高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

サマリー

非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。

要約

アルツハイマー病は、神経原線維変化(NFT)の形で過剰リン酸化タウタンパク質のニューロン沈着物によって現れるタウオパチーとして知られる神経変性疾患の大きなグループの一つです。 NFTの密度は、認知障害やその他の神経変性疾患の症状とよく相関しているため、タウ凝集ベースの治療法の開発が進められています。 しかし、これまでのところ、タウ凝集アッセイでは、病理学関連のリン酸化マークがない組換えタウまたは合成タウを使用しています。 ここでは、組換えの高リン酸化タウを被験者とする2つのアッセイについて説明します。 これらのアッセイは、高リン酸化タウ凝集体の動態または安定性を調節できる化合物のハイスループットスクリーニング用にスケールアップできます。 アルツハイマー病やその他のタウオパチーの新規治療法は、高リン酸化タウアイソフォームを使用して発見できる可能性があります。

概要

アルツハイマー病（AD）は、タウオパチーとして知られる神経変性疾患の大規模なコレクションの一つである。典型的な病理学の基礎となるタウオパチーは、ニューロン、アストロサイトとミクログリア^1-4で神経原線維変化、NFTの、です。 NFT密度は、認知機能障害^3,5及びニューロン損失⁶と相関する。 NFTはまっすぐまたは対らせんフィラメント^{（PHF）7,8を}形成（以下、「P-タウ」とも呼ばれる）は、主に過剰リン酸化タウタンパク質が含まれています。タウは、ニューロンのシグナル伝達および輸送^9,10に必須である軸索輸送を促進すると考えられ、微小管関連タンパク質である。各タウ分子は、正常な脳で2〜3リン酸を含むが、タウオパチー患者¹¹内の複数の折り目によってホスホリル含有量が増加する。複数のキナーゼは、GSK3β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β）及びCDK5（サイクリン·ドなどのタウの過剰リン酸化に貢献する可能性があるペンダントキナーゼ^5）12,13が、病理学的リン酸化のための直接の引き金は、とらえどころのない¹⁴のまま。微小管結合モチーフまたは周辺の異常なリン酸化は、微小管¹⁵からタウを解離し、p-タウは、最終的にNFT介在物に重合させることができる直鎖または対らせんフィラメントにオリゴマー化する細胞体コンパートメントにタウ誤局在を引き起こす。タウの過剰リン酸化、NFT形成、及び神経変性の間の緊密な提携は、p-タウのもつれがアポトーシスおよび他の細胞毒性反応を誘発するため、タウオパチーの神経変性^16,17のための根本的な原因であることが流行しているという仮説につながった。この前提に基づく薬物スクリーニングと初期の臨床試験は^、18を立ち上げてきた。しかし、この仮説は^19,20挑戦に直面している。例えば、サンタクルスらは、トランスジェニックマウスの認知機能は、変異体の発現を抑制することにより改善することができることを示したのNFTは、既存のタウ分子²¹から形成するために続けていても、人間のタウ、。 ショウジョウバエモデルでは、NFTは、基礎となる神経細胞^22,23を保護するために有毒な細胞質ゾルタウを隔離することが示された。明らかに、NFTの病因の役割は、もしあれば、大いにタウオパチー治療薬の開発の方向性に影響を与えます。

いくつかのβシート好ましい蛍光色素、電子顕微鏡法、光散乱分光法^24-27の結合によって示されるように、高濃度では、組換えまたは正常な脳のタウタンパク質は自然に、ゆっくり、 インビトロでの PHF様構造へと重合する。追加ヘパリンまたはアラキドン酸、人間の脳に豊富脂肪酸は、大幅にタウisoform-と誘導物質の濃度依存マナー^28-32でPHFの形成を促進する。興味深いことに、過リン酸化タウは、AD脳から精製またはインビトロリン酸化反応A に網羅して調製より速くggregatesと、より効率的に^26,33-35。これらの結果は、p-タウの病理学的役割とよく一致している。 p-タウの凝集に基づくインビトロシステムは、このようにADの薬物スクリーニングのための強力なツールとして機能することができる。

タウ凝集およびADの進行神経変性、ならびにAβ斑をターゲットに医薬品開発の最近の失敗、AD ^36-38のもう一つの重要な組織学的マーカーの間に密接な関連性を考えると、タウ凝集を制御する薬を発見するの関心が高まっている。実際、いくつかのグループがすでに一次アッセイとして体外タウ凝集反応に使用して、異なるスループットで薬物スクリーニングを開始しました。多くの化学物質は、 インビトロ ^39-42 でタウ凝集阻害または逆転活性を示すことが見出された。しかし、現在のすべてのタウ凝集レギュレータスクリーンは蛍光体の主要な病理学的なマークをミス修正されていないタウを使用ylation、ADの治療におけるこれらの化合物を使用しての特異性および有効性の懸念を高める。

生化学的特性およびADの薬物スクリーニングのための凝集アッセイの開発の大きな障害の一つは、病態生理学的に関連した高リン酸化タウタンパク質の十分な量の産生である。タウの1N4RアイソフォームとGSK-3βキナーゼはEに共発現されているジッパーアシスト触媒反応システムを用いて、 大腸菌は、ロイシンジッパー融合タンパク質として、私たちは、この課題を克服している（。隋ら 、提出され、タウとp-タウの最終製品については、図1を参照してください。また、p-タウの予備質量分析の特性評価のための^43を参照）。タウの異なるリン酸化部位に特異的な9抗体のパネルから、陽性シグナルは、8つの位置で見られた（データは示さず）。以下では、集約運動Dを区別できるプロトコルおよびインストルメンテーションを記述する変更されていないタウとpタウ種間ifferences。これらのアッセイは^、26アミロイド^結合の際に、チオフラビンT（THT）またはチオフラビンS（THS）の蛍光の増加（タウ凝集体）を測定した公開されたプロトコルから変更された。最初の「端末」は、無色素のアプローチは、凝集反応が組み立てられ、アミロイド色素の非存在下でインキュベートした。異なる時点で、各反応のアリコートを除去し、タウ凝集体を結合するためのThTの凝集を停止し、可能にするためのThT含有緩衝液の等量。蛍光は、IAP FluoroMax-2蛍光光度計で測定される。第二」の色素「継続的なモニタリングアッセイでは、ThTのまたはTHSは凝集反応に含まれる。蛍光は、手動で、実験全体を通じて連続的に測定またはマルチプレートリーダーを使用することができる。加えて、我々は継続的な測定MOにおける集計のためのタウおよびp-タウの近生理的濃度を使用するアッセイを説明デ。リン酸化の効果は容易に検出可能のままである。以下では、ステップバイステップの操作手順を説明し、これらのアッセイの代表的な結果が表示されます。各アプローチの長所と短所のいくつかの議論だけでなく、潜在的な薬剤スクリーニングアプリケーションが続きます。

高濃度では、タウは自然にアミロイド様構造へと集約されます。しかし、実験室で、タウ線維化は、典型的には、ヘパリン（平均分子量6,000グラム/モル）及びアラキドン酸のような誘導因子によって促進される。ここに示した例には、30μMのヘパリンが含まれています。タウアミロイド凝集体の形成を、チオフラビンT（ThTの）またはチオフラビンS（THS）のアミロイド結合性から生じる蛍光によりモニターされる。 （;：485 nmの発光ピークを450nm励起）タウ凝集体に結合すると、ThTの蛍光の赤いシフトを示す。 THSは、一方では、アミロイドは結合の前に510ナノメートル（450nmで励起）で弱い発光を有するが、このfluorescenc電子は、このような凝集したタウ^44とアミロイドタンパク質の存在下で有意に増加する。両方の色素は、タウおよびp-タウ凝集を検出するのに適しています。ためのThTの強力かつ比較的広い発光ピーク（ 図2参照）から、510 nmでの蛍光単位でわずか30％の減少がある。いずれかの染料を使用する際の便宜のために、我々は、タウ凝集をモニターするために、励起/発光波長（ すなわち 、450nmの/ 510 nm）の同じ組み合わせを使用する。

タウ凝集は、アッセイの目的とタウタンパク質の可用性に応じて、染料の存在下または非存在下で行うことができる。反応の両方のモードを以下に示します。単一のサンプル蛍光光度計（ISA-SPEX FluoroMax-2）と、マルチプレートリーダー（スペクトラマックスM2） - 加えて、我々は2つ​​の異なる機器の動作を実証する。読者は彼らの特定のニーズや機器の可用性に合わせて、これらのプロトコルを適応させることができるはずです。

プロトコル

試薬の調製

1. 集計バッファを準備し（20mMトリス、pH7.4中、100mMのNaCl、1mMのEDTA）。ヶ月間、室温で安定して保管してください。サプリメント1mMのは、使用前に（DTT）をジチオスレイトール。
   NOTE：HEPESベースの緩衝液（10mM HEPES、pH7.5で、0.1mMのEDTA、5mMのDTT）もまた、タウ凝集に類似の結果を生成する。
2. 0.22μmの無菌フィルターユニットによりチオフラビンTまたはチオフラビンS原液（凝集緩衝液に溶解3mMの、）、およびフィルタを準備します。ヶ月間、アルミホイルで安定したカバーチューブで-20℃で保存。
3. （300μM、集計緩衝液に溶解）をヘパリン原液を準備します。 -20°Cで保存し、ヶ月間安定。
4. （水に溶解し、1M、）ジチオスレイトール（DTT）の株式を準備します。 1.5ミリリットルチューブに小分けし。 -20℃で保管してください。凝集アッセイの前に、室温で1 M溶液を解凍する。この1,000倍在庫から、脱イオン水で100 mMの作業ストックの一定分量を準備。氷の上のままに直前まで。
5. ℃の冷凍庫-80℃からタウを削除します。氷上で解凍します。集約緩衝液で所定濃度にタウを調整します。予め形成された大きな凝集体を除去し、4℃で10分間20800×gでマイクロ遠心スピン。このプレ紡糸工程は、タンパク質調製物の各バッチの後続の蛍光測定の一貫性を増大させる。別のチューブに上清を移し、凝集反応を組み立てるために準備ができるまで氷上に残す。

2.無色素、ターミナルアッセイ

注：このアッセイの凝集反応は、蛍光色素の不存在下で行われる。すべての成分を混合した後、反応物を所定の時間点まで進行させる。アリコートを凝集反応から取り出しのThTまたは蛍光読み取りの前に結合アミロイドTHSと混合される。凝集反応の初期体積は、必要とされる時点の数に依存する。このアプローチは、のrequありタウタンパク質を大量にIREが簡単で高速であり、蛍光光度計またはマルチウェルプレートリーダー（説明を参照）で行うことができる。以下は、蛍光定量化のためのISA SPEX FluoroMax-2コンパクトな分光蛍光光度計を使用して、ステップバイステップの操作です。

1. 表1のように1.5mlのエッペンドルフチューブ中で凝集物を設定し、各列は、一時点の測定のために十分である、100μlの反応に必要な成分を表す。特定の実験のために必要な時点に基づいて、全体の集計ミックス量を調整します。ピペット操作エラーの余地を与えるために、各コンポーネントの追加の10パーセントを追加します。ここに示されている典型的な反応を含むヘパリンはアラキドン酸または集約バッファで置き換えることができる。反応混合物を1 mMのDTTを加える。全反応が1日以上続いた場合、還元環境を確保するために新鮮なDTT、毎日（1 mm）を補う。
2. 混合するチューブを数回転倒。プラ37℃のインキュベーターや水浴中CEの各反応。攪拌はタウ凝集のために必要とされていません。
3. 蛍光を測定する前に、（コンピュータその後、第1ランプ）分光蛍光をオンにします。
   注：すぐに使用することができ、キセノンアークランプ。しかし、最良の結果を得るためにマシンが蛍光を読む前に約10分間のウォームアップすることができます。
4. コンピュータ上のソフトウェアを起動します。
   1. 510 nmの（5 nmのスリット）に計測器制御センターの実時間表示モード 、（2 nmのスリット）450nmの設定励起波長と発光波長を選択してください。閉じるリアルタイム表示モードウィンドウは計測器制御センターに戻ります。
   2. 一定の波長の分析を選択して、Enterキーを押して波長セットを追加するには、上部フレームで>>キーを追加します。 1〜3と最大トライアルへの標準誤差の集合取得パラメータ、[ 追加]をクリックします。 データ表示を開くために！GOをクリックします。窓。
   3. データ表示 ] ウィンドウで、 新しいサンプル]ダイアログボックスを開くには[スタート] ACQをクリックします。 サンプルタイプのために「不明」を選択します。
5. すべての100μlの集約混合物に、98μlの集計バッファとT.ピペットを数回混合する3 mMのチオフラビン2μlを添加する。
6. キュベット（FCA3、外装寸法は、wxlxh = 12.5ミリメートルX 12.5ミリメートルX 45ミリメートル）の混合物全体を転送します。サンプル·コンパートメント内の試料ホルダーにキュベットを置き、蓋を閉じます。蛍光データを収集するために実行]をクリックします。データを記録します。
7. キュベットを取り出し、その溶液をデカント。蒸留水により3回キュベットをすすぐ。キュベット内と外の空気を吹き付けることにより乾燥した。

と色素3.をSpectraMax M2プレートリーダーで継続モードアッセイ

注：このアッセイは、蛍光色素のThTまたはTHSがaggregaに含まれているという点で、以前のものとは異なるション反応。これは、反応の同じセットの連続測定を可能にする。なぜなら反応の反復使用のために、この方法は、より良好な自動マルチウェルプレートリーダー（スペクトラマックスM2の動作を次のように）で行われる。定期的な蛍光光度計も動作しますが、高速の集約反応の測定の頻度が原因の動作の説明書性質のため、多少制限されている。

1. 表2のように96ウェルプレート中で凝集ミックスを設定する（96ウェル黒色固体プレート、ウェル容量360μlを、平底）の各列は、一のために十分である、200μlの反応に必要な成分を表す時間点測定。数回ピペッティングしてよく混ぜる。実験の過程を通して、毎日新鮮な1mMのDTTを補足する。
2. 37℃で96ウェルプレートをインキュベートする。
3. 蛍光測定の前に、各時点で、マルチモードマイクロプレートリーダー及びコンピュータの電源を入れる。 MAのための十分な時間を許可する背骨は、約10分間安定させる。
4. コンピュータ上のソフトウェアを起動します。 37℃に温度を設定し、蛍光強度（FI-トップリード）モード、510 nmで450 nmおよび放出波長に設定励起波長を選択します。
5. 引き出しに96ウェルプレートを挿入し、測定を開始するために、READキーを押します。
6. お読みになった後、プレートを取り外して、37℃のインキュベーターに戻し、それを返す。データ分析とプロットするためのExcelスプレッドシートにデータをコピーして貼り付け。

4と染料、継続モードアッセイコンパクト分光蛍光光度計で

1. 表3のように1.5mlのエッペンドルフチューブ中で凝集物を設定し、各列は、一時点の測定のために十分である、200μlの反応に必要な成分を表す。
2. 混合するチューブを数回転倒。
3. 分光蛍光光度計の電源を入れ、手順2.3と2.4のようにソフトウェアを設定する。
4. 混合物全体tを転送OAキュベット。サンプル·コンパートメント内の試料ホルダーにキュベットを置き、蓋を閉じます。蛍光データを収集するために実行]をクリックします。データを記録します。
5. 実行]をクリックし、データを記録することにより、適切な間隔で読み続ける。凝集は、高周波数（ 例えば 、毎30または60秒）で監視する場合には、いずれかの測定が終了するまで機械キュベットおよび反応のまま、または反応またはキュベットを交換するのに十分な時間がある場合。
6. キュベットを取り出し、その溶液をデカント。蒸留水により3回キュベットをすすぐ。キュベット内と外の空気を吹き付けることにより乾燥した。

結果

組換えtauおよびp-タウ（ 図1）を使用して、我々は、タウを含む、タンパク質凝集体をアミロイドへの結合の際のThTとTHSの強い蛍光発光を利用して、タウの凝集およびp-タウの動態を比較するために2つの異なるプロトコルを設立及びp-タウ（ 図2）。凝集反応における蛍光色素の有無にかかわらず、我々は過剰リン酸化（ 図3-5）でタウ凝集の一貫した強化を観察した。この刺激は、ヘパリンとは無関係である（データは示さず）。 （ 図3、図5）、p-タウは、実験の過程を通して、より高い蛍光単位を示すと大幅に減速する前に、最初の30分以内に速い速度での典型的な反応、タウおよびp-タウオリゴマー化で。凝集反応でのThTを含めると凝集速度（ 図4）の有意な位相差を生じさせる。両方のアイソフォームに近づいPLAT反応が開始した後に160時間をEAU。 THSは、他の一方で、アグリゲーション（ 図5）のかなりの減速を引き起こすことはありません。

ディスカッション

このプロトコルは、リン酸化依存速いタウ凝集速度論を検出する別のアッセイ条件と楽器を示しています。端末アッセイでは、蛍光色素ThTを、各時点でのマスターミックスから除去された反応の一部に加えられる。アミロイド結合誘起蛍光次に^26で測定される。第有する染料モードでは、タウ凝集は、タウ凝集体の成長のリアルタイム自動評価に適したこの種の反応をレンダリングのThTまたはTHSの存在下で行われる。これらの各メソッドには、長所と短所を持っています。

ターミナルモードの反応がタウ凝集のために必要な唯一のこれらの成分を用いて行われる。希釈し、チオフラビンTとの反応を混合して大幅に本質的に蛍光定量反応を停止させ、蛍光の増加速度を遅くする。従って、この方法は、また手動操作と互換性があります。しかし、反作用理由nは事実上のThT添加により終了し、タウ多量の凝集曲線をプロットするために必要とされ得る。この方法のための別の潜在的な注意点は、反応混合物への頻繁なアクセスは、微生物またはタンパク質分解汚染、またはタンパク質の酸化を導入することができるということである。対照的に、と染料モードの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリズマ base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	Invitrogen	15576-028
チオフラビン T	Sigma	T3516	暗所に保管
Thioflavin S	Sigma	T1892	暗黒
ヘパリン	Σ	H3393
DL-ジチオスレイトール (DTT)	Sigma	D9779	4°C;C
96ウェルプレート	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
マウス抗タウモノクローナル抗体	R&D Systems	MAB3494	&ndash に格納されています。80度;ハ