二光子 in vivoで間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

Summary

生きている動物の

Time-lapse imaging は、無傷の脳の構造的再編成に関する貴重な情報を提供します。ここでは、2光子顕微鏡法により、生きたマウス皮質の蛍光標識シナプス構造の経頭蓋イメージングを可能にする薄鼓頭蓋骨製剤を紹介します。

Abstract

哺乳類の大脳皮質では、神経細胞がシナプスで非常に複雑なネットワークや情報交換を形成している。シナプス強度、ならびにシナプスの追加/削除の変化は、神経可塑性の構造的基礎を提供する、経験依存的な様式で起こる。大脳皮質で最も興奮性シナプスのシナプス後構成要素として、樹状突起棘はシナプスの良いプロキシであると考えられている。マウス遺伝学および蛍光標識技術、個々のニューロンのシナプスの構造およびそれらの撮影の利点は、無傷の脳内で標識することができる。ここでは、 生体内での経時的蛍光標識後シナプス樹状突起棘に追従する二光子レーザー走査顕微鏡を用いて、経頭蓋撮影プロトコルを導入する。このプロトコルは、完全な頭蓋骨を保持し、髄膜および皮質の曝露によって引き起こされる炎症作用を回避間引き頭蓋骨の準備を利用する。そのため、画像はSUの直後に取得することが可能rgeryが実行されます。実験手順は、数時間から数年の範囲の様々な時間間隔で繰り返し行うことができる。この調製物の適用はまた、生理学的および病理学的条件下で、異なる皮質領域、層、ならびに他の細胞型を調査するために拡張することができる。

Introduction

哺乳類の大脳皮質は、知覚と運動制御から抽象情報処理や認知に、多くの脳機能に参加しています。種々の皮質の機能は、個々のシナプスで情報を通信し、交換する異なるタイプのニューロンから構成されている異なる神経回路上に構築。シナプスの構造および機能は、一貫して経験や病状に応じて変更される。成熟した脳では、シナプス可塑性、機能性神経回路の形成と維持に重要な役割を果たして、両方の強さが変化し、シナプスの追加/削除の形をとる。樹状突起棘は、哺乳類の脳における興奮性シナプスの大多数のシナプス後要素である。一定の売上高および棘の形態学的変化は、シナプス結合^1-7において変更が良い指標となると考えられている。

二光子レーザー走査マイクロSCOPYは厚く、不透明な準備と、無傷の脳⁸でのライブイメージングのために適しています、低光毒性を通じて深い浸透を提供しています。蛍光標識との組み合わせでは、2光子イメージングは​​、生きている脳に覗くと、高い空間分解能と時間分解能を有する個々のシナプスにおける構造的な再編成を追跡する強力なツールを提供しています。様々な方法がライブイメージングのために^9-13匹のマウスを作製するために使用されている。ここでは、マウスの皮質におけるシナプス後樹状突起棘の構造的可塑性を調べるためのin vivo二光子イメージングの間引き頭蓋骨の調製を記載する。このアプローチを使用して、我々の最近の研究で....

Protocol

承認は、手術およびイメージング調査の開始前にホーム機関から取得する必要がある。この原稿に記載された実験は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校施設内動物管理使用委員会からのガイドラインと規則に従って行った。

1。手術

1. すべての手術器具をオートクレーブ徹底的に手術前に70％アルコールでワークスペースを殺菌。
2. KX麻酔溶液（200 mg / kgのケタミンおよび20 mg / kgのキシラジン）の腹腔内（IP）注射によりマウスを麻酔マウスの体重に応じて注：KXの投与量は、健康状態は、歪み、年齢に応じて調整されてもよく、マウスの。最適な用量を決定するために獣医の相談にもお勧めします。
3. マウスの足の指を押し、麻酔の状態を監視するために反射的応答を確認することにより、定期的につま先のピンチテストを実行します。マウスが完全に手術を開始する前に麻酔をかけていることを確認してください。長時間のイメージングセッション中、必要に応じて追加のKXを管理、定期的に、マウスの麻酔状態を確認してください。
4. 手術中体温を維持するために、加熱パッドの上にマウスを置く。
5. 頭皮を露出させるためにカミソリの刃を使用して、マウスの頭部を剃る。
6. アルコールパッドとベタジン交互で皮膚を拭いて剃毛面積を殺菌。残留髪の切り抜きを削除し....

Results

YFP-Hラインマウス²⁵で、黄色蛍光タンパク質は、皮質の表層への先端樹状突起を投影V層錐体細胞のサブセットで表現しています。間引き頭蓋骨の製剤を介して、蛍光標識された樹状セグメントは、繰り返し時間から数ヶ月の範囲の、種々の撮像間隔で二光子顕微鏡で画像化することができる。ここでは、個々の棘だけでなく、糸状仮足は明らかに樹状突起に沿って可視化することができる1ヶ月のマウスの運動皮質での8日間の同じ樹状突起の4時間イメージングの一​​例を示す。通常、画像スタックの深さは約100〜200μmの軟膜表面からである。種々の分析は、これらの画像に基づいて行うことができる。例えば、スパイン形成、脱離および代謝回転は、異なるセッションからの画像を比較することによって定量することができる。棘密度はdendritの長さによってスパインの数で割ることによって計算することができる。ICセグメント。脊椎の運動性および形態の変化も分析することができる。

Discussion

成功間引き頭蓋骨の準備を取得するには、このプロトコルにはいくつかのステップが重要である。 1）頭蓋骨の厚さ。頭蓋骨は、高密度緻密骨と低密度海綿骨の中間層の2層、サンドイッチ構造を有する。高速マイクロドリルは緻密骨と海綿骨の外側の層を除去するのに適しているが、顕微ブレードは緻密骨の内側の層を薄くするのに最適です。開発中に頭蓋骨の厚さが増加すると剛性ように、成体マウスのイメージングは​​、良好な品質の画像を得るために除去するより多くの骨を必要とする。薄くなった領域は、透明な固体の外観を示し、頭蓋骨の厚さは約20〜30程度である場合に、良好な画像品質を提供します。オーバー間伐は、その後の再イメージングセッションで間引き処理を困難にするように頭蓋骨の厚さは間引き処理中に定期的にチェックする必要があります。 2）薄くなった領域のサイズ。これは、円錐状の空洞が達成され、安定した間引き頭蓋骨の構成を確立することが重要である。適当な大きさに薄くなった領域のアーキテクチャは、大脳皮質の損傷を引き起こし、その後の再イメージングセッションで間伐ができます防ぐことができます。それは、一番上の開口部（直径約0.5〜1.0ミリメートル）よりも小さい薄くなった領域の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ケタミン	バイオニッチファーマ	67457-034-10	麻酔用キシラジンと混合
キシラジン	ロイド研究所	139-236	麻酔用ケタミンと混合
生理食塩水	ホスピーラ	0409-7983-09	0.9%NaCl注射およびイメージング用
カミソリの刃	電子顕微鏡科学	72000	両刃ステンレス鋼のカミソリの刃
アルコールパッド	フィッシャーサイエンティフィック	06-669-62	滅菌アルコール調製パッド
眼軟膏	ヘンリー・シャイン	102-9470	ワセリン眼軟膏 滅菌眼潤滑剤
高速マイクロドリル	ファインサイエンスツール	18000-17	高速マイクロドリルは、コンパクトな骨の外層を薄くし、小さな領域をターゲットにするのに適しています
マイクロドリルスチールバリ	ファインサイエンスツール	19007-14	直径1.4 mm
顕微手術ブレード	Surgistar	6961	顕微手術ブレードは、海綿状骨の密骨と中層の内層を薄くするのに適しています
シアノアクリレート接着剤	フィッシャーサイエンティフィック	NC9062131	頭蓋骨にヘッドプレートを固定
縫合	糸 Havard 装置	510461	非吸収性、滅菌シルク縫合糸、6-0モノフィラメント
解剖顕微鏡	リンパス		SZ61
CCDカメラ	インフィニティ
二光子顕微鏡	プレーリーテクノロジー		ズ ウルティマIV
10倍対物レンズ	オリンパス	NA 0.30、空気
			NA 1.1、IR透過性、水浸
チタンサファイアレーザー	Spectra-Physics		醍醐味HP