ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

サマリー

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。

要約

ゼブラフィッシュ胚は、小分子の大規模スクリーニングのための強力なツールである。蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、しばしば、遺伝子発現を調節する化学物質を同定するために使用される。ライブゼブラフィッシュで蛍光を分析化学の画面は、多くの場合、高含有量のスクリーニングのために高価な、特殊な装置に依存しています。私たちは、電動ステージ自動的に画像ゼブラフィッシュ胚に標準落射蛍光顕微鏡を用いて手順を説明し、組織特異的な蛍光を検出。 GFPの発現を介して、エストロゲン受容体活性を報告するトランスジェニックゼブラフィッシュを用いて、組織特異的にレポーターを活性化するエストロゲン受容体のリガンドをスクリーニングするための半自動化された手順を開発した。このビデオでは、96穴プレートに24〜48時間後に受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚を配列し、エストロゲン受容体に結合する小分子を追加するための手順について説明します。 72〜96 HPFで、それぞれの画像は、ウェルからプレート全体が自動的に収集され、手動で組織特異的な蛍光検査される。このプロトコルは、心臓弁ではなく、肝臓での受容体を活性化エストロゲンを検出する能力を実証する。

概要

トランスジェニックゼブラフィッシュは、線維芽細胞増殖は^1、レチノイン酸^2因子 、ライブ胚において^、3のエストロゲンシグナル伝達経路における活性を直接可視化を可能に開発されている。このようなツールは（蛍光強度の変化としてアッセイ）シグナル伝達経路を撹乱化学物質または組織特異的様式^4（蛍光の局在の変化）でシグナル伝達を調節する化学物質のスクリーニングを可能にする。自動化された画像取り込みは、化学画面劇的^5,6のスループットが向上します。ライブゼブラフィッシュにおける自動的アッセイ蛍光は、多くの場合、高価な、特殊な装置に依存している画面。いわゆる高含有量スクリーニングは、高分解能、定量的なイメージングが、共焦点顕微鏡^、7,8のために装備、特殊なプレートリーダーを使用してのコストでの利点を提供します。このメソッドの目的は、ゼブラフィッシュ胚で自動的に分析組織特異的な蛍光である標準的な落射蛍光顕微鏡を用いて96ウェルプレート中。組織特異的蛍光は、この技術を用いて区別することができ、特殊なプレートリーダーまたはハイコンテントスクリーニング装置へのアクセスを欠いている実験室のための合理的なアプローチであり得る。

このプロトコルでは、3日後に受精（DPF）で組織特異的エストロゲン受容体（ER）ライブゼブラフィッシュにおけるアゴニストを検出するための自​​動化されたイメージングを使用する。トランスジェニック系統の^{Tg（5xERE：GFP）c262/c262は、}緑色蛍光タンパク質（GFP）の上流に5タンデムエストロゲン応答エレメントDNA配列（ERE）を含む^3。リガンドの非存在下で、ERは、通常は不活性である。リガンド結合は、受容体がERE DNAと結合し、転写^9を調節すること^ができるように、コンフォメーション変化を誘発する。 5xERE：GFP魚ERモジュレーターのための化学ライブラリーをスクリーニングするために使用することができ、エストロゲン汚染物質の環境水サンプルをスクリーニングするために使用することができる。

プロトコル

注：このプロトコルは、バーミンガム機関動物実験委員会のアラバマ大学によって承認された。

1。ゼブラフィッシュの繁殖や卵コレクション

1. 三日間化学物質暴露を開始する前に、別々の男性と女性のディバイダーで飼育タンクを組み立てる。養殖システムの水を各タンクを半埋める。 NETを使用して、TG（5xERE：GFP）を転送する分周器で区切られた各タンクに2人の男性と3人の女性を配置し、繁殖水槽に魚を^c262/c262。各タンクに蓋を置き、交差するように、日付と株と語り合う場です。
2. 翌朝は、すべての障壁を除去し、繁殖水槽の一端に浅い領域を作成するためにバッフルを傾けます。正確な発達のステージングを確保するために、10分間隔で胚を収集し、ゼブラフィッシュが交尾することができます。ペトリ皿にE3B媒体と優しくフラッシュ胚を用いて、茶こしを通して洗浄す​​ることによってきれいな卵。永久に成魚を返すタンク。
3. 解剖顕微鏡を使用して、ソート、カウント、および任意の、未受精卵の異常または破損した胚を削除します。暗サイクル：午後02時10ライト付28.5℃でE3B媒体と家の中でペトリ皿に置き、胚。胚密度が発達に影響を与えることができる。 100×35mmディッシュと60×15 mmディッシュ中でせいぜい50胚では100以下の胚を置きます。
4. 24 HPFにより、200μMの1 - フェニル-2 - チオ尿素（PTU）を含むE3Bでメディアを交換してください。 PTUは色素形成を防ぎ、ゼブラフィッシュの胚および改善された画像の鮮明さのための透明な幼虫を保持します。注意：集中PTUの株価は危険です。 E3B + PTU液を作るときは手袋を着用してください。
5. 1日後受精（DPF）で、手動で細かい鉗子を使用して、各胚から絨毛膜を除去します。絨毛膜は、エストロゲンの浸透に影響を与えるようには見えない、しかし除去は画像の鮮明さを向上させます。メディアから絨毛膜を除去する必要はない。注：手動dechorionationの代わりに、胚のバッチはCHEすることができます以前に^11を説明したようにmically、1 mg / mlのプロナーゼ処理を用いて絨毛膜を除去。

胚の2。化学処理

1. 治療前の日は、DMSO中の千倍の濃度（または適切な溶媒）で各化学物質のストック溶液を準備します。たとえば、10μMビスフェノールA（BPA）に胚を露出させるために、100％DMSO中の10mM BPAのストック溶液を調製する。これは、各処理において均一なDMSO濃度を保証し、DMSOの非毒性の1:1,000希釈ビヒクル対照として働くことを可能にする。 -20℃での店舗の原液このプロトコルでは、胚は1および10μMのBPA、18.5 nMおよび1.85μMのゲニステイン、367 nMのエストラジオール（ポジティブコントロール）、車両（0.1％DMSO、ネガティブコントロール）に公開されます。
   注意：このようなBPA及びエストラジオールのような化学物質は有害であり、人間の胎児への有害な影響を持つことができます。注意して内分泌かく乱物質を処理し、常に適切な個人保護具を使用しています。
2. 治療の日には、解凍、ストック薬液を用意しました。 1.5mlのマイクロチューブに1ミリリットルE3B + PTUをピペットや株価化学溶液1μlを追加することで1:1,000に希釈します。渦精力的に。車両制御としてE3B + PTUにDMSOを1:1,000に希釈します。未処理の対照として1.5mlのマイクロチューブに1 mLのE3B + PTUを使用してください。
3. 96ウェルプレートの各ウェルに大口径のプラスチックトランスファーピペット、ペトリ皿からの転送の胚を用いて、胚あたり3ウェル、条件あたり3ウェル。長期治療中の蒸発を防ぐために、プレートの外側行と列（行AおよびE、列1および12）からの胚を省略する。外側のウェルはE3B + PTU300μlで充填することができる。適切にプレートの蓋にラベルを付けます。
4. 細かい傾いてプラスチック製のトランスファーピペットを用いて各ウェルからメディアを取り出します。胚を乾燥しないように迅速に働く。
5. うまく対応に処理液を200μlを加える。未定義ふたをする適切なウェルに治療の追加を確実にするためのガイドとしてプレートをrneath。溶液中の化学物質を分配するためにピペッティングする前にボルテックス各チューブ。視覚的に各胚を処理液にあることを確認。胚は井戸の側にある場合には、処理液とよくにそれらを洗浄するためにクリーンなホールピペットを使用しています。
6. 28.5℃のインキュベーターでプレートを置き胚を72ゼブラの蛍光について分析する。

96ウェルプレートに胚の3。自動画像

1. 各ウェルに4 mg / mlのトリカイン10μlのを追加して、胚を麻酔。
   注：以前の画像に胚を麻酔。 24-96ゼブラに、ゼブラフィッシュは、自発運動及び画像キャプチャ中に変化する光源への驚愕反応を示す。胚を麻酔して撮像中に動きを低減します。
2. 電動ステージで96ウェルプレートを置き、ステージを校正。顕微鏡自動的用ツァイス禅ブルー2011ソフトウェアを使用して、上と制御、 サンプルキャリアのオプションを選択し、 マルチウェル96を選択します。 調整]を選択します。舞台を校正するために段階的に指示に従ってください。
   注：このステップの後のタイルボタンをオフにしないでください。タイルボタンをオフにすると、キャリブレーションの設定が失われる可能性があり、96ウェルプレートを再校正する必要があります。
3. 客観10倍と明視野（BF）の設定を使用して、陽性対照胚を特定し、蛍光シグナルがカメラが飽和していないことを確認して、BFとGFPのチャンネルのために適切に露出設定を設定します。シングル胚に焦点を当て、3トータルのZ-セクション、上記1の画像は50μmと現在の焦点面下の1が50μmを取得するための顕微鏡をプログラムします。
   注：異なる組織、異なる焦点面を占有しているため、これは、それぞれのゼブラフィッシュの画像に焦点の心臓と肝臓で撮影されていることを確認します。
4. GFP及び高炉channeを使用してタイル張りの画像を取得するために、ソフトウェアのパラメータを設定LS。 取得 ] タブで、[詳細設定 ] を選択します。 タイル領域を選択して、タイル。サークルウェルオプションを選択します。
   NOTE：タイリングは、各ウェルの合成画像を作成するために使用される。単一のフィールド·オブ·ビューは、各ウェルの小部分のみを捕捉する。タイリング機能は、自動的に全体の十分の合成画像を作成して、各ウェルから複数の隣接するフィールド·オブ·ビューをキャプチャすることができます。各合成画像は、単一のウェルから数十個々の画像を含む場合、自動的にプレート当たり96合成画像をキャプチャすることが可能である。
5. キャリアを選択し、[ 度90％を満たす 。 90％のフィルファクタを選択すると、各ウェルの面積の90％が合成画像に見えるように選択ウェルの複数の画像をキャプチャする。
   NOTE：フィルファクタを選択すると、図は画像化される領域を表す表示されます。ウェルの面積が含まれる割合を選択それは、実験のために適切である。
6. オプション ]で、必要なオーバーラップ量を選択します。
   注：単一の代表的なイメージのために一緒にタイルをつなぎ合わせるときは5〜10％のオーバーラップは、画像間のスムーズな継ぎ目が可能になります。画像ステッチが不要な場合は、0％のオーバーラップを使用すると、撮影時間を減少させる。 90％のフィルファクタ及び5％のオーバーラップを使用して、単一ウエルの合成画像は、59の個々の画像からなる。
7. 撮影開始。顕微鏡は、画像を自動的に取得します。
8. 手動で組織特異的な蛍光（ 図1）のために、各ウェルの合成画像を検査します。
9. 注：化学物質曝露前実験的治療ウェルを観察しましたことを確認するための陽性対照で始めるのがベストです。

96ウェルプレート内の胚の4。手動イメージキャプチャ

注：結果を確認するためには、ACに20X長作動距離の対物レンズを使用手動帖より詳細な画像（ 図2）。

1. 客観20Xと明視野（BF）の設定を使用して、陽性対照胚を特定し、蛍光シグナルがカメラが飽和していないことを確認し、適切にBFとGFPのチャネルに対して露出設定を設定します。
2. 手動で個々の胚とキャプチャ画像を識別。
   注：露出設定が陽性対照胚用に選択されたら、設定を変更しないでください。各画像は、均一な条件下で捕捉されるように、これは蛍光強度の比較を可能にする。

結果

図1は、96ウェルプレートの各ウェルからの合成画像を示している。各合成画像は、5％の画像の重複を有する59個々の画像から構成されている。ライブゼブラフィッシュは、各ウェル内でランダムに配向していることに注意してください、まだ我々は、肝臓から心臓内の蛍光を区別することができます。明視野画像は、ゼブラフィッシュの方向性を評価し、形態異常（ 図1Aおよび1C）を可視化するための参考として有用である。 10倍の対物レンズを用いて自動化されたイメージングは化学物質をスクリーニングし、高倍率で手動評価を保証するかを決定するために使用される。 図2をより詳細な分析のために20倍の長作動距離対物レンズで撮影した画像を示す。これらの画像は、顕微鏡ステージからプレートを除去することなく、 図1に示される自動化されたスキャンの直後に採取した。 20X対物レンズを用いて、心の中の蛍光を正確心臓ヴァルに局在することができますVES（ 図2C-2F）。時折、胚の向きは、画像を捕捉するための準最適...

ディスカッション

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚で自動的に画像の組織特異的な蛍光の簡単な方法を説明します。プロトコルはツァイスアクシオオブザーバを使用して開発されました。禅ブルー2011ソフトウェアでZ1は、しかし技術は、合成画像を作成するためにタイリングを行うことができる電動ステージと顕微鏡制御ソフトウェアとの任意の倒立顕微鏡を使用して適合させることができる。電動ステージを倒立顕微鏡を装備すると、ハイコンテンツスクリーニングのための特殊な装置を購入する実用的な、より安価な代替手段を提供することができます。電動ステージは、ステージの顕微鏡と品質の製造元とモデルに応じて、数千から米ドル数万の範囲にある。

プロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。いくつかの化学物質は、従って、それが治療中暗所で胚をインキュベートすることが有益であり得る、光感受性である。ゼブラフィッシュ胚は乾燥に敏感です。このため、化学のための校正曝露日以上持続することは、蒸発（プロトコールステップ2.3）を制限するために培地で96ウェルプレートのエッジに沿ってウェルを充填するために重要である。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プラスチックトランスファーピペット 広口径	フィッシャー	13-711-23
プラスチックトランスファーピペット 細口	フィッシャー	13-711-26
96ウェル、丸型、平底プレート	フィッシャー	21-377-203
100×35mmプレート	フィッシャー	08-757-100D
35×60mmプレート	フィッシャー	08-757-100B
デュモン#5ファインフォーセプス	ファインサイエンスツール	11254-20	先端寸法0.05 x 0.01 mm、胚から絨毛膜を手動で除去するため
カインメタンスルホン酸	シグマアルドリッチ	A5040-25G	レシピ(http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-フェニル 2-チオ尿素 (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	20 mM ストック (100x) を準備し、200 μ;E3BのM
ツァイス Axio Observer Z1	カールツァイス		プロトコルには、電動ステージを備えた倒立蛍光顕微鏡が必要です
20倍の長作動距離対物レンズ	カールツァイス		私たちは、0.4 NAと8.4 mmの作動距離を持つ対物レンズを使用します
Axiocam HRm デジタルカメラ	カールツァイス
ZenBlue 2011 顕微鏡制御ソフトウェア	カールツァイス		プロトコルは、電動ステージMethylene Blue Sigma Aldrich MB-1を使用してタイル張りの画像のキャプチャを可能にするために顕微鏡検査の自動化と制御ソフトウェアを必要とします
		。25グラムは	、E3Bで使用するためのRO水で2%の溶液を作ります(以下)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                   - 17.2グラム KCl                      - 0.76グラム CaCl2-2H2O    - 2.9グラム MgSO<サブ>4-7H<サブ>2O - 4.9グラムまたはMgSO4 - 2.39グラム 1リットルのMilli-Q水に溶解します。滅菌済みの1リットルボトルに保管してください. ゼブラフィッシュ用1X E3B溶液: 60X E3     150 ml 2%メチレンブルー    100 μl  Milli-Q water で 9 リットルまでお召し上がりください