このビデオ記事は、癌細胞の浸潤を促進するホルモン、サイトカイン、および/または成長因子の役割を調べるための改良されたin vitro法について説明しています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
血清は、癌細胞が微小血管に彼らの血管内を容易に移行し、侵入している方に化学誘引物質として機能します。しかし、細胞が移動した方に実際の分子が、とらえどころのないまま。この修正された浸潤アッセイは、細胞遊走および浸潤を駆動する標的を同定するために開発された。この技術は、特定のホルモン、成長因子、またはサイトカインが癌細胞の浸潤能を媒介する役割を果たしているかどうかを決定するための3つの条件の下で侵入度とを比較する。これらの条件は、ホルモン、成長因子、およびサイトカインおよびiii）CS-FBS +分子（示される「X」）を除去するのi）通常のウシ胎児血清（FBS）、ii）のチャコール処理FBS（CS-FBS）を含む。 FBSと比較して、CS-FBSと細胞浸潤の有意な変化は、変化を媒介するホルモン、サイトカインまたは成長因子の関与を示している。個々の分子は、再度それらの能力をアッセイするためにCS-FBSを追加し直すことができる侵入表現型を詩や救助。さらに、2つ以上の因子は、添加剤または駆動または浸潤を阻害するのに複数の分子の相乗効果を評価するために組み合わせることができる。全体として、この方法は、ホルモン、サイトカイン、および/または成長因子が癌細胞の特定のタイプまたは特定の変異体の化学誘引物質または浸潤の阻害剤として機能することにより、細胞浸潤において役割を果たしているかどうかを決定するために研究者を可能にする。特定の化学誘引物質および阻害剤を同定することによって、この変更された浸潤アッセイは、癌細胞の浸潤を導くシグナル伝達経路を解明するのに役立ち得る。
概要
新規な浸潤アッセイは、癌細胞浸潤における化学誘引物質として特定のホルモン、サイトカインおよび/または成長因子の関与を同定することを目的に開発された。細胞外マトリックス（ECM）を通って浸潤する腫瘍細胞の能力は、転移表現型1-3の特徴である。浸潤チャンバーは広範囲の癌細胞の浸潤および遊走を研究するためのin vitroツールとして使用されており、in vivoでの腫瘍浸潤および転移のメカニズムとして知識を提供してもよい。 チャンバは、細胞培養プレートのウェル内にネストされた円筒形の細胞培養インサートから成る。インサートの底部は、規定の孔サイズの半透過性ポリカーボネートまたはポリスチレン膜である。
標準浸潤アッセイでは、細胞は無血清培地でインサートメンブレン上に播種し、血清または血清のような化学誘引物質で充填されている細胞培養ウェルに入れ秒化学誘引力アップら。この力ドライブ細胞を、検出し、細胞数を定量化するために、従来の染料を用いて染色することができる細胞外マトリックス（浸潤）のコーティングを通して、あるいは半透膜（マイグレーション）を介して移動したりする。細胞数は、次に、非侵襲的細胞株における遊走および浸潤の程度に応じて正規化される。この方法では、研究者は、遺伝子操作を含む、種々の条件下で異なる細胞型の浸潤能を評価することを可能にする。
ホルモン、サイトカインおよび成長因子は、血清の重要な構成要素であり、ますます浸潤性の表現型4を駆動すると関連することが示されている。しかし、侵入を媒介するこれらの化学誘引血清分子の性質、役割、および特異性はまだとらえどころのないまま。課題は、血清または血清のような化学誘引物質の特定の要因が運転を担当するかを決定するために残っている癌細胞浸潤ならびにどの分子が侵入プロセスを阻害することができる。本稿では、癌細胞の化学誘引および浸潤を駆動する分子として、ホルモン、サイトカインおよび/または血清中に存在する成長因子の関与の可能性を評価するための方法論を説明します。
この提案された修正されたプロトコルでは、木炭ストリッピングは、2％チャコール処理FBS（CS-FBS）を生成するために、2％ウシ胎児血清（FBS）からホルモン、サイトカインおよび増殖因子を除去するために使用される。 2％FBSおよび2％CS-FBSの両方が癌細胞浸潤を駆動するために化学誘引力を設定するための薬剤として使用される。 FBSは、まず、最も顕著に、ホルモン、サイトカインおよび増殖因子の減少/相対的な非存在下での癌浸潤表現型を研究するための能力を含むいくつかの利点が得られる通常の2％と比較して、化学誘引剤として2％CS-FBSを用いた。また、ホルモン、成長因子の集団を除去するかどうかを評価するために研究者を可能にし、cyのtokinesは侵襲的な指標の増加または減少を引き起こす。アッセイは、その後（ 図2および3を参照）、「X」と称される個々の成分の添加は、減少し、増加を阻害するか、元の値に侵襲的なインデックスを復元することができるかどうかを決定するように設計される。この方法は、木炭ストリッピング時に血清から除去される成分の生理的レベルを達成するために特異的であるが、それはまた、木炭ストリッピングはまた、シグナル伝達経路に影響を与えることができることに留意すべきである。例えば、木炭ストリッピングは、骨前駆細胞のアルカリホスファターゼ活性を低下させ、MAPK活性化剤5の還元により脂肪生成を誘導することが報告されている。チャコール処理メディアは、市販されており、プロトコルに基づくことがデキストランで木炭を結合し、ウシ胎児血清O / N 6と共にインキュベート概説されている。
このアッセイは、RESPOで開発されたNSEはザッカーら 7によって報告された結果に著者は、通常の2％FBSをメディアに向けて移行するときのギャップ結合コミュニケーションに影響を与える変異体の表現型は侵略指数の増加を示したことを実証した。この増加は、チャコール処理血清の置換で除去した。この結果から、著者らは、この変異体は、親油性分子（具体的には、ホルモン、成長因子、またはサイトカイン）7に向かって遊走に影響することを結論付けた。これはよくホルモン、成長因子、サイトカイン、腫瘍促進および浸潤4に関与するシグナル伝達経路を媒介することが知られている。したがって、科学的な研究者がどのような要因（s）が検討され、それらの特定の癌細胞または変異体の腫瘍浸潤を駆動しているかを決定するために重要である。成分の濃度との差に応じて決定されるようなアッセイは、それらの生理学的濃度で、個々の成分の役割に対処するために設計されている＆＃8220; X "正常FBSおよびCS-FBS中。このアッセイの開発を通じて、研究者らは、彼らのシステムを管理する特定の侵襲的な経路へのより多くの洞察を得ることができます。
ホルモン、成長因子、およびサイトカインは、多くの場合、腫瘍促進8として分類されている。 EGFのようなこれらの要因のいくつかは、浸潤チャンバー9における化学誘引物質の直接の供給源として使用される。したがって、これらは、直接腫瘍浸潤、血清の主要成分を表す可能性が高いようである。このプロトコルは、研究者は、癌細胞の浸潤能を媒介する、ホルモン、成長因子、およびサイトカインの関与を評価することができ、従来のインビトロ浸潤アッセイにシンプルであり、有意な変更を提案している。しかしながら、アッセイは、貴重な時間とrを使用しないように、手順は、分析の初期段階で彼らの研究のために有効であるかどうかについての回答と調査者を提供するように設計されesources場合は不要と考えられる。この方法では、CS-FBSを使用し、潜在的に癌細胞の浸潤を仲介リード候補として追求する分子れるように研究者の裁量に依存しています。これらの分析の結果は、血清成分が特定の細胞株または変異体の化学誘引物質または阻害剤が検討されているとして機能する特定するのに有用であることを証明する必要があります。さらに、このアプローチは、研究者が癌細胞浸潤を促進または阻害のいずれかの重要なシグナル伝達経路の特定に役立つことができる。したがって、将来の薬剤設計を演出。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1.様々なメディアやその他のコンポーネントを準備
- 実験の前に、テストされるいずれかの通常のFBSを加え、チャコール処理FBS、またはチャコール処理FBSを加えた構成要素を含むDMEMまたは他の指定されたメディアからなるメディアを準備。複数のコンポーネントが、各実験で試験することができることに留意されたい。
- 秤量し、ホルモン、成長因子、または適切な生理学的濃度でチャコール処理血清中に溶解させるサイトカインを希釈する。
2.氷の上にコラーゲンマトリックスを準備します
- 200μlの10倍のPBS（pH7.4）を、5.4μlの1NのNaOH、二重蒸留H 2 O600μlの、および1.2ミリリットルのコラーゲンI：私は氷の上で、以下の滅菌濾過のコンポーネントを追加することによって、2.2 mg / mlの位置にマトリクス2ミリリットルコラーゲンを準備（3.63 mg / mlの時）。
- プレートの準備ができるまで氷上にコラーゲンI溶液にしてください。
3. <アッセイのための移行/浸潤プレートを準備します/ pの>
- 試験すべき各細胞株について、12ウェルインサートを含有したもので、24ウェルチャンバープレートが使用。化学誘引物質メディアを追加し、設定した実験用インサートを転送するためのインサートを含有していない追加の12の井戸を使用してください。
注：細胞株をここで使用するためのポリエチレンテレフタレート（PET）膜および8μmの孔サイズを有するプレート上のコラーゲンマトリックスが最適である。しかし、プレコーティングしたプレートにおけるマトリゲルマトリックスはまた、研究された細胞株に応じて減少する孔径を有する置換されていてもよい。 - 明らかに、分析される条件あたり3ウェル（コントロールのFBSの移行、CS-FBS遊走、浸潤FBS、およびCS-FBS浸潤ならびにFBS移行、非侵襲的な細胞株）を使用して、プレートを標識する。コラーゲンまたはマトリゲルマトリックスを通ると、膜の細孔を通して移動によるPET膜の細孔を通して動き、およびアッセイ侵略によって、アッセイの移行。各セルの状態のために異なる色のマーカーを使用めっきプロセスのid。
4.侵攻マトリックスを分注
- 慎重に浸潤アッセイのために使用されるインサートにコラーゲンマトリックス溶液の75μlのピペット。泡を避けるためには十分注意してください。表面に反転したピペットチップを適用することにより、気泡を分散させる。
- 固化するゲルを可能にするために30分間37℃、5％CO 2インキュベーターにコラーゲンコートインサートプレートに移す。
5.プレート膜または侵入マトリックス上に細胞
- 一方、細胞をトリプシン処理し、10％FBSでメディアを追加する。テーブルトップ遠心機で5分間200×gでスピン細胞と無血清培地中で3回すすいでください。
- 無血清培地中で再懸濁します。血球計数器または自動スライドカウンターで細胞を数える。 5×10 4細胞/ mlの最終濃度になるように無血清培地を加える。
- コラーゲンマトリックスは、（30分後）固化した場合には、いずれかでメディアの700μlのを追加2％を各ウェルにFBSまたはチャコール処理FBSを定義した。プレート当たり12のインサートの：
- 3インサートは、メディアとのコラーゲンと井戸を持っている+ 2％FBS
- 3インサートは、メディアとのコラーゲンと井戸を持っている+ 2％CS-FBS
- 3インサートは、メディア+ 2％FBSとのコラーゲンや井戸がありません
- 3インサートは、メディアとのコラーゲンや井戸を持っていない+ 2％CS-FBS
- テストされている多くの要因に各条件に対応するコラーゲンコントロールで応じて追加のプレートを使用してください。
- すべての遊走および浸潤インサートインサートあたり500μlの細胞を播種、5×10 4細胞/ mlでインサートに細胞懸濁液を加える。
- 37℃で22時間、細胞をインキュベートします。
6.移行と浸潤細胞の数を定量
- 別々のウェルに、メタノール固定液、エオシン、およびヘマトキシリンを使用して、ウェルの染色を設定します。
- 各ウェルから細胞とマトリックスを削除するには綿棒を使用してください。各ウェルのための第二綿棒アプリケーションとRrepeat。
- 鉗子を用いて、各々が連続して3の溶液のそれぞれに1秒間に5回挿入浸す。
- インサートは、O / Nを乾燥することができます。
- どちらのI）エッジの周りを慎重に切断、メスでフィルターを取り外し、カバーガラスとイマージョンオイルをスライド上にマウント、またはii）の挿入がO / Nが反転し、乾燥し、顕微鏡観察のために直接挿入を使用できるようにする。
- 次の日は、20Xの目的で、顕微鏡下でスライドまたは挿入を表示し、フィルタの異なる領域から5の画像を取る。一貫性を向上させるために、4外側のフィールドと1センターを取る。
- ImageJソフトウェアを使用して、すべての条件のために細胞をカウントし、以下の式に適用されます。
- 次のようにパーセントの侵略を決定します。
私は= Aを挿入コラーゲンを通じて浸潤細胞の＃の平均
コントロールインサートを通って移動する細胞の＃= Bの平均
％浸潤=（a / bの）* 100 - 次のように2％のFBSに侵攻インデックスを決定：
（2％FBS）でアッセイされる細胞の％の侵略= C
％（2％FBS）での制御の非侵襲細胞の浸潤= D
浸潤指数（FBS）=の（c / d）の - 次のように2％CS-FBSに侵攻インデックスを決定：
％の（2％CS-FBS）でアッセイされる細胞の浸潤= E
％の（2％CS-FBS）でコントロールの非侵襲性細胞の浸潤= fは
浸潤インデックス（CS-FBS）=の（e / f）と
チャコール処理FBS + X nに合わせて複数の要因とチャコール処理FBSを比較7.実験プロトコール
- 「X」またはコンポーネントの組み合わせのためのさまざまなコンポーネントを使用し、必要に応じて手順を複数回繰り返す。
- 遊走および浸潤効果に対する各要因の寄与「X」を決定するための計算を適用します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
浸潤指数は非侵襲細胞株に対する標準化によれば、各条件について計算される。我々の実験のために、我々は1205Luメラノーマ細胞株確立バリアント安定細胞株我々の侵襲線などと同様1205Lu細胞論理対照として10を誘導された前悪性非侵襲的変異体、WM793を使用する。それは、真皮の主成分であるため、我々はまた、侵略マトリックスとしてコラーゲンIを利用する。これは、最適侵入マトリックスは細胞株および11の結果のin vivoでの一致の度合いに基づいて変化することにより、以前の研究と一致する。この浸潤アッセイは、研究者が取得する可能性のある結果に応じて模式的に概説される。最初は、2％のFBSのための侵入インデックスは、このアッセイ（ 図1＆2）を追求するためにCS-FBSのための侵略指数よりも有意に高いまたは低いことが必要である。重要なINCRの場合緩和または浸潤指数の低下はチャコール処理FBSを含む明らかで、このアッセイは、治験責任医師（ 図2＆3）のために有用ではありません。この増加は、チャコール処理FBSで除去さ...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
腫瘍転移は、多段階プロセスである。細胞は、それらが離れた部位に輸送されている基底膜、リンパ系または血液の微小血管のいずれかにintravasate、を突破しなければならない。腫瘍細胞は、その後滲出とmacrometastasis 12に植民地化する。間葉移行（EMT）、腫瘍の浸潤、および転移に対する上皮を通じて進行はステロイドホルモン13,14によって強化された、成長は15〜18、およびサイトカイン19-21因子 。これらの分子は、腫瘍浸潤能力におけるそれらの役割に対処するためのアッセイの開発は、複雑なシグナル伝達経路を解読するための重要なステップであることを、腫瘍進行のシグナル伝達経路に対処するため、重要である。
それは腫瘍の細胞が移行する先の駆動力を特定することを目的とするので、チャコール処理血清を用いて、このアッセイは、既存の方法よりも有利である。以前のアッセイはあります浸潤チャンバーに通常の原発性線維芽細胞を使用して公開されて。本研究では、著者らは、チャコールのメディアを使用して、細胞が...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者は、ニューヨーク州バッファローのD'Youville College School of Pharmacyからの資金源を認めています。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BioCoat Control Inserts with 8.0 & micro;m PETメンブレン | Corning | 354578 | 12 2枚の24ウェルプレートのそれぞれに12枚入っています。PET = ポリエチレンテラフタレート |
| コラーゲン I, ラットテール | コーニング | 354236 | ソース = ラットテール 腱, 純度 = 90% |
| 固定剤;Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | メタノール系固定剤、ヘマトキシリン/エオシン |
| ウシ胎児血清 | Life Technologies | 16000 | FBS指定 |
| チャコール剥ぎ取りウシ胎児血清 | Life Technologies | 12676 | CS-FBS指定 |
| ウシ胎児血清 | サーモサイエンティフィック ハイクロン | SH30070 | FBS指定 |
| 炭を剥がしたウシ胎児血清 | 「サーモサイエンティフィック ハイクロン | SH30068 | CS-FBSに指定 |
参考文献
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201(2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
