管機能不全および生理学的メカニズムに寄与する度合いは、上腕動脈流依存性血管拡張反応、大動脈の脈波速度、および血管内皮細胞のタンパク質発現を測定することにより、慢性腎疾患を有する患者で評価することができる。

要約

慢性腎臓病（CKD）を有する患者は、有意に、一般集団と比較して、心血管疾患（CVD）のリスクが増加し、これは部分的にのみ従来のCVD危険因子によって説明される。血管機能不全は、血管内皮機能障害（最も一般的に減損内皮依存性拡張[EDD]として評価さ）と大きな弾性動脈の硬直が特徴の重要な非伝統的な危険因子です。様々な技術がEDDと大きな弾性動脈剛性を評価するために存在するが、最も一般的に使用される上腕動脈流依存性血管拡張反応（FMD _BA）及び大動脈の脈波速度（aPWV）である。血管機能不全のこれらの非侵襲的措置の両方を持つと腎臓疾患のない患者では、将来の心血管イベントの独立した予測因子である。 CKDの患者は両方の障害をFMD _BAを発揮し、aPWVを増加させた。しばらくする正確なメカニズムは、血管機能不全DEVECKDでのLOPは完全には理解され、増加した酸化ストレスおよび一酸化窒素（NO）の生物学的利用能におけるその後の低下が重要な要因である。酸化ストレスの細胞変化は、肘正中静脈から血管内皮細胞を採取し、免疫蛍光法を用いて酸化ストレスのマーカーのタンパク質発現を測定することによって評価することができる。ここではFMD _BA、aPWV、および血管内皮細胞のタンパク質発現を測定するためのこれらの方法の議論を提供する。

概要

慢性腎臓病（CKD）は、米国だけで¹の人口の〜11.5％に影響を与え、大流行に達している公衆衛生上の大きな関心事である。 CKDの患者での心血管死亡または心血管イベントのリスクが大幅に一般集団^2-4と比較して増加する。 CKDの患者は、従来の心血管危険因子の高い有病率を示すが、これは心血管疾患の彼らの発生率の増加^（CVD）5の一部を説明しています。血管機能不全は、腎臓^6-9の分野で増加した認識を得ることが重要非伝統的な心血管の危険因子である。

多くの変更は、おそらく最大の関心事のものの中に最も一般的に損なわれる内皮依存性拡張（EDD）と、LAの補強として評価され、血管内皮機能障害の開発である、動脈機能不全の発展に貢献しながら、RGE弾性動脈^10。様々な技術が、EDDと大きな弾性動脈の硬さを評価するために存在するが、最も一般的に使用され、それぞれ、上腕動脈の流れ依存性血管拡張反応FMD _BAおよび大動脈脈波速度（aPWV）です。 EDDを評価するための別の一般的に使用される技術は、例えば静脈閉塞プレチスモグラフィー^11,12を用いて、アセチルコリンなどの薬理学的薬剤に対する前腕血流応答を測定する。ただし、この方法論は、口蹄疫_BAよりも侵襲的であり、CKD患者では禁忌である上腕動脈のカテーテル挿入を必要とします。これはのように広く使われているかaPWV ¹³などの臨床的エンドポイントで検証されていないが、動脈硬化を評価するための代替技術は、頸動脈のローカル動脈コンプライアンス（剛性の逆数）を測定することです。

CKDの患者は、損なわれた口蹄疫_BA ^14から16と増加し、大動脈脈波速度aPの両方を実証WV ^13,17,18、前であっても、透析を必要とする。重要なことは、臨床的観点から、血管機能不全のこれらの非侵襲的措置の両方がCKDを^19〜21の患者では、だけでなく、他の人口^22〜26の両方の将来の心血管イベントおよび死亡率の独立した予測因子である。これらの技術は、CKDの患者を含め、CVDのリスクのある様々な集団を研究に適用することができます。

動脈機能不全は、CKDに発症する正確なメカニズムは完全には理解され;しかし、減少した一酸化窒素（NO）の生物学的利用能は、重要な貢献者^27〜30及び減損EDD両方の共通のメカニズムと増加動脈硬化^10,31です。 CKDにおいて、酸化ストレスが増加し、NO生物学的利用能^32-34の低減に寄与する。酸化ストレスは、抗酸化防御に対して反応性酸素種（ROS）の過剰な生物学的利用能として定義される。生理的刺激株式会社炎症性シグナリングをluding、酸化剤酵素系を促進するスーパーオキシドアニオン（O _2● ^{- ）}を含め、ROSを生成する（ 例えば 、酸化酵素NADPHオキシダーゼ^。）35。スーパーオキシドの産生は、最終的に一酸化窒素（NO）の生物学的利用能を減少させるために導く。

内皮機能障害は、入射CKD ³⁶の独立した予測因子であるように今度は、CKDの発展に貢献するかもしれない、NO生物学的利用能が損なわれていない。これは、eNOSの阻害は、高血圧（全身性および糸球体）、糸球体虚血、糸球体硬化症、尿細管間質性、および損傷^37を誘導すること^を示す動物データと一致する。実際には、NO生物学的利用能は、人間のCKD ^38,39の内皮機能不全のために重要な役割を示唆し、人間の病気を模倣実験的腎疾患の発症および進行のために必要な表示されません減少した。

血管の酸化ストレスのマーカーはVで評価することができるもともとコロンボら ⁴⁰によって開発され、シールら ^41-43改変技術を用いて、ヒト研究対象から採取した内皮細胞をascular。 2滅菌Jワイヤを用いて、細胞は、肘正中静脈から採取回収し、固定し、後で正に内皮細胞と同定し、免疫蛍光を用いて目的のタンパク質の発現について分析する。

私たちは、口蹄疫_BAを測定する）、ここに使用することができ、この方法論の議論を提供する; B）aPWVを測定する。 c）の酸化ストレスのマーカーの血管内皮細胞のタンパク質発現を測定する。焦点は、慢性透析を必要としない、CKDの患者である。

プロトコル

このプロトコルは、コロラド州の複数の治験審査委員会（COMIRB）のガイドラインに従っています。

テストセッションのために1。準備

1. 参加者は、最も正確な測定のために、これらの制限に従う必要があります。薬から喫煙による食品やカフェインからの高速12時間、12時間の拘束運動から、12時間の拘束、該当する場合は、> 4半減期拘束可能な場合（に可能でないかもしれませんこのようなCKD患者人口）、および閉経前の女性はホルモンの影響を最小限に抑えるために、月経周期の日数1-7にテストする必要があります。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の476.8ミリリットルにする2ミリリットルの0.5Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ヘパリン（180 USP単位/ mg）を0.05g、及びウシ血清アルブミンを2.5gを添加して解離緩衝液を500mlを調製7.4のpH。これは、数ヶ月間、4℃で保存することができる。
3. 超音波、コンピュータ、および非侵襲血行動態をオンにするワークステーション（NIHem、動脈硬化装置）。ケーブルは、コンピューターR波トリガーボックスに超音波を出力に接続します。

血管内皮細胞の2。収集および処理

1. 訓練を受けた看護師や医師がコレクションを実行（2.2から2.5、2.7ステップ）、および研究者は、ワイヤを収集し、処理します（2.6、2.8から2.19ステップ）
2. 準備局所消毒薬と肘サイト、止血帯を適用し、静脈を見つけ、18のGカテーテルとカニューレを挿入する。 IVの端にheplockアダプタを配置します。
3. 滅菌手袋を着用し、サイト上での滅菌有窓ドレープを置く。
4. ドレープに2点のワイヤを配置します。両方のワイヤから「J」形状を解くために「J」の弧を引く。
5. heplockを暴露すると静脈約8センチメートルに、J-ワイヤーを養う。ワイヤーを取り外す前に、前後に数回押してください。ワイヤ上の総血を避けてください。
6. 彼らは内に収まるように配線を切り取るためにワイヤーカッターを使用解離緩衝液約30 mlを入れた50mlコニカルチューブ
7. 第2のワイヤについて、手順2.5。
8. 第2のワイヤについて、手順2.6。ウェットラボにチューブを返します。
9. ピンセットでワイヤーを留め金、チューブの内側に電線を保持するが、溶液上。 10分間、繰り返し50ミリリットルコニカルチューブから解離緩衝液を収集するために、電動ピペッターを使用して、チューブにワイヤーから余分な液体を振り払う、その後、ワイヤーをすすぎ、振動さのワイヤの長さに沿って実行されますので、それを解放します。
10. 400 XG、4℃で7分間遠心
11. 100ミリリットルホルムアルデヒド溶液+ 900ミリリットルのPBSを組み合わせることにより、ホイルカバーチューブ内のホルムアルデヒド溶液を調製する。
12. ゆっくりと、遠心分離器からチューブを取り外し、真空ポンプの電源を入れ、吸引ホースの先端にピペットチップを配置し、 ペレットを乱すことなく 、残りをオフに掃除、チューブ内〜400ミリリットルにしておきます。
13. 箔ピペットを1mlのホルムアルデヒド溶液で覆うにサンプルを固定するためのチューブ。再懸濁されない。室温で10分間インキュベートする。
14. 件名と研究訪問情報で標識し、PAPペンで各スライドに楕円形を描画することで8スライドを準備します。
15. 15ミリリットルのPBS、再懸濁を追加し、400×gで5分間遠心分離し、4℃
16. 繰り返しステップ2.15、12ミリリットルのPBS、再懸濁を追加し、400×gで6分間遠心し、4℃
17. ゆっくりと、遠心分離器からチューブを取り外し、真空ポンプの電源を入れ、吸引ホースの先端にピペットチップを配置し、 ペレットを乱すことなく 、残りをオフに掃除、チューブ内〜2ミリリットルを残す。
18. 均等に楕円形の地域で8スライド全体で再懸濁し、ピペット。
19. 5時間、37℃のインキュベーター内で配置し、（サンプルは、長年の罰金となります）分析の準備ができるまで-80℃で保存する。

口蹄疫_BAおよびaPWVの3。評価

1. 使い捨てショーツに研究課題の変更があり、時間があるIM /静かで薄暗い、気候制御された部屋で彼女の嘘仰臥位。
2. 適切な特定の超音波および動脈硬化装置のための心電図の数（この手順は、非侵襲的血行動態Workstationは[NIHem] 4の電極を必要とする動脈硬化を測定するために使用しています）、および主題の血圧カフを配置します。
3. 20分後、血圧の読みを開始する。少なくとも3を実行し、測定は5 mmHgの範囲内になるまで繰り返し、各読み取りの間に2分休止。
4. 上腕動脈パルスを触診し、ソフトウェアプログラムを使用して上腕波形を記録するために眼圧計を配置することにより、眼圧測定を開始する。
5. ラジアル大腿及び頸動脈のために繰り返します。
6. 巻尺（上腕、半径方向および頸動脈）やカスタム定規/キャリパー（大腿骨）を使用してsupersternalノッチから、これらの各サイトとの距離を測定します。
7. ソフトウェアプログラムを使用して頸動脈 - 上腕、頚動脈ラジアル、および頸動脈 - 大腿（aPWV）を計算します。
8. 場所モードをトリガするように設定血管ソフトウェアと肘頭処理およびレコードのベースライン上腕動脈の超音波画像および血流速度測定値の少なくとも10個の心周期のすぐ遠位前腕血圧カフ。機械式アームは、必要に応じて超音波プローブを安定するために使用することができる。
9. 250 mmHgのに前腕血圧カフを膨張させ、タイマーを開始します。非常にまだ残っているため、参加者に指示する。
10. タイマが午前4時45分を読み取るときのモードをトリガするために、血管のソフトウェアを設定して記録速度を開始します。トリガーは、午前5時00分にカフを解放し、時計は午前5時10分を読み込むとき、Bモード（直径）の画像を記録するために、超音波を変更してください。
11. 時計は7時を読み取るまで録画を継続する。
12. レコードモードをトリガするように設定血管ソフトウェアベースライン上腕動脈の超音波画像の少なくとも10の心臓サイクル。
13. 対象の血圧を取る。収縮期血圧> 100 mmHgの場合は、件名の下に舌下ニトログリセリンの0.4 mgのプレース＆＃39;舌、患者が他の禁忌がない限り、タイマーを開始します。
14. クロックモードをトリガするように設定血管ソフトウェアで3:00読み取るときB-モード（直径画像）を記録し始める。
15. 時計が8時を読み込む際に、録音を停止します。
16. それがベースラインに戻るまで、血圧を監視する

4。ヒト臍帯静脈内皮細胞を調製する（HUVEC）コントロールスライド

1. 流路5-6にHUVECを伸ばして約80％の集密度。
2. 3トリプシンmlまたはどんなお料理/フラスコのために必要であるとトリプシン処理。
3. トリプシン中和液に等量のを使用してトリプシンを中和する。
4. 〜5分間200×gで遠心分離し、真空によってトリプシン中和液を除去。
5. 洗う〜10mlのPBSに再懸濁。
6. 〜5分で200×gで遠心します。 PBSを除去します。
7. PBSを削除し、1800μLのPBS + 200μlのホルムアルデヒドで固定します。
8. PBSに再懸濁し（約10 ml）を加えた。
9. 200×gで遠心します〜5分。 PBS、スライドあたり〜200μLを追加するには、適切な量の再懸濁を削除します。
10. -80℃で保存したスライドは、分析の準備ができるまで（サンプルは、多くの年の罰金になります）。

血管内皮細胞の5。染色

1. -80℃の冷凍庫からスライドしてください（この手順では、1 HUVECコントロールスライドを含め、10のスライドのバッチのためである）を、室温で5分間待ってください。
2. 繊細な作業に余分な水分を乾いた布で拭き取ってください（スライドの中央には手を触れないでください）​​拭きます。
3. 水和物-REスライド各スライドに変更されたPBSを加えることで、10分間置いておく。
4. スライドが立っているが、5％ロバ血清や他のソリューションを用意します。
   1. 最大10のスライドの（7.4のpHに）変更されたのPBS 5700μlにロバ血清を300μlを加えることにより、5％ロバ血清を準備します（詳細については、この量を増加させる）。
   2. 5％血清を1,000μlの目的の一次抗体を希釈する。例えば、ニトロチロシンおよびNADPHオキシダーゼ（1:300および1:1,500）は、酸化ストレスのマーカーとして使用することができる。
   3. 5％の血清の1500μllにAF568の5μLを希釈することにより、二次AF568を準備します。
   4. 準備の2液を希釈することによりVEカドヘリン、5％血清の千μlにカドヘリンを見る。
   5. 5％の血清千μlにカドヘリンをVEの5μLを希釈することによりAF488を準備します。
   6. プロセス全体を通して、箔の下カドヘリン及びAF488 VE、AF568を維持して、スライドを準備しながら4℃の冷蔵庫内にロッカー上に置きます。
5. 再水和の10分後に、繊細なタスクのドライスライドは拭いてください。
6. 60分間、5％ロバ血清を追加し、化学物質の完全なカバレッジを確保するために丸で囲んだ領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置します。
7. 繊細な作業にプラスチックパラフィンフィルムとドライスライドを捨てる拭きます。 洗浄しないでください 。 60分間、一次抗体を追加し、確保するために円で囲まれた領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置化学を完全にカバー。
8. 噴霧ボトルから変更されたPBSで洗浄し、5分間のスライドの列に浸し、プラスチックパラフィンフィルムを破棄。スライドを浸漬している間、暗い部屋に移動します。すべての残りのステップを暗所で働いています。
9. キムワイプドライスライドは、45分間AF568（二次抗体）を追加し、化学物質の完全なカバレッジを確保するために円で囲まれた領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置します。光からカバーしています。
10. バイオハザード廃棄物容器内のプラスチックパラフィンフィルムを破棄。噴霧ボトルから変更されたPBSですすぎ、その後、5分間の列に浸します。
11. キムワイプドライスライドは、その後60分間カドヘリンをVE、化学の完全なカバレッジを確保するために円で囲まれた領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置追加。光からカバーしています。
12. バイオハザード廃棄物容器内のプラスチックパラフィンフィルムを破棄。噴霧ボトルから変更されたPBSですすぎ、その後、5分間の列に浸します。
13. ドライスライド繊細な作業では、30分間のAF488を追加し、化学物質の完全なカバレッジを確保するために円で囲まれた領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置し、拭いてください。光からカバーしています。
14. バイオハザード廃棄物容器内のプラスチックパラフィンフィルムを破棄。噴霧ボトルから変更されたPBSですすぎ、その後、5分間の列に浸します。
15. 繊細なタスクドライスライドワイプやスライドを20分間乾燥させます。光からカバーしています。
16. 各スライドに4媒体を装着するだけfluoroshield一滴 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール塩酸塩（DAPI）を追加し、カバースリップそれぞれを覆う。
17. ホイルで覆われた4℃の冷蔵庫にスライドを置きます。イメージングは​​、48時間以内に完了する必要がある。

6。イメージングおよび血管内皮細胞の分析

1. 具体的な顕微鏡の仕様に合わせて染色した内皮細胞を画像化するための顕微鏡を準備します。シングル盲目技術者は、バットのための任意の特定のタンパク質を分析する必要があります細胞のCH。
2. 体系的にスライドをスキャンします。カドヘリンをVEおよびDAPIのポジティブ染色により、核の完全性を確認するための陽性染色により内皮細胞を識別します。
3. 後の分析のためにスライドあたりの画像30細胞。 HUVECを含め、染色されたバッチ内の各スライドについて、この手順を繰り返します。
4. 定性的なソフトウェアを使用して、目的の一次抗体の染色の強さを分析する。
5. 異なる染色セッション、HUVECにおける同じタンパク質の発現に収集内皮細胞におけるタンパク質発現の比として報告する値の間の強度の染色における差異の可能な交絡効果を最小限にするために。

結果

FMD _BAが反応性充血次上腕動脈の直径のピーク変化として定量化される。したがって、安静時の直径は、5分間血圧カフ閉塞期間（ 図1）の端部以下の直径と比較される。パネルAは、上腕動脈の代表的な超音波画像を示しており、市販のソフトウエアを用いて得られたパネルBは、以下の2分のカフから放出直径がR波ゲートさ変化のグラフを表示する。変更は（ 図1の変化は4.8％である）、しばしば非常に最小限に抑えられますように、測定のわずかな違いが結果に大きな影響を持つことができます。市販の自動エッジ検出ソフトウェアの使用は、高度計測^44,45にバイアスと潜在的なエラーを最小限に抑えることをお勧めします。反応性充血の間の拡張のための刺激は、比較される基または状態との間で異なっていてもよいように、剪断速度は、ドップラー血流を用いて計算されるべきである速度、およびFMD _BAは ^46,47、該当の違いを調整する必要があります。

aPWVは、当社の研究...

ディスカッション

FMD _BAとaPWVための正確な結果を得ることは、それぞれ、高品質の超音波画像および圧力波形を取得することが必要である。これの中心は、オペレータ⁴⁴による各手法の適切かつ継続的なトレーニングと使用することである。また、テストセッション（ 例えば 、前に12時間の速い、気候制御室など ^）44,45を標準化することによって、可能な結果に影響を与える可能性がある多くの外部の変数を制御するために重要です。上述したように、商業的にR波ゲーテッド取得ソフトウェアとエッジ検出ソフトウェアを使用することは非常に測定^44,45にバイアスと潜在的なエラーを最小限に抑えることをお勧めします。 FMD _BAが損なわれる場合、これは損なわNO放出に起因する、または起因する内皮から放出されるNOの血管平滑筋の応答性を損なわのいずれかであり得る。舌下ニトログリセリンは、滑らかなの応答性を制御するために投与され、FMD _BA内の任意の障害が一酸化窒素^44,45を生成するために血...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
J-wire	セントジュード	404584	2 per collection
使い捨てショーツ (MediShorts)	Quick Medical	4507
非侵襲的血行動態ワークステーション (NIHem)	Cardiovascualr Engineering	N/A	カスタム定規が含まれています。 別のシステムは、Sphygmocor
Ultrasound	GEです。	モデル:Vivid7 Dimension	G.E.を使用していますが、多くの会社やモデルがあります
Vascular software(Vascular Imager)	医用画像アプリケーション	N/A
R-waveトリガーボックス	医用画像アプリケーション	N/A	カスタムメイド
ラピッドカフインフレーションシステム	Hokanson	モデル:Hokanson E20
前腕血圧カフ	Hokanson	N/A	6.5 x 34 cm膀胱付きカスタムカフ
HUVECs	Invitrogren	C-015-5C
ロバ血清	ジャクソン	017-000-121
パップペン	リサーチプロダクツ インターナショナル	195505
VE Cadherin	Abcam	ab33168
AF568	Life Technologies	A11011	microscpe
AF488	Life Technologies	A11034	マイクロスペックの仕様による
ニトロチロシン抗体	Abcam	ab7048
NADPHオキシダーゼ抗体	Upstate	07-001
DAPI		ベクターH-1200
リケートタスクワイプ(Kimwipe)	フィッシャーサイエンティフィック	06-666-A
プラスチックパラフィンフィルム(パラフィルム)	フィッシャーサイエンティフィック	13-374-10
共焦点顕微鏡	オリンパス	モデル:FV1000 FCS/RICS	多くのオプションあり