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方法論記事

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法

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DOI:

10.3791/51506

⸱

2014年8月31日

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

HIV-1の病因は、ウイルスの特性と宿主の遺伝的要因の両方によって定義されます。ここでは、gag遺伝子配列の変異がウイルスのin vitro複製能力に与える影響を評価するための再現性のある測定を可能にする堅牢な方法について説明します。

要約

多くのHLAクラスI対立遺伝子のHIV-1の病因と疾患の進行に対する保護効果は、部分的には、HIV-1ゲノムの保存された部分を標的とする能力に起因しています。 細胞性免疫圧に起因する配列変化は、感染中にゲノム全体で発生し、Gagなどのゲノムの保存領域内で見つかった場合、ウイルスのin vitroでの複製能力に影響を与える可能性があります。 GagにおけるHLA関連多型のHLA一致レシピエントへの伝播は、セットポイントウイルス量の減少と関連している。これは、ウイルスの複製能力の低下によるものである可能性があるという仮説を立てました。ここでは、サブタイプCに感染したザンビア人の急性時点から単離されたGAG遺伝子の影響を受けるHIV-1のinvitro複製を評価するための新しい方法を紹介します。 この方法では、制限酵素ベースのクローニングを使用して、GAG遺伝子を一般的なサブタイプC HIV-1プロウイルス骨格であるMJ4に挿入します。これにより、サブタイプC配列の研究には、慢性的に誘導されたgag-pro配列のin vitro複製を評価した以前の組換えベースの方法よりも適切になります。それにもかかわらず、このプロトコルは、他のサブタイプ由来のウイルスの研究のために容易に変更することができます。さらに、このプロトコルでは、CEMベースのT細胞株上のGag-MJ4キメラウイルスの複製能力を評価するための堅牢で再現性の高い方法を詳述しています。この方法は、急性に感染したザンビア人149人のサブタイプCに由来するGag-MJ4キメラウイルスの研究に利用され、複製に影響を与えるGagの残留物の同定を可能にしました。 さらに重要なことに、この技術の実施により、ウイルス複製が設定値のウイルス量や縦方向のCD4+ T細胞の減少など、初期のHIV-1病因のパラメータをどのように定義するかについてのより深い理解が促進されました。

概要

HIV-1病因および疾患の進行に影響を与える宿主およびウイルス両方の特性を決定することは、合理的なワクチン設計のために最も重要である。細胞性免疫応答は、HIV-1感染に対するヒトの免疫応答の重要な構成要素である。細胞傷害性Tリンパ球（CTL）は、急性ウイルス血症の初期制御のために必要であり、ホストが定常状態（セットポイント）ウイルス量1,2を確立することを可能にする。これらのエフェクター細胞の実験的な枯渇は、ウイルスコントロール3,4の損失をもたらす。これにもかかわらず、エスケープ変異は、ウイルス感染細胞5-9のCTL認識を覆すウイルスゲノム内で発生する。

特定のHLA対立遺伝子は、より低いウイルス負荷およびB * 57、B * 27、B * 81の10-15を含む遅い疾患進行と関連している。 HLAクラスI対立遺伝子の保護の利益の一部は、彼らがそのようなGagのようなゲノムの機能的に制約された領域を標的とするという事実に帰することができる及びインビトロ 16-21 で複製するウイルスの能力を減少させ、エスケープ突然変異を選択します。細胞性免疫系からの脱出は、私は対立の選択HLAクラスとの関連でウイルスに有益であるが、これらの変異の効果は、HLAミスマッチ22,23の個人に送信時にホストの差分結果をもたらす可能性がある。そのため、ウイルス複製能力に送信されたHLA-関連したエスケープ変異の影響を理解することは、初期のHIV-1の病因の理解を促進するために重要であろう。

多くの進歩は、私が24〜29の対立遺伝子特異的HLAクラスに関連付けられた個別のエスケープ変異の適応度の欠陥を特定し、特徴づけるために作られているが、天然に存在するHIV-1分離株は、おそらく、HLAから生じる、HLA関連多型のユニークで複雑 ​​な足跡を持っている別の免疫遺伝学的背景30の媒介免疫圧力。 apにrevious分析、Goepfert ら 。 88急性感染ザンビアに由来して送信ギャグ配列におけるHLA関連変異の蓄積がセットポイントウイルス量31の減少と関連していることを示した。これは、HLA-ミスマッチの受信者へのGag特異的で有害なエスケープ突然変異の送信は、臨床的利点を提供し、そしてウイルス複製を弱毒化することによるものであり得ることを示唆した。今後、このような複製能力、および早期の複製が今度は、HIV-1臨床パラメータと後期に影響を与える可能性のある方法として、送信されたウイルスの特性を定義するために協調してどのように動作するか、複雑なギャグ多型の組み合わせ、天然に存在する分離株の中勉強することが不可欠です病因。

ブロックマンらは、最初のサブタイプCとBの感染の両方で慢性期の感染とウイルス量の間に単離さギャグ-プロ配列の複製能力の間のリンクを実証した32-35。これらの研究で示された実験的なアプローチは、慢性的に感染した個体に由来する配列のin vitro複製能力を調べるための適切なものの、困難なサブタイプC急性感染した個体におけるHIV-1複製の能力を研究するいくつかの技術的な注意事項や制限事項があります。この方法は、研究室では、ウイルスストック36を適応、LAVの一部が元になって、サブタイプB NL4-3プロウイルスの中に人口ベースのPCR増幅された配列の組換えに依存しています。ウイルス産生は、PCRアンプリコンとCEM系T細胞株37の同時トランスフェクションによって達成し、デルタのgag-プロ NL4-3 DNAを消化し ​​た。この方法は、潜在的に生体内でのウイルス準種に関連して回収されたウイルス株の本質をゆがめるため、in vitroでの複製能力の測定を変えること、数週間から数ヶ月の期間にわたってウイルスの増殖を必要とします。このメソッドは、私それが効果的に最も高い複製能力を持つウイルスのために選択され、ここで、慢性感染者が多数から多数の異なるウイルス変異株のクローンを作成すると、非常に労働集約的であるため現実的ではない場合には、慢性的に感染した個体を研究するためのより適切だ。しかし、急性感染個体内の、一般的に一から二の変種が存在であり、従って、 インビトロ選択圧を通じて回収されたウイルス株の本質をゆがめる危険性を排除し、in vitroでの複製能力をより正確に評価することができます。第二に、この方法では、サブタイプB派生バックボーンにサブタイプC ギャグ-プロ配列が再結合が必要であり、分析にバックボーンの非互換性の偏りをもたらす可能性があります。により、これらの制限のために、配列の大きな番号が導入された潜在的なバイアスを克服するために分析しなければならない。

ここでは、代替実験的アプロを記述サブタイプC急性感染した個体に由来する配列を研究するための適切なACH。私たちは、サブタイプCプロウイルス骨格、MJ4へのHIV-1サブタイプC感染者の急性感染時点から派生gag遺伝子を導入するために、制限酵素ベースのクローニング戦略を使用しています。 ギャグの遺伝子をクローニングすることで一般的なバックボーンとしてMJ4の使用は、サブタイプC由来配列の分析のために重要である。 MJ4は、一次分離株38から導出され、したがって、原因バックボーンおよびgag遺伝子間のサブタイプの非互換性にバイアスを導入する可能性が低いであろう。また、酵素に基づく制限クローニングを使用してのアプローチは、293T細胞に直接トランスフェクトするプロウイルス構築物について、およびクローン化されたgag配列と同一のクローン性ウイルスストックの回収を可能にする。

以下に提示された方法は、派生ギャグ-MJ4サブタイプCの複製能力を評価するためのハイスループット法であるキメラウイルス。 293T細胞へのトランスフェクションは、簡単であり、ウイルスの回収は、わずか3日かかります。 インビトロ複製能力は、ブロックマンらによって作成された同じCEM-CCR5ベースのT細胞株でアッセイされる。37が、成功した複製に必要な重要なプロトコルの変更を使用して、サブタイプC MJ4キメラウイルスの。むしろPBMCをより適切なT-細胞株の使用は、高いアッセイ再現性試験すべきサブタイプC MJ4-キメラウイルス多数のを可能にする。最後に、上清中のウイルスの定量化のために放射性標識逆転写酵素アッセイを使用して、市販のp24 ELISAキットを使用するよりもコスト効率である。また、同じアッセイ内および分離株の間でのレプリケーションの微妙な違いを検出するためのウイルスを複製し、両方の悪い、高度を検出するために重要であった、より高いダイナミックレンジを与える。

結論として、ここで紹介する方法が可能にしたザンビアからの急性感染した個体のHIV-1サブタイプCから派生ギャグ配列の複製能力の詳細な調査、および書かれたように、他のサブタイプC感染集団を研究するために拡張することができる。異なる分離株のGag間の複製能力のばらつき度が高いが観察された。さらに、当社は送信されたギャグの複製能力とセットポイントウイルス量だけでなく、3年間で39以上のCD4 +の減 ​​少との間の統計的関連性を示すことができた。このような結果は、そのような複製能力としてどのように、送信さウイルスの特性を研究することの重要性を強調初期感染時に病原性に影響を与えるために、宿主の免疫系と相互作用して、効果的なワクチンの介入だけでなく、治療を開発するための一体化されています。

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プロトコル

感染からのHIV-1 gag遺伝子の 1の増幅、凍結血漿

  1. 抽出キットを用いて、HIV-1に感染したプラズマを解凍し、140μlのからウイルスRNAを抽出します。
    1. 可能な場合、直ちにRNA抽出として凍結していないウイルスRNAが最良の増幅結果が得られた後、cDNA合成に進みます。可能な場合は、事前のウイルスRNA抽出を、4℃で第一ラウンドのDNA増幅およびストアのPCRマスターミックスを設定します。
  2. RNAからcDNAを逆転写および逆転写酵素およびワンステップRT-PCRにおける熱安定性DNAポリメラーゼを用いて第一ラウンドのDNA産物を増幅する。
    1. （凍結が必要であった場合）℃の冷凍庫-80℃からRNAを取り出し、簡単に冷たいブロックに配置した後、室温で解凍。マスターミックス45μLを含む各PCRチューブへのRNAの5μlの移転を、50μlの最終容量を得た。直後℃の冷凍庫-80℃に残りのRNAサンプルを置く。
    2. 酵素である後所望の反応の数、各薄壁PCR増幅チューブにアリコート45μlを、1回目のPCRマスターミックス（ 表1A）にdded。サンプル間最小の交差汚染を確実にするために個別のキャップでPCRチューブを使用し、キャップを取り除かないようにしてください。温度感受性RT酵素とRNA鋳型を保護するために、コールドブロックにPCRチューブを配置します。注：サンプルは、適切なウイルス準種をサンプリングするために三連で実行する必要があります。これは、PCR導入誤取り込みを最小限にするために、高忠実度DNAポリメラーゼ酵素を有する生成物を利用することも重要である。推奨される製品のための試薬リストを参照してください。
    3. RNAテンプレートは、すべての反応チューブに添加した後、 表1Bに記載サイクラープログラムを使用して増幅のためのサーモサイクラーにPCRチューブに移す。注：この増幅産物は、2回目のネステッドPCRに使用される。
  3. ネストされたSEを実行しますDNAテンプレートとして最初のラウンドのPCR増幅1μlの（1.2）を使用して、指揮回目のPCR増幅、。
    1. 希望反応の数は、各薄壁PCRチューブに分注し第二回目のPCRマスターミックス（ 表2A）の49μlの。転送各反応チューブに第一ラウンドのPCR増幅からの1μlを50μlの最終体積を得た。注：これは、第二ラウンドの増幅のためのテンプレートとしてのDNAを提供します。これは、PCR導入誤取り込みを最小限にするために、非常に高い忠実度と校正機能を有するDNAポリメラーゼを利用することも重要である。推奨される製品のための試薬リストを参照してください。
    2. 表2Bに記載されたプログラムをサーモして実行するために2回目のPCR反応混合物を転送します。注：プログラムの完了後、この反応の生成物は、生成物の生成を確認するために、アガロースゲル上で泳動される。
  4. 5＆＃に5倍ローディングダイの3μLを追加181;50μlの第二ラウンドの反応体積lのバンドが解決されるまで、UV蛍光DNA染色を含む1％アガロース-TAEゲル上、120Vで動作します。 （ 図1Aを参照）、青色光照明での1.6kbのバンドを可視化。
  5. DNA染色を含む1％アガロース-TAEゲル上の残り45μlの反応量を実行して、きれいなカミソリの刃で、適切なバンドを切除。
    1. 、ヌクレアーゼを含まない水で溶出し、ゲル精製キットを用いてゲルスライスからDNAを抽出する個体ごとに3つの陽性反応を組み合わせ、そしてその後の使用のために-20℃で生成物を凍結する。

必要な制限部位の導入によるクローニングのための2。準備ギャグアンプリコン

  1. ロングターミナルリピート（LTR）MJ4プラスミド/ 5 'UTRの一部を増幅し（ 表3参照）。
  2. 照明装置で1.3キロバイトのPCR産物を可視化、消費税正アンプリコンは、ゲルは、以前のように精製し、凍結記載され（1.4,1.5; 図1Bを参照）。
  3. 「スプライスオーバーラップ伸長「PCR（ 表4参照）を介して融合MJ4 LTR- ギャグアンプリコンを作成します。
  4. （ 図1C参照） を可視化し、消費税、精製し、及び1.4,1.5のように、3.2キロバイトアンプリコンを凍結する。

MJ4、サブタイプC、感染性分子クローンに3クローニング増幅ギャグ遺伝子

  1. 50℃（ 表5aを参照）で、1.5時間のBclI（メチル化感受性）制限エンドヌクレアーゼでMJ4プラスミド1.5μgの精製LTR- ギャグ PCR産物1.5μgのダイジェスト。
  2. 消化反応にNgoMIVでの1μlを加え、1時間、37℃でインキュベートする。
  3. 5倍のローディング色素が反応を消化し、ゆっくりと100 Vの視覚化、消費税で1〜2時間、DNAゲル染色を含む1％アガロース-TAEゲル上で全量を電気泳動すると、以前にDESCとしてクローニングのため、示されたバンドを精製し、制限に追加ribed（ 図2を参照）。
  4. ベクトルの比が1のインサート：3の精製LTR- ギャグインサートとMJ4ベクターDNAを用いて、連結反応を準備します。 4℃で一晩連結反応をインキュベートする（ 表5Bを参照のこと）。
  5. 連結産物をJM109化学的にコンピテント細菌を形質転換および100μg/ mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に広げ、22+時間、30℃で成長する。
    1. 15分間氷上でコンピテント細胞を解凍する。氷上の1.5ml微量チューブと寒さにラベルを付けます。
    2. JM109細胞の一定分量50〜100μlを予備冷却する1.5mlのマイクロチューブ。軽く混合するチューブを軽くはじく、すぐに氷上に戻って、JM109細胞への連結反応の2.5-5を添加する。氷上で30分間ライゲーション産物でコンピテント細胞をインキュベートします。
    3. 熱ショックコンピテントセルと45秒間、42℃のヒートブロック中連結反応を含有し、少なくとも3分間、氷上に戻って1.5mlのマイクロチューブ。
    4. 各マイクロチューブにSOC培地を50μlを追加し、アンピシリン100μg/ mlのを補充し、室温LB-寒天プレート上に全変換反応をめっきする。
    5. 30℃のインキュベーターに20時間放置する、またはコロニー鮮明に形成されるまで転送プレート。
  6. 分離したコロニーをピックアップし、22+時間、30℃で100μg/ mlのアンピシリンを含むLB 4mlに成長する。
  7. 15分間3,200×gで文化をスピンダウンスープを捨てる、プラスミドDNAを抽出します。
  8. 忠実度をクローニングを確認するには、2時間37℃で消化し、二重にNgoMIVでおよびHpaI制限酵素でミニプレップDNAを切断。 1％アガロース-TAEゲル上で分析する（ 表5Cを参照）。
  9. 配列同一性を確認するためにGagInnerF1、GagF2、Rev1は、REV3、およびGagR6（ 表6）：以下のプライマーを用いて、各プラスミドの配列LTR-gagポリ挿入領域。
  10. 人口配列デルで得られたクローニングされた配列を比較する1.5.1からの初期の精製アンプリコンからived。注：これは、最終的に任意のインビトロ複製表現型をクローニングプロセスの間に導入バックボーン誤差に起因しないことを確実にするために、2つの独立したクローンの複製能力を評価することが重要である。

4。発生と複製能力ギャグ-MJ4キメラウイルスの力価測定

  1. プリンスら 39によって記載されているようでFugene HDの1の比率：4を使用して293T細胞に、キメラMJ4プラスミドミニプレップDNAを1.5μgのトランスフェクションすることにより、複製能力のあるウイルスを生成します。
  2. ら 39以下および王子らに記載されているようにTZM-BL細胞上で力価収穫ウイルスストック。
    1. プレートTZM-BL細胞次の日には30〜40％コンフルエントな細胞単層を有するためにウイルス感染の24時間前。これは、通常、24ウェルプレートにウェルあたり800μlの総体積で5×10 4個の細胞を添加することによって達成することができる。
    2. ウェルにセルを追加した後、静かにそして側は効率的に細胞を分配するために左右に、前後に24ウェルプレートを移動させる。渦巻く決して - これはプレートの中心に蓄積細胞になります。
    3. 次の日、DMEM中に1％のFBSを準備。これは、DEAE-デキストランを希釈するために、ウイルスストックを希釈するために使用される。在庫DEAE-デキストランは、10mg / mlまたは125×であり、80 / mlのまたは1xの最終濃度が所望される。
    4. ウイルスストックを取り出しは、室温で解凍するシェーカー上、-80℃の冷凍庫や場所からテストする。
    5. マルチチャンネルピペットを使用して、直列に蓋をし、96ウェルプレートを処理した丸底組織培養においてウイルスストックを希釈する。これは、3倍希釈プロトコルである。希釈スキームについては、表7を参照してください。
    6. 細胞単層を乱さわからないこと、真空吸引器を使用して、播種TZM-BL 24ウェルプレートから培地を除去。一つだけ24ウェルプレートから培地を除去し、細胞がないように、乾燥しない。
    7. 各ウェル千μlのピペットを使用して、DMEM混合物中の1×DEAE-デキストラン+1％FBS150μlのを追加します。これは単分子層を破壊としてリピートピペットを使用しないでください。
    8. 適切なウェルに、各ウイルス希釈の150μlのを追加します。ウェルの中央にウイルスを追加し、均等に細胞単層全体にウイルスを配布するために穏やかに旋回。 37℃で組織培養インキュベーター中で2時間感染細胞をインキュベートし、5％CO 2。
    9. 2時間のインキュベーション後、各ウェルに0.5mlのDMEM、10％FBSを追加し、さらに48時間インキュベーターにプレートを戻す。
    10. 48時間後、細胞を100％コンフルエントであるべきである。 MJ4は、複製コンピテントウイルスであるため、そこにいくつかの細胞死であるが、これは予想されるであろう。
    11. （レシピは、表8Aを参照）、各ウェルから培地を除去し、400 /ウェルの溶液を固定を追加します。一度に一つのプレートに固定してください。千μlのピペットを用いて、定着液を追加し、5分間放置します室温。
    12. 定着液を取り外しおよびCa 2 + / Mg 2+を含むPBSで3回洗浄する。単層の中断を避けるために穏やかにウェルの側にPBSを追加するために噴出ボトルを使用してください。 3回目の洗浄の後、吸収紙にプレートを乾燥ブロット。
    13. 24ウェルプレートの各ウェルに（レシピは、表8B参照 ）を400μl/ウェルの染色溶液を追加し、少なくとも2時間37℃でインキュベートする。より長いインキュベーション時間は許容されますが、インキュベーション時間は、滴定の実験間の一貫性が維持されるべきである。
    14. ウォッシュ2 + / 2 +はMgのCaを含むPBSで2回、感染に得点、以降得点、4℃で、PBSおよびストアを追加。プレートは限り単層が水和維持されるように、最大​​4日間4℃で保持することができる。
    15. 感染のために得点するためには、四分円に24ウェルプレートのウェルを分割する恒久的なマーカーを使用しています。一度で、200倍の総合倍率を使用して、視野内の全ての青色細胞を計数ウェルの四つの象限の各。
    16. 次のように1μl当たりの感染単位を計算します[（＃ブルーセル/ 4）67 X] /（μlのウイルスが追加された）IU /μlの=。各ウェルに加え、ウイルスμlのボリュームについては、表8Cを参照してください。一緒に平均いくつかの井戸。数字は正確な滴定のために比較的類似していなければならない。

インビトロ複製アッセイのためのGXR25細胞の培養培地と伝播の5。準備

  1. GXR25細胞の増殖のために完全RPMI（cRPMI中）を準備します。注：それは少なくとも4ヶ月前に計画された複製実験と文化GXR25細胞にとって非常に重要である（ 表9を参照）。
  2. 分割セル1時10分週2回および1×10 5〜2×10細胞/ mlの間の細胞密度を維持する。

GXR25におけるGag特異MJ4キメラ（CEM-CCR5-GFP）細胞の試験管内複製6.

  1. 私の前日2-3×10 5細胞/ mlの濃度にnfection、分割細胞をそれらが感染の日に対数増殖期にあるように。
  2. 感染当日、℃の冷凍庫解凍-80℃からウイルスストックを取り外します。式を使用して、0.05の感染多重度で5×10 5 GXR25細胞を感染させるためにTZM-BL細胞アッセイからIU /μlの力価に基づいて、各ストックから必要とされるウイルスの量を計算します。
    感染症（μl）のためのウイルスの体積=1μL/ X IUのx 0.05のx50万
    注：これは私たちがテストしたウイルスのすべてのための対数増殖期になるように私たちは、0.05のMOIを選択しました。これは、試験されるウイルス対数増殖をキャプチャするために最適なMOIを決定するために、最初の実験を行うことが重要である。
  3. 及びV-底組織培養のウェルに加える（0.05 MOIを達成するために）を100μlの体積にcRPMI中でウイルスを希釈し、96ウェルプレートを処理した。注：POSITI両方を含める複製実験の各セット内（MJ4 WT感染）と負（モック感染細胞）コントロールをVEの。他のすべての列がウェル間の相互汚染を制限する場合は空白であるように、プレートを設定します。それは、実験の繰り返しの複製速度の尺度である複製の斜面を、正規化するために後で標準として使用されるように、ポジティブコントロールは、不可欠です。
  4. 自動細胞カウンターを用いてGXR25細胞を数える。すべての感染症（5×10 5×＃感染症）の合計に必要な細胞の数を計算します。細胞をペレットに50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に必要なボリュームを分注し。必要以上に常に25％以上の感染症のために計算します。
  5. 培地を吸引慎重かつ5×10 5個 / 100μlの濃度でcRPMI中での再懸濁。
  6. ピペット細胞無菌トラフへと完全に混合する。マルチチャンネルピペットを用いて、希釈したウイルスを含む96ウェルプレートの各ウェルに細胞100μlを加える。ミX徹底的に。
  7. それぞれにポリブレンの5 mg / mlの（100倍）溶液2μlをうまく追加し、徹底的に細胞を混ぜる。
  8. 3時間、5％CO 2で組織培養インキュベーターにおいて37℃でインキュベートする。
  9. 感染した細胞を洗浄するために、遠心分離機96ウェルV底プレートに細胞をペレット化する。その後、慎重に培地を150μlを除去し、細胞ペレットを乱すことなく、cRPMI中の新鮮な150μlのと交換してください。十分に細胞を洗浄する（遠心分離を含む）をさらに2回繰り返します。
  10. 最後の遠心分離および150μlのcRPMI中の添加後、マルチチャンネルピペットを用いて細胞ペレットを再懸濁し、24ウェルの組織のウェル内のcRPMIの各ウェル独立して800μlのからセル全体/ウイルス混合物（約200μl）を追加培養プレート。
  11. 37℃、5％CO 2組織培養インキュベーター中でプレートを置き。
  12. 毎年二日間、培養ウェルの表面から上清100μlを除去し、96ウェルUに転送-bottomプレート及びストアはウイルス定量アッセイを実行するまで-80℃で凍結した。 NOTE：96ウェルプレート中の上清を注意深く配置は、放射性標識、逆転写酵素（RT）アッセイを介してビリオンの定量時の培養上清のマルチチャンネルピペットの転送を可能にする。すべてのプレートをRTアッセイの読み出しにプレート間の変動を正規化するために、感染症の標準からのサンプルが含まれている必要があります。
  13. 徹底的に細胞を再懸濁し、残りの容量（450μl）をの半分を除去することにより、2：各100μlのサンプル、スプリットセル1を除去した後。各ウェルに新鮮なcRPMI中の550を添加することにより、元のボリューム（1ミリリットル）を復元します。

細胞培養上清中の逆転写酵素（RT）の7分析

議定書は、オストロウスキーら 40から適応。

  1. 放射性物質で使用するためのBSL-3施設で生物学的安全フードをセットアップします。
    1. ホーに吸収紙を置きます放射性の使用のために指定された吸引器のための吸引器を開発し、交換してください。注：すべての放射性廃棄物が適切に安全規則に従って一緒に廃棄しなければなりません。
  2. RTマスターミックスの各1ミリリットルアリコートに[33 Pα-]のdTTP 10 mCiの/ mlおよび1 Mジチオスレイトール（DTT）の4μlと1-2μlを添加した（ 表10およびオストロウスキーら 40を参照）。
  3. 慎重に無菌トラフ1,000μlのピペットと転送にRTマスターミックス、DTT、および[33 Pα-] dTTPをそれぞれ1.5mlのマイクロチューブを混ぜる。
  4. 標識されたRTの25μlを96ウェル薄壁PCRプレートの各ウェルに分注する混ぜる。注：ポジティブコントロール（MJ4 WT感染症）および陰性対照（モック感染症）のためのスペースを含めます。
  5. RTマスターミックスを含むPCRプレートに各上清の5を添加する。
  6. 接着ホイルカバー付きPCRプレートを密封し、サーモサイクラー中で37℃で2時間インキュベートする。安全上の理由から、りんAmphylとSEピペットチップおよびそれ以降の放射性廃棄物で処分されるAmphyl廃棄物を含む小さなコンテナ内のヒントを、廃棄してください。
  7. インキュベーション後、200μlのマルチチャンネルピペットを用いてホイルカバーに小さな穴を作る。注：ピペットチップは、ウェル内の液体に触れた場合は、次の列または行に移動する前にチップを交換してください。
  8. DE-81紙にサンプルを5倍、転送の各サンプルを5μlのを混ぜる。空気を10分間乾燥する。
  9. ウォッシュブロットを1×SSC（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）した後、洗浄あたり5分間で90％エタノールで2回で5倍。空気乾燥させます。
    1. そのようなサンドイッチ収納ボックスとして、別個の洗浄容器内の各ブロットを置き、ブロットをカバーし、5分間振とうするのに十分な洗浄バッファー（1×SSCまたは90％エタノール）を添加する。
    2. 別の容器繰り返しに洗浄バッファーをオフに注ぐ。注：最初の3回の洗浄が放射性であると考えられ、適切に処分する必要があります。最後の2回の洗浄を定期的に処分することができる。
  10. 乾燥したら、車efullyサランにおけるブロットラップし、室温で一晩密閉カセットにphosphoscreenに公開折り返す。
  11. ホスホイメージャとphosphoscreensを分析し、放射性転写産物を定量化する。
  12. OptiQuantソフトウェアを使用して、各放射性シグナルの周りに円を描きます。複製曲線を生成するためにデジタルライトユニット（DLU）の値をグラフ化。
  13. 複製能力のスコアを生成するために、DLUの値はログ10 -transformedであり傾きが2,4、および6の時点曜日を用いて計算した。レプリケーションの斜面は、その後複製能力スコアを生成するために、WT MJ4の傾きで割る。これは、アッセイ内変動性を低減するために、同じRTプレートから得MJ4 WT値に基づいて正規化することが重要である。

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結果

適切に完全に機能する、感染性のギャグ-MJ4キメラを組み立てることのできるプロウイルスプラスミドを作成し、このプロトコルを、実行するために、細心の注意は、適切なPCRアンプリコンを生成するように注意しなければならない。 PCRは適切なサイズのギャグアンプリコンを生成したかどうかを決定することは非常に重要です。製品は、 図1（a）に示した約1700 bpのアンプリコンの100塩基対（bp）の範囲内である必要があります。この断片の正確な長さは、研究中のgag遺伝子に依存して変化する。次に、MJ4分子クローンの5 '末端反復配列（LTR）の部分は、その後のクローニングに適するようにするために増幅され、 ギャグリコンにスプライスされている必要があります。 MJ4 LTRアンプリコンは長さが1474塩基対であるべきである。 図1Bは、正しいバンドサイズが適応される代表的なゲル画像を示す。スプライスオーバーラップ伸長PCRの41後、合わせLTR- ギャグの製品は次のようになります<...

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ディスカッション

により長さとこのプロトコルの技術的な性質のために、キメラギャグ-MJ4プラスミドの構築の成功の両方のためだけでなく、ウイルス複製能力の定量化のために重要である、いくつかのステップがあります。このプロトコルで概説MJ4への外来ギャグ遺伝子の導入のための制限酵素ベースのクローニング戦略は以前に使用され再結合に基づく方法に対して多くの利点を有しているが、重要なステップを正確に従わない場合、プロトコルは、技術的に挑戦することができます。

まず、DCMおよびダムDNAメチラーゼを欠くコンピテント細菌株において生成されたMJ4プラスミドDNAを使用することが必要不可欠である。 MJ4骨格にギャグの遺伝子をクローニングするために使用されているのBclI制限エンドヌクレアーゼの酵素活性は、敏感なダム/ DCMのメチル化であるとして、これが必要です。 JM110及びSCS110（endAの負JM110誘導体）E.大腸菌株非メチル化MJ4プラスミドDNAを生成するのに適して再。さらに、ベクターおよびインサートバンドの切除のために、それは非常に青色光...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

調査員は、この研究に参加したザンビアのすべてのボランティアと、この研究を可能にしたルサカのザンビアエモリーHIV研究プロジェクトのすべてのスタッフに感謝します。研究者は、技術支援とサンプル管理について、Jon Allen、Smita Chavan、Mackenzie Hurlstonに感謝します。また、Mark Brockman博士の議論とGXR25細胞の寛大な寄付

に感謝します。

この研究は、R01 AI64060とR37 AI51231（EH）および国際エイズワクチンイニシアチブによって資金提供されました。この作業は、米国国際開発庁 (USAID) を通じた米国民の寛大な支援によって部分的に可能になりました。内容は研究著者の責任であり、必ずしも USAID または米国政府の見解を反映しているわけではありません。この研究は、エモリーエイズ研究センターのウイルス学コア(Grant P30 AI050409)によっても部分的に支援されました。DCとJPは、Action Cycling Fellowshipsによって部分的に支援されました。 この研究は、ヤーキス国立霊長類研究センターの助成金(2P51RR000165-51)によって部分的に支援されました。このプロジェクトは、National Center for Research Resources P51RR165によっても部分的に資金提供を受けており、現在はOffice of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PCR Reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, 標準脱塩
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, 標準脱塩
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, 標準脱塩
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, 標準脱塩
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, 標準脱塩
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, 標準脱塩
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTATTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNAカスタムオリゴ25 nmol、標準脱塩
GagF2:5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNAカスタムオリゴ25 nmol、標準脱塩
For3:5' CTAGGAAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNAカスタムオリゴ25 nmol、標準脱塩
GagR6:5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNAカスタムオリゴ25 nmol、標準脱塩
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, 標準脱塩
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCCA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, 標準脱塩
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Nuclease free waterFisherSH30538FSHyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap)DaiggerEF3647BX
SuperScript III ワンステップ RT-PCR システムLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA polymeraseFisherF-549L
PCR Nucleotideミックスロシュ4638956001
アガロース、高ゲル強度フィッシャー50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
プロメガ 1 kb DNA ラダーフィッシャーPRG5711プロメガ
Sybr 製 Safe DNA ゲル染色、10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
ウィザード SV ゲルおよびPCRクリーンアップシステムPromegaA9282
ミソリの刃、片刃のフィッシャー12-640設計
サーモサイクラー、PTC-200MJリサーチ
微生物学&によって製造クローニング試薬
LB 寒天、MillerFisherBP1425-2
LB Broth、LennoxFisherBP1427-2
滅菌済み 100 x 15 mm ポリスチレン シャーFisher08-757-12
アンピシリンナトリウム塩Sigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml ポリプロピレン丸底チューブBD Biosciences
NgoMIV制限エンドヌクレアーゼニューイングランドバイオラボR0564L
BclI制限エンドヌクレアーゼニューイングランドバイオラボR0160L
HpaI制限エンドヌクレアーゼニューイングランドバイオラボR0105L
T4 DNAリガーゼ、5 U/μlロシュ10799009001
JM109 コンピテントセル、>108 cfu/μgPromegaL2001
PureYield プラスミド ミニプレップ システムPromegaA1222
Safe Imager 2.0 ブルーライト トランスイルミネーターInvitrogenG6600
Microfuge 18 遠心分離機Beckman Coulter367160
Cell Culture Reagents
Amphyl クリーナー/消毒剤フィッシャー22-030-394
Fugene HD、1 mlVWRPAE2311Promega
臭化ヘキサジメトリン (ポリブレン)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plates、6 ウェル、フラットフィッシャー07-200-83Corning Life
Costar Plates、24 ウェル、フラットフィッシャー07-200-84Corning Life 製
コスタープレート、96ウェル、丸型フィッシャー07-200-95コーニングライフ
フラスコ製造、コーニングフィルタートップ/カントネック、75 cm2フィッシャー10-126-37
フラスコ、コーニングフィルタートップ/カントネック、150 cm2フィッシャー10-126-34コーニングライフ
コニカルチューブ、50 ml、ブルーキャップフィッシャー14-432-22BD Biosciences
コニカルチューブ、15 ml、ブルーキャップフィッシャー14-959-70CBD バイオサイエンス社製
トリプシン-EDTAフィッシャーMT25052CIメディアテック
製 RPMI、500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM、500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン、100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS、マグネシウムとカルシウム、500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS、マグネシウムとカルシウムを含まないLife Technologies/Invitrogen20012-050
Sarstedtチューブ、アソートカラーSarstedt72.694.996
リザーバートレイマルチチャンネル、55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Corning 96 well clear V bottom tissue culture treated microplateFisher07-200-96Manufactured by Corning Life
HEPES, 1 M Buffer SolutionLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, Defined, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941Promega
グルタルアルデヒド、グレード II、H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M 塩化マグネシウム溶液Sigma-AldrichM1028-100ML
ホルムアルデヒド溶液、分子生物学用、36.5%Sigma-AldrichF8775-500ML
カリウムヘキサシアノフェレート(II) 三水和物Sigma-AldrichP9387-100G
ヘキサシアノフェレートカリウム(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Allegra X15-R 遠心分離機Beckman Coulter392932
TC10 自動セルカウンターBio-Rad1450001
VistaVision 倒立顕微鏡VWR
逆転写酵素定量アッセイ試薬
dTTP, [&α;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0Life Technologies/Invitrogen15568025pH 7.8 に調整する必要があります
1 M 溶液
0.5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Poly adenylic acid (Poly rA) potassium salt ミッドランド試薬株式会社P-3001
オリゴ d(T) プライマーLife Technologies/Invitrogen18418-012
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, 超解像蛍光体スクリーン, 小型パーキンエルマー7001485
コーニング Costar サーモウェル 96-well プレートモデル (M) ポリカーボネートフィッシャー07-200-245コーニング生命社製
コーニング96ウェルマイクロプレートアルミニウムシーリングテープ、非滅菌フィッシャー07-200-684ニングライフ
DE-81アニオン交換紙Whatman3658-915
エン酸三ナトリウム二水和物グマアルドリッチS1804-1KG
塩化ナトリウムフィッシャーS671-3
オートラジオグラフィーカセットフィッシャーFB-CA-810
サイクロンストレージリンショウスクリーンパッカード
カ外科レ 352059 KOH 2 M 塩化カリウム (KCl AM9640G) で コー製クシ

参考文献

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