方法論記事

簡体字を使用した初期の器官形成の理解

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DOI：

10.3791/51526

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2015年1月12日

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

この記事について

サマリー

Xenopus laevisの胚は、その大きなサイズと操作の容易さから、初期発生の研究において非常に有用であり続けています。 このモデルシステムにおける特定の臓器の同定に使用できる、全マウントin situハイブリダイゼーションプロトコルの簡略化されたプロトコルが提供されています。

要約

器官形成は、器官がどのように特定され、その後、発生中にその特定の形状と機能を獲得するかの研究です。 Xenopuslaevis胚は、その大きなサイズにより、器官形成の最も早い段階で臓器を特定するのに非常に適しているため、器官形成の研究に非常に役立ちます。 現時点では、特定の臓器または原基を同定するために使用される主な方法は、目的の臓器で発現する遺伝子に特異的な標識アンチセンスRNAプローブを用いた全マウントin situハイブリダイゼーションです。 さらに、Xenopusでは遺伝子やシグナル伝達経路を操作することが比較的容易であり、in situハイブリダイゼーションにより、標的臓器の存在や形態の変化をアッセイすることができます。 Whole mount in situハイブリダイゼーションは、多くのステップを伴う数日間のプロトコルです。 ここでは、ルーチンアッセイに適した、使用するステップ数と試薬の数を減らした簡略化されたプロトコルを提供します。 In situハイブリダイゼーションロボットはプロセスを非常に容易にし、その技術をプロセスでいつ、どのように活用するかについて詳しく説明します。 in situハイブリダイゼーションが完了すると、結果の最良の画像をキャプチャすることはイライラする可能性があります。 in situハイブリダイゼーション結果のイメージングを最適化する方法についてアドバイスを提供します。 このプロトコルでは、Xenopus laevisの器官形成の評価が説明されていますが、同じ基本プロトコルがXenopus tropicalisや他のモデルシステムにもほぼ確実に適応できます。

概要

特定の遺伝子の発現パターンは、特定の臓器や細胞タイプの発達におけるその遺伝子の潜在的な役割を決定する重要な情報です。 簡単に言えば、適切なタイミングと場所で表現されなければ、重要な役割を果たす可能性は低いです。 Xenopusでは、ほとんどの初期胚と同様に、遺伝子の発現を検出するために最も一般的に使用されるアッセイは、標識アンチセンスRNAプローブを用いた全マウントin situハイブリダイゼーションです。 Xenopusの遺伝子発現を評価するための抗体染色の使用は、研究者がXenopusの相同体に交差反応するか、または独自の1-3を生成する抗体(通常は哺乳類タンパク質に対して産生される)を発見するにつれて、より一般的になっています。 しかし、Xenopusの器官形成に関する研究の大部分は、依然としてアンチセンスRNAプローブを利用しています。 抗体を使用する場合、個々の抗体ごとに一次抗体の濃度や固定プロトコルの最適化が必要になることがよくあります。対照的に、in situハイブリダイゼーションのプロトコルは、プローブごとに基本的に不変です。 基本的な概念は比較的単純で、優れた標準プロトコルが確立されています4。 私たちのプロトコルは、元のプロトコル4の合理化されたバージョンであり、初期胚の遺伝子発現パターンの優れた検出を提供します。 胚を固定し、次いで、標識されたアンチセンスRNAプローブの標的mRNAへの高いストリンジェンシー結合を可能にするように溶液および温度を変更することにより、ハイブリダイゼーションのために準備する。 結合していないプローブを洗い流し、次に胚をRNAプローブ上の標識に対する抗体の結合のために準備します。 次に、過剰な抗体を洗い流し、酵素による色反応を使用して、RNAプローブが胚内で結合している場所を特定します。 現在、特定の組織における蛍光タンパク質の発現を促進するXenopusトランスジェニック株が多数存在しており、これらはウッズホールのNational Xenopus ResourceなどのXenopusストックセンターで入手できます。 生きた胚の器官形成を調べる必要がある多くの実験に非常に役立ちますが、このオプションではトランスジェニック系統に別のハウジングが必要です。

In situハイブリダイゼーションは、初期胚のどこに特定の器官や細胞タイプが形成されるかを明確に示すことができます（図1）。この技術は、単一の胚5の少数の細胞で遺伝子発現を検出できることを考えると、非常に感度が高いです。 しかし、比色染色の強度を用いたin situハイブリダイゼーションは、色反応が線形反応ではないため、定量化可能とは見なされません。 染色強度の定量化は困難ですが、発現の変化はしばしば非常に顕著です。特に、in situハイブリダイゼーションが発現ドメイン6,7のサイズに定量化可能な増加または減少を示す場合。

全マウントin situハイブリダイゼーションの明らかな利点は、初期発生の研究において重要なアッセイとなっています。 しかし、それは数日にわたって多くのステップを必要とする時間のかかるものです。 このプロトコルは、標準プロトコルの簡易版であり、in situ結果の品質を低下させることなく、いくつかのステップを排除します。 また、この簡素化により、ばらつきの原因が排除され、in situハイブリダイゼーションが最適でない場合のトラブルシューティングが容易になります。 具体的には、胚のプロテイナーゼKおよびRNAse処理の使用を排除しましたが、これは試薬の品質に依存する可能性があり、やり過ぎるとシグナル強度を低下させる可能性もあります。 また、このプロトコルは、複数の試薬の使用を排除するため、ある程度のコスト削減も実現します。 最後に、このプロトコルは、in situハイブリダイゼーション結果の画像のキャプチャを改善するためのいくつかの簡単なガイドラインも提供します。 このプロトコルはXenopus胚での研究に最適化されていますが、少なくとも一部の簡略化は、他の胚系でのin situハイブリダイゼーション研究に適用できる可能性があります。

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プロトコル

1.胚の準備

  1. 胚培養、pH8.0の固定前8に2.5％のシステインを使用して、デゼリー胚の一部として日常的に行われていない場合。それは絶対に必要ではありませんが、手動で微鉗子を用いて固定前に受精エンベロープを削除するには、それが便利です。
    1. 胚を転送するためにガラスパスツールピペットを使用してください。ピペットはそう胚をピックアップするのに十分な幅の点でガラスピペットをカットするダイヤモンドペンを使って胚を転送するのに十分な幅ではありません。シャープなエッジを溶融するために迅速にブンゼンバーナーの炎を通してカットチップを渡すことで、切断した後、ピペットのシャープなエッジを排除します。
      注：ガラスはまだそれが目視で冷却されているように見えても火傷を引き起こすのに十分熱くなっていることなどの注意が必要がある。
  2. 段階的に胚の固定を実行します。まず、胚固定で使用するためのガラスバイアルを準備します。最終含むすべてのステップのためにこれらのバイアルを使用してくださいストレージ。プロセスのすべてのステップの間、胚を監視するためにできるように、ふたに優れたテフロンシール付きクリアされているバイアルを使用してください。恒久的なマーカーを使用して、適切な実験情報とバイアルにラベルを付け、その後にも恒久的なマーカーによるアルコールおよび他の溶媒の使用手順の過程で失われてしまうように、明確なテープでラベルをカバーしています。
    1. 胚を修正するMempfaを使用してください。一度に50〜100ミリリットルのバッチで8％パラホルムアルデヒドの株式を行います。溶液中にホルムアルデヒドを得るために必要とされる50〜60℃に必要なH 2 Oと熱の約75％を使用してください。
      注：このソリューションは、それがホルムアルデヒドではなく、パラホルムアルデヒドを利用していることにMemfa古い公開されたプロトコルのバージョンで使用されるよりも若干異なります。
    2. 10N NaOHを2〜3滴を追加したり、pHが約7.5（使用pH試験紙pHをチェックする）である。パラホルムアルデヒドは毒性が非常に強いので、ヒュームフード内原液を生成する。パラ一度ホルムアルデヒドは、新鮮な容器の中にワットマン紙を通して溶液を濾過し、最終体積にH 2 Oを追加し、溶液中にある。必要に応じて、1〜2週間、4℃でパラホルムアルデヒド溶液を保存する。
    3. Mempfaの固定液（ 表1）の残りのコンポーネントを組み立てます。パラホルムアルデヒドの最終的な作業濃度は4％であることを確認してください。ストックとして4℃で固定液のすべてのコンポーネントを格納します。
    4. カットガラスピペットを用いて、Mempfa溶液（ 表1）の約3~4 mlの満たされた標識されたガラスバイアルに胚を追加することによって、胚を固定する。バイアルあたり以上の20〜30の胚を固定しないでください。胚培地から液体転送を最小限に抑えて胚を追加します。室温で2時間または4℃で一晩のためにMempfa溶液中の胚を固定してください。
    5. 後半内胚葉構造については、手動で孤立した腸および内胚葉デリバティブ9,10に原位置で行う、プローブの良好な浸透を可能にし、また空洞染色を回避する。
    6. -20℃で100％メタノールの溶液を保管してください。パラホルムアルデヒド固定した後、約4ミリリットル-20℃で、胚を保存するための100％メタノールとMempfa液を交換する。
    7. ガラスまたは他の胚に付着胚を防止するためにメタノールを添加した後、バイアルを旋回させる。また、緩い場合、メタノールは時間をかけて冷凍庫で蒸発することができるので、バイアルを密封していることを確認してください。
      注：胚のin situハイブリダイゼーションの品質を損なうことなく、染色の前にメタノール中で、おそらく長い少なくとも1年間保管することができる。

2.プローブの準備

  1. ジゴキシゲニン標識プローブを作るために鋳型DNAの1〜2μgのを使用してください。股関節のための適当な制限酵素で目的の遺伝子の5 '末端に適当なDNA配列を含むプラスミドをカットアンチセンスプローブを生成するためにトンベクター。
    注：このプラスミドは、適切なRNAポリメラーゼ結合部位（ 例えば、T7、T3、またはSP6）を有するべきである。
  2. DNA、水、NTPミックスおよびポリメラーゼ緩衝液がプローブ合成反応を組み立てる前に室温に温める。 表2に記載されている順序での1.5mlマイクロ遠心チューブにRNA合成反応の成分を加える。水の量を調節することは、20μlのプローブ合成反応の全量を添加した。ポリメラーゼ緩衝液の成分が高濃度と寒いとき、テンプレートDNAを沈殿させることができるので、室温で反応を組み立てる。
  3. 37℃で2時間転写反応をインキュベートする。
    注：2時間よりも少し長いのインキュベーションは悪影響なしにつながるだけでなく、少し収量の増加を示している。 1時間インキュベートした場合、収率は減少したが、良好なプローブを作ることが依然として十分であろう。
    1. 仕上げに転写反応を待っている間、プローブの品質をテストするために使用されるアガロースゲルを作る。 1×TAE緩衝液100ml中のアガロースを1μgを溶融沸点まで溶液を加熱することにより（ 表1参照）。アガロース粉末が完全に溶解したときに熱からソリューションを削除します。
    2. アガロースは、紫外線（UV）光下でRNAの可視化を可能にするために約60℃に冷却したときに、約100mlのアガロースゲルを2μlのエチジウムブロミドストック溶液（10mg / ml）を加える。
      注：将来のゲルを繰り返し溶融することなく注ぐことができるように、このアガロースゲル溶液を60℃のインキュベーター中に保持することができる。潜在的な毒性によるエチジウムブロマイドの取り扱いに注意してください。
  4. テンプレートDNAを除去するために37℃でさらに10分間、2時間のインキュベーション後に転写反応に1μlのDNアーゼI（RNアーゼフリーグレード）を添加し、インキュベートする。
  5. に反応ミックス1μlのを削除TEバッファー（10 mMトリスpH8.0,1mMのEDTA）、5M NH 4アセテート10μlの、そして220μlの1％SDSの80μlを添加する1％アガロースTAEゲルで、残り（20μL）に確認してください冷エタノールの。ボルテックスで激しく混合し、RNAの品質チェックの結果が判明するまで氷上に取っておく。
    1. 1％アガロースTAEゲル上での析出する前に除去RNAの1μlのを実行します。ゲル上にロードを容易にするために、RNAへの水の4-5μLと標準ローディング色素の1μlを添加する。 （説明を参照してください）​​、プローブの品質をチェックするために、UV光トランスイルミを用いてゲル上でRNAを表示します。
  6. 10から15分間フルスピードで微量紡糸してステップ2.5で氷の上に放置した残りのRNAを沈殿さ。引き出されたガラスピペットで上清を描画し、簡単に乾燥させます。
    1. エッペンドルフチューブ中のRNAハイブリダイゼーション緩衝液1ml（ 表1）を用いてプローブを再懸濁する。ボルテックスとBRiefly再び37℃、ボルテックスにチューブを加熱する。 15mlをキャップポリスチレンスクリュー管にプローブ溶液を移し、RNAハイブリダイゼーション緩衝液7-10 mlに満たす。注：プローブは、多くの場合、低バックグラウンドで結果が、染色反応にも時間がかかります（10倍、さらに希釈がまだ働くことができる）をさらに希釈することができる。

in situハイブリダイゼーション 3.

  1. -20℃のメタノール中で保存した胚を取り、室温に温める。ガラスバイアルに全体の手順を実行します。 1グループとは異なる胚が異なるプローブによって見しようとしている場合は、プローブは初日にばらつきや労力を軽減するために追加される直前まで単一バイアルに保管してください。
    1. 表3に概説されるように、プローブの添加のための調製において（洗浄レシピについては表1を参照）のメタノール一連の胚を再水和する。静かにエンブリーを旋回各変更後のOSは、彼らが側面またはお互いに付着していないことを確認し、旋回装置にバイアルを装着することにより胚を岩に。液体を転送する場合、胚がそこに閉じ込められていないことを確実にするためにキャップの内部を確認してください。
    2. 表3に記載したように、一度プローブ溶液で、一晩胚をハイブリダイズする。
  2. プローブ溶液を除去します。 15mlに格納することによって使用されるプローブを保存は-20℃での日付とプローブが使用された回数でマークキャップポリスチレンチューブを、スクリュー。
    NOTE：比色反応は、所望の強度を達成するために異常に長い時間がかかり始めるまで同じプローブはin situハイブリダイゼーション 、その後のために何度も再利用することができる。
    1. プローブが除去されると、 表4に概説する一連の洗浄を通してプローブに対する抗体染色のための胚を準備する。トンを移動させることである（ 表4）必要に応じて温度を変更する彼旋回装置、直接適切な温度に設定されているハイブリダイゼーションオーブンに、添付の胚のバイアルと。
    2. 抗体の前に添加することによってブロックされるように、胚は、ブロッキング溶液MAB + HTSS + BR中でインキュベートされた時点でMAB + HTSS + BR +抗DIG抗体（ 表4）の適切なボリュームを構成する胚。利用当日の阻止ソリューションは新鮮なことを確認します。
  3. 抗体溶液を除去し、抗体と一晩インキュベーションし下記の表5に概説されるように洗浄をし始める。アルカリホスファターゼ基質を染色するための準備を可能な限りバックグラウンドを低減するために、少なくとも12の30分間の洗浄を行う。 MABバッファまたは洗浄ステップのためのTBT溶液（ 表1）のいずれかを使用してください。
    NOTE：TBT溶液はBSAの2ミ​​リグラム/ミリリットルを加えたことTTWある。
    1. BMパープルアルカリホスファターゼ基質との最後の洗浄溶液を交換してください。染色REACを実行します室温または37℃のいずれかでる。
      注：染色は、37℃で、より迅速であるが、一晩放置した場合、許容できないバックグラウンド染色は、多くの場合の結果であり得る。染色反応は、多くの場合、一晩染色し、室温がこのための最も安全である必要があります。
    2. さらに染色が必要であるとBM紫色の溶液が青色に取っている場合は、新鮮なBMパープルに染色液を交換し、37℃Cにチューブを入れる。標的mRNAが非常に豊富である場合は、4℃で一晩染色溶液中で胚を配置し、染色反応をより良くモニタリングを可能にするために、室温または37℃に胚を移動する。
    3. 最終結果までの時間が異なる標的RNAとの間でかなり変化するように、慎重に新しい反応を監視します。一貫性を保つため、より長いインキュベーションで生じる表現の新たなサイトが存在しない場合（3.4を参照）染​​色反応を停止します。重要なことは、in situハイブリダイゼーションした場合は、アッセイとして使用されている異なる治療群見実験のため、治療群と対照胚との間の呈色反応のために同じ時間を使用する。
  4. 染色反応を停止し、 表6に概説されているような液体を変更することで、ストレージと画像記録のための胚を準備する。汚れの除去は、胚の周りのメタノールの紫色の着色として可視化することができるので、この段階での胚を揺するしないでください。
    注：これは重いバックグラウンドまたは空洞染色を除去するのに十分ではないが、多くの場合、胚は、染色溶液及び少なくとも部分的にそれを削除することができ、冷メタノールからの光ブルー染色を持つ。冷メタノールで-20°Cの冷凍庫内に維持されるメタノールを指す。
    1. 胚を再水和とMempfa（ 表6）で汚れを固定します。固定後、Mempfaを除去し、25％メタノールで胚を洗浄する。
    2. 25％のメタノールを除去し、内因性顔料の除去場合に漂白液を追加必要とされている。それは火傷の原因となりますので漂白液の取り扱いに注意してください。それは比較的迅速に発生し、漂白の程度は異なる効果（ 図2）のために変化させることができるように密接に漂白を観察します。
    3. （ 表6参照）漂白以下の長期保存のために100％メタノールをメタノール一連の胚を脱水、または短期記憶およびその後のイメージングのためにPBSに移す。

4.イメージング胚

  1. 胚は、染色処理を完了すると、画像は、胚、目的の遺伝子が発現される場所に関する情報がより多くの人のために捕捉されるようになっている。未確認の胚を表示するには、背景としてアガロース1％を使用してください。
    注：アガロースが胚および染色反応の青色とよく対照的でブルー/グレーの背景を提供します。また、胚から注意をそらす気が散る影や反射を拡散させるのに役立ちます。
    1. 水にアガロース追加し、アガロースが溶液中になるまで沸騰させると、その後ペトリ皿に注ぐ前に50に冷ます。 TAEゲル溶液と同様に、複数の用途のために55℃のインキュベーター中でアガロース溶液を保存する。シャーレに約2ミリメートルの深さまでアガロースを注ぐ。必要に応じて、バックグラウンドの若干異なる色合いを得るためにアガロースの深さを調整。
    2. 水溶液（PBSまたはTTW）に、メタノール中のストレージから再水和した後、メタノール系を用いて、（ 表6参照）アガロースベースとペトリ皿に胚を置く。きれいなソリューションを保持し、必要であれば、良好な画像のきれいな背景が中断する可能性が小さな粒子状物質を除去するために単純なフィルタリングを使用しています。
    3. 画像にそのような腹側からのような代替ビューから胚は、 図3の細かい鉗子を使用して胚にフィットし、（オリエンテーションのためにこれらのチャネルに胚を配置するためにアガロースに薄いチャンネルをカット）。彼らは簡単に破損しているように胚を操作する際には注意してください。
      注：ほとんどのステージは、溶液中に置かれたとき、彼らが前提と特徴位置を持っている。例えば、胞胚段階の胚は動物の側を上に座ってする傾向がある。胚が細長くし始めたら、彼らは彼らの側に横たわっていた。
  2. 画像に奥行きを与え、表面構造を見分ける助け胚に影を作る、浅い角度から胚を照明するための光ファイバ光源を用いる。漂白は便利なランドマークを提供顔料を、排除することができますので、強く漂白胚についてシャドーイングを使用します。
  3. そのような脳、（ 図4）の脊索、肺、または地域のように、深い胚内にある画像の染色に胚をクリアします。これを達成するために、100％メタノール中になるまでメタノールを一連の胚を置く。
    1. メタノールにおける完全浸漬した後、一部のベンジルアルコールの溶液に胚を転送する2つの部分のベンジルであるnzoate（BABB）。胚は、最初に表面に浮くが、メタノールがBABBと混合するように、彼らはBABBに沈んでしまう。ガラスバイアルまたは皿でBABBを扱うすべてのステップを実行します。 BABBは任意のプラスチックや塗料を溶かすします。
    2. 一度クリアされ、透過光が胚の下から来るとの胚を表示します。コントラストを改善し、最良の色を提供するために、下から光の強度ならびに角度を調整する。
    3. クリア胚を表示しているときにベースのオフガラスシャーレを上げる。単に胚と皿の領域が上昇しているように、それを高めるために他の二つのペトリ皿の蓋を使用して行います。
      注：これは、焦点が外れベースを取得し、画像を妨害し得る顕微鏡ベース上の欠陥や汚れから邪魔影響を排除するという利点を有する。

in situハイブリダイゼーション 5.ダブル

  1. 同時にTWの発現パターンを表示するには単一胚における異なる遺伝子oを、二つのプローブ、異なる遺伝子のそれぞれについて1つの合成。上記のように標識としてDIG-11-UTPを用いて一つのプローブを合成する。 in situハイブリダイゼーションの単一のために使用されるよりも3倍以上濃縮されたプローブを生成するためにRNAのハイブリダイゼーション緩衝液中で転写反応の生成物を希釈する。
    1. DIGはDIG-11-UTPの代わりにする必要があり、そのフルオレセイン-12-UTPを除いてプローブ標識されたと同じプロトコルを使用して、関心のある他のプローブを合成。 in situハイブリダイゼーションの単一のために使用されるよりも3倍以上濃縮されたプローブを生成するためにRNAのハイブリダイゼーション緩衝液中で転写反応の生成物を希釈する。
    2. 1：1の比率で2濃プローブを混ぜる。最良の結果を得るには、in situハイブリダイゼーションプロトコルでのシングル最強発現を示す遺伝子のためのフルオレセイン標識プローブを使用しています。
  2. in situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて同じを使用の<インサイチュで単について記載in situハイブリダイゼーションプローブ、 単一の代わりに最初の日の終わりに、二重プローブ（ジゴキシゲニン標識およびフルオレセイン標識プローブの1.5倍濃縮された混合物を含有するプローブ）を使用して除く/ em>のハイブリダイゼーション、。
    1. 抗DIG-AP Fab断片の代わりに4000希釈、1：抗フルオレセイン-AP Fab断片を使用して除いて、in situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて二重の二日目に単一のハイブリダイゼーションプロトコールに従う。 インサイチュプロトコルにおける単一のように胚から過剰な抗体を洗い流し、BMパープルAP基質を用いて第一の色反応を行う。
  3. 最初の呈色反応に続いて、MABで5~10分間の洗浄、続いて40分間、0.1 MグリシンpHを2.0にフルオレセイン抗体を不活性化する。 90分間MAB + HTSS + BRで胚をブロックします。 1での抗DIG抗体を追加します。MAB + HTSS + BR 2,000希釈し、4℃で一晩インキュベートする。
    1. 次の日、胚目を洗うoroughly MAB（30分の12回の洗浄）の過剰な抗体を除去する。
    2. APバッファー（ 表1）に10分間の胚を洗浄した後BCIP（APバッファでは0.5mg / ml）で染色する。
      注： 現場の組み合わせの最初の色反応および第二（ 図5）のためのライトブルー色反応のための濃い青紫色の染みを与える必要があります。
    3. APバッファーを除去することによって、最終的な呈色反応を停止させ、MABで三回すすぐ。 10分間Mempfaとの胚を固定してください。 MABまたはTBTで5クイック回の洗浄で胚を洗浄する。
    4. それはBCIP色だけを排除するように、この色の組み合わせでは、ポスト染色治療中のメタノールの使用は、もはや不可能である。 0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBS中で染色し、固定後胚を保管してください。強度の染色は、 原位置で二重に弱いことができます。これが問題である場合、4つの2時間の持続時間の各洗浄を減らす。

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結果

組織特異的プローブの使用は、特定の臓器の開発の状態に関してで優れた情報を提供することができる。以下の例では、胚のステージはNieuwkoopとフェーバーステージング表11に基づいています。 1プローブを使用している場合、私は例（ 図1C）のために、段階28-30で、 心筋トロポニンの分化後に発現する遺伝子を形成し、差別化器官の存在又は大きさはどの段階ポスト分化で評価することができる。数年前、胎生学者は、初期胚12,13の組織学の顕著な知識に基づいて、このような分析を行うことができましたが、その専門知識は、主に胎生の現在の世代のために失われています。なお、この専門知識の損失は任意の研究者が利用可能な特定の組織の識別を行い、in situハイブリダイゼーション技術の信頼性および使用の容易さ、残念と考えることができる。比較的目立たない組織トン彼例えば胚ステージ25（ 図1A）で腺を孵化、鮮やかに特異的な抗体または組織学的技術（ ...

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ディスカッション

特定の遺伝子の発現パターンを可視化するために、in situハイブリダイゼーションを使用する能力は、 アフリカツメガエル胚の特定の器官または細胞型を同定するための最も一般的に使用される方法のままである。これは、この技術によって提供されるいくつかの利点がある。遺伝子の発現は、これらのセル18のいずれかの明確な境界の前に心臓前駆細胞におけるNkx2.5の発現のためのケースとしてだけでなく、分化のいずれかの組織学的な記号の前に特定の構造を識別することができます。すべての試薬が手に入ると、それはまた、非常にコスト効果的である。効果的に再利用することができる多くの個々のプローブの生成は、目的の遺伝子をコードするプラスミドを得た以外は少し余分な時間とコスト投資が可能である。我々の経験では、プローブは、それぞれの使用が付属して避けられない小さな希釈液にもかかわらず、活動の少ない損失で年に再利用することができる。最後に、少し最適化requiががあります別のプローブを利用する際に赤。

プローブ合成の品質は、...

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開示事項

著者には開示すべき競合する金銭的利益はありません。

謝辞

著者は、CIHRがSteve Deimlingのフェローシップを支援し、Department of Paediatrics, University of Western OntarioがSteve Deimling、Rami Halabi、Stephanie Groverを支援してくれたことに感謝したいと思います。 この研究は、NSERC助成金R2654A11とNSERC Discovery Accelerator Supplementの支援を受けました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LabguakeチューブシェーカーVWR17-08-2011
VWRバイアルVWR10-07-2012
L-システインバイオショップCYS342.500
リボヌクレオシド三リン酸セット、100mMロシュ11277057001
ジゴキシゲニン-11-UTPロシュ11209256910
Rnase阻害剤(Rnase OUT)インビトロジェン 10777-019
T7 RNAポリメラーゼFermentasEPO111
T3 RNAポリメラーゼFermentasEPO101
SP6 RNAポリメラーゼFermentasEPO131
Dnase 1Invitrogen 18047-019
羊の血清 Wisent31150
ブロッキング試薬ロシュ11096176001
BMパープルAp基質ロシュ11442094001
抗ジゴキシゲニン-AP2月フラグメントロシュ11093274910
メタノールVWRCAMX0485-7
NaClショップSOD002.10
SDSEM 7910
EDTABioShopEDT001.500
TrisBioShopTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4ΣM-2643
MOPSBioShopMOP001.250
EGTAΣE-3889-25G
パラホルムアルデヒドBioShopPAR070.500 
ホルムアミド VWR    CAFX0420-4 
RNAロシュ10109223001
マレイン酸 VWR    CAMX0100-3
クエン酸三ナトリウムBioShopCIT001
過酸化水素 (30% 溶液)EM HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
ベンジルアルコールシグマB-1042
安息香酸ベンジルシグマB-6630
ウルトラピュアアガロース インビトロジェン 16500-500
バイオ

参考文献

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