線形増幅媒介のPCR - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

Summary

（LAM）-PCR媒介線形増幅は、ゲノムにウイルスベクターを統合の正確な位置を特定するために開発された方法である。技術などの遺伝子治療患者におけるクローン性のダイナミクスを研究するための優れた方法、新規ベクター技術のバイオセーフティ、T細胞の多様性、癌幹細胞モデルであるように進化している

Abstract

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR)は、遺伝子治療によって治療された患者の遺伝子修正細胞の造血を研究するために開発されました。レトロウイルスベクターは安定して組み込まれているため、組み込み部位を使用して、個々の細胞とその子孫のクローン運命を研究することができます。LAM-PCRは、遺伝子治療で治療された患者における白血病が、隣接するがん原遺伝子の過剰発現を誘発するプロウイルスに由来するという証拠を初めて提供しました。インバースPCRやライゲーション媒介(LM)-PCRなどの既存の方法と比較して、LAM-PCRの高い感度と特異性は、ビオチン化ベクター特異的プライマーを使用した最初の増幅前ステップ(100サイクルの線形PCR)によって達成され、その後の反応ステップを固相(磁気ビーズ)上で実行できます。LAM-PCRは、既知のDNAの近くにある未知のDNAを同定するために現在利用可能な最も感度の高い方法です。最近、制限消化物を回避し、組み込み部位の賦活化バイアスを排除し、宿主ゲノム中のプロウイルス位置の包括的な解析を可能にするLAM-PCRの変異体が開発されました。次のプロトコルでは、統合されたレンチウイルスベクターに隣接する3'-および5'-配列の両方の増幅を段階的に説明しています。

Introduction

PCR（LAM-PCR）媒介線形増幅は、任意の起源の既知のDNAに隣接する未知の隣接DNAを同定し、特徴づけることができます。具体的には、LAM-PCRは、宿主ゲノム内に^1,2（IS）ウイルスベクター組込み部位を局在化するために開発された。レトロウイルスやトランスポゾンのような遺伝的要素が（半）ランダムに^3-6で宿主ゲノムにそれらのゲノムを統合。多くの場合、これらのベクターは、集積正確に位置を知ることが決定的である。 LAM-PCRは、ライゲーション媒介PCR法⁷およびその変種またはインバースPCR ⁸のような代替技術よりも優れていることが証明されています。この方法の感度およびロバスト性は、ベクターゲノム接合の初期前置増幅、増幅されたPCR産物の磁気選択から生じる。上記の代替的な方法と同様に、LAM-PCR法は、IS ^9月11日の検索能力に偏りを導入し、制限酵素の使用に依存している。このように、ISレパートリー（integrome）のサブセットのみが1の反応で検出することができる。このバイアスは、制限酵素⁹の最適な組み合わせを使用して所与の試料の平行分析することによって最小化される。近年、非制限LAM-PCR（nrLAM-PCR）と呼ばれる技術の変形は、制限酵素の使用を回避し、単一の反応^9,12試料の公平なゲノムワイドな解析を可能にする開発されている。

過去には、LAM-PCRは、原因レトロウイルスは、臨床遺伝子治療試験^13-15における少数の患者における白血病を引き起こすIS同定するために使用されている。それ以来、LAM-PCRを識別するように適合されている他の組込みベクター（レンチウイルスベクター、トランスポゾン）にも受動的にアデノ随伴ベクター（AAV）またはインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（IDLV）のようなベクトルを統合する統合パターンを識別するためにからのものである^{16 -21。} LAM-PCR法の応用を広げている。伝統的なLY、技術が広く遺伝子治療を受けた患者における遺伝子改変細胞のクローン組成を研究するために、またはそれらの積分^15,16,22-24挙動^を解明することにより、新規なベクター系の生物学的安全性を評価するために使用される。最近では、LAM-PCRはIDLV捕獲アッセイ²⁵でデザイナーのヌクレアーゼの特異性とオフターゲット活性を測定することができました。

また、LAM-PCR法は簡単に生物中で時間をかけて導入細胞の運命を追跡することができます。このことは、癌原遺伝子、ならびに腫瘍抑制遺伝子を同定するために、また、造血又は癌幹細胞生物学^26-28を研究することを可能にする。少なくとも最後のではなく、LAM-PCR法は、ヒト^29（および未発表データ）におけるT細胞受容体の多様性を研究するようになった。

テクノロジーの本質的なパワーは、一塩基rで未知のフランキングDNAの何百万人を特徴づけることができ、深いシーケンシング技術にメソッドをリンクすることによって強化されている全ゲノム中esolution。以下のプロトコルでは、レンチウイルスベクターを特定するために例示的に知られていない隣接DNAの増幅および識別は、ステップバイステップを説明します。プロトコルで使用したオリゴヌクレオチドを表1に示す。抽出DNA又は任意の供給源のcDNAをLAM-PCRおよびnrLAM-PCRのためのDNA鋳型として使用することができる。

Protocol

リンカーカセット1。準備（LC）

1. LC1オリゴヌクレオチド（ 表1）の40μL、LC2オリゴヌクレオチド（適切な制限酵素オーバーハングを有する表1）の40μL、110μLのTris-HCl（100ミリモル、pH7.5）にし、10μlの250のMgCl _2を混ぜる。
2. 5分間95℃でインキュベートし、反応を室温までゆっくりと冷ましてみましょう。 300μlのH ₂ Oを加え、遠心分離フィルターにdsLinker-DNAを集中。 0.2 PCRチューブで準備リンカーカセットの溶出液を、アリコート10μlに80μlのH ₂ Oを追加します。

ベクターゲノム接合の2。プレ増幅

1. 分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。
   1. DNAサンプルの濃度を決定する。 0.2ミリリットルのPCRチューブにDNAをピペットXμL（LAM/100-1のため1〜1,000 ngの、nrLAM 000 NG）。 DNAの量は、各サンプルにし、RANに等しくなるはずである0.5から25μLのGE。
   2. 表2に記載したようにPCRマスターミックスを調製ミックス（50 - x）を0.2ミリリットルのPCRチューブ中の各DNAサンプルとマスターミックス液。
2. 表2に例示したPCR条件を用いて、プリアンプするベクターゲノム接合部。PCRの完了後、各PCRチューブおよびPCR再放送番組に0.5μlのTaqポリメラーゼを加える。 PCR産物は、-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる

PCR産物の3。磁気分離

1. 磁性ビーズの作製
   1. ピペット1.5ミリリットルチューブにストレプトアビジン被覆磁性ビーズを20μl（200μgの）、室温で磁性粒子分離（MPS）に1分間さらすこと。上清を捨てる。
   2. MPSからチューブを外し、40μLPSB / 0.1％のBSA（pH7.5）中の磁気ビーズを懸濁します。 1分間のMPSに公​​開し、上澄みを捨てる。一度この手順を繰り返します。
   3. 洗浄ビーズWI3 MのLiCl溶液20μl（3 MのLiCl、10mMトリス-HCl、1mMのEDTA）番目1分間のMPSに公​​開し、上澄みを捨てる。 6 M LiCl溶液（6M LiClと10 mMのトリス-HCl、1mMのEDTA）50μlに再懸濁ビーズ。
2. 作製した磁気ビーズを50μlのステップ2.2からの全体のPCR反応を混ぜる。少なくとも室温で2時間、水平振とう器（300 rpm）の上でインキュベートする。このステップでは、コーティングされたビーズ（DNA-ビーズ複合体）をストレプトアビジンビオチン化PCR産物に結合できます。 DNAビーズ複合体を一晩振とう器上でインキュベートし、又は最大4日間4℃で保存することができる。
3. 室温で1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開、上清を除去し、100μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁すぐにLAMやnrLAMステップ5ステップ4に進みます。

4。LAM-手順

1. 二本鎖DNA（dsDNAの）合成（LAMのみ）
   1. 1分間のMPSとDIS、ステップ3.3からDNA-ビーズ複合体を公開カード上清。 H ₂ Oを8.25μL、1μlの10倍ヘキサバッファー、0.25μLのdNTP（10 mM）および0.5μL（2 U）ノウポリメラーゼを追加します。 1時間37℃でインキュベートする。
   2. H ₂ Oを90μLを加え、1分間のMPSに公開。上澄み液を捨て、100μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁
2. 制限消化
   1. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。制限酵素バッファー、制限酵素0.5μlの1μLの10倍、8.5μlのH ₂ Oを加え、1時間反応をインキュベートする。ステップ4.1.2を繰り返します。
      注：制限酵素のメーカーが推奨する温度で反応をインキュベートする。内に存在するか、目的のDNAで前増幅のために使用されるプライマー結合部位の下流に制限部位が存在しないことを確認してください。適当な制限酵素/制限酵素の組み合わせの選択のために⁹を参照してください。
3. DSリンカ（LK）の連結
   1. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 5μlのH ₂ O、1μLの10X FastLinkバッファー、1μlのATP（10mM）を、ステップ1.2〜2μLリンカーカセット、および1μlの高速リンクDNAリガーゼ（2単位/μl）を追加します。 5分間室温でインキュベートする。ステップ4.1.2を繰り返します。
4. 合成したdsDNAの変性
   1. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 5μLの0.1NのNaOHに再懸濁DNA-ビーズ複合体。水平シェーカー上で室温で5分間インキュベートする。
   2. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開し、新しい1.5 mlチューブに上清を含む前置増幅、ベクターゲノム接合を収集します。すぐに-20℃で、ステップ6またはストア上清を進める

5。nrLAM - 手順

1. 一本鎖リンカーのライゲーション（SSLC）（nrLAMのみ）
   1. MPSにステップ3.3からDNA-ビーズ複合体を公開1分間、上澄みを捨てる。 6.5μlのH ₂ Oを追加し、1μlを10倍反応バッファーを、CircLigase 0.5μLのMnCl _2（50mm）で、0.5のATP（1 mM）をμL、1μlのssLinkerオリゴヌクレオチドおよび0.5μlのCircLigase（100 U /μL）。 1時間60℃でインキュベートする。
   2. H ₂ Oを90μLを加え、1分間のMPSに公開。上澄み液を捨て、100μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を洗うこの場合も、1分間のMPSに公開上清を廃棄し、10μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁

6。指数関数的増幅I

1. 分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。
   1. （ステップ4.4.2（LAM）または5.1.2（nrLAM）から）、ピペット2μlのテンプレートDNA 0.2ミリリットルのPCRチューブに。
   2. 表3に記載したようにPCRマスターミックスを調製する。ステップ6.1.1から各サンプルにマスターミックス48μLを追加し、PCR conditioによりベクターゲノム接合部を増幅する表3に例示したナノは、PCR産物は、-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる。

PCR産物の7。磁気分離

1. 3.1.3 - ステップ3.1.1に例示したように磁気ビーズを準備します。 6 M LiCl溶液（6M LiClと10 mMのトリス-HCl、1mMのEDTA）の（nrLAM用）（LAM用）20μLまたは50μLに再懸濁ビーズ。作製した磁気ビーズ（ステップ7.1）でステップ6.1.2から20μL（LAM）またはPCR反応液50μl（nrLAM）を混合し、室温で2時間、水平振盪（300回転）上でインキュベートする。 DNAビーズ複合体を一晩振とう器上でインキュベートし、又は最大4日間4℃で保存することができる。
2. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開、上清を除去し、100μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。
3. 20μL（LAM）または5μL（nrLAM）0.1NのNaOHに再懸濁DNA-ビーズ複合体。 Incu水平シェーカー上で室温で10分間BATE、1分間のMPSに公​​開し、新しい1.5 mlチューブに上清を含む増幅されたDNAを収集します。すぐに-20℃でステップ8.1またはストア上清を進める

8。指数関数的増幅II

1. 分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。
   1. 0.2ミリリットルのPCRチューブに（ステップ7.3から）ピペット2μlのテンプレートDNA。
   2. 表4に記載したようにPCRマスターミックスを調製する。ステップ8.1.1からの各サンプルにマスターミックス48μlを添加し、表4に例示したPCR条件によってベクターゲノム接合を増幅する。PCR産物は、最大4 4℃で保存することができる-20℃での日または長期
2. 可視化するために（NR）LAM-PCR産物を2％アガロースゲル上で、ステップ8.1.2からのPCR産物の10μlを負荷。バンドが可視である場合、高解像度のゲル上でLAM-PCR産物を10μlを分析する。注意：のEthidium臭化変異原性である。非常に慎重に作業し、常に適切な手袋を着用してください。

ハイスループット配列決定のための9。準備

1. （NR）LAM-PCR産物の精製
   1. 室温AMPure XP磁性ビーズ44μlのステップ8.1.2から40μlのPCR産物を混合します。室温で5分間インキュベートし、さらに2分間、MPSに公​​開。
   2. 上澄み液を捨て、MPSに200μlの70％エタノールで二度洗い。
   3. 上澄み液を捨て、30μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁1分間インキュベートし、新鮮な0.2ミリリットルチューブに上清を移す。精製したDNAの濃度を測定する。
2. Fusionprimer PCRは、特定のアダプターの配列を決定する追加します。
   1. 分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。
   2. 0.2ミリリットルのPCRチューブにDNAをピペットXμL（40 NG）。 DNAの量は、各試料中および0.5〜25μLの範囲で同じにする必要があります。
   3. 表5に記載したようにPCRマスターミックスを調製入れる。（50 - x）が、ステップ9.2.2からの各サンプルにマスターミックス液を、表5に例示したPCR条件によって（NR）LAM-PCR産物をシーケンシングアダプターを導入するPCR産物-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる。
   4. Fusionprimer-PCR産物を可視化するためには、2％アガロースゲル上で、ステップ9.2.3からのPCR産物10μlのロード。 9.1.3 - 9.1.1の手順に記載されるように、残りのPCR産物を精製する。正確Fusionprimer-PCR産物の濃度およびフラグメントサイズを定量化するための自​​動化された高分解能電気泳動デバイス上の工程9.4から1μlの精製PCR産物を分析する。

Results

LAM-PCRは、各接合のために定義された断片サイズを有するベクターゲノム接合部の増幅をもたらす。個々のPCR断片のサイズは、ゲノムDNA中の既知の位置と最も近い制限酵素認識部位の間の距離に依存する。これは、例えば 、ゲル電気泳動により分析試料中の増幅された接合部の多様性を可視化することができ、単一の（モノクローナル）、（オリゴクローナ）は、いくつか、又は複数の（ポリクローナル）のバンドがゲル上に存在する場合。 LAM-PCRの結果は、最高の高分解能電気泳動ゲル（ 図2A）によって観察されず、2％アガロースゲル（ 図2B）上で可視化することができる。 nrLAM-PCRは、個々の接合のための様々な長さのPCR断片を生じる。このように、モノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナルサンプルは電気泳動によりスメアとして表示され、視覚的に区別することができない。 2％アガロースゲル上nrLAM-PCR産物を視覚化すること成功を決定するのに十分であるプロトコル（ 図2C）のCESS。回収されたゲノムDNAを配列決定した...

Discussion

LAM-PCR法は、既知のDNA領域に隣接する未知のDNA配列を同定することができる。なぜなら公知のDNA配列にハイブリダイズする特異的プライマーを用いた接合の前増幅から得られる高感度のではなく、単一細胞レベルまでさえ稀接合を増幅して検出することができる。反して、ポリクローナル状況でLAM-PCRは、単一の反応において異なる数千の接合部を増幅することができる。

しかしながら、制限酵素の使用にin​​tegromeのみサブフラクションは、すべての特定の制限酵素を用いた接合部の存在についてLAM-PCRにより分析することができる。このように、異なる酵素と同一試料を繰り返し分析が⁹をお勧めします。まだLAM-PCRアンプリコンをゲル上に存在しない場合、最も可能性の高い公知のDNA断片の位置と選択された制限酵素の認識に最も近い部位との間の距離は、LAM-PCR産物を生じるには大きすぎる^9。この場合、他の酵素は、ジャンクションを増幅するために使用されるべきである。

nrLAMは、制限酵素の...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNAポリメラーゼ	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	代替Taqポリメラーゼを使用することができます
PCRバッファー	Qiagen	201203	このバッファーの使用は、
dNTP混合物	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	またはその他のdNTPs
オリゴヌクレオチド(プライマー)	MWG Biotech		HPLC精製
Dynabeadsをお勧めしますM-280 ストレプトアビジン	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	またはその他のサプライヤー
EDTA	Applichem	、A1103,0250	、またはその他のサプライヤー
、Klenow、ポリメラーゼ	、ロシュ、診断	10104523001
、ヘキサヌクレオチド混合物	ロシュ、11277081001
、制限、エンドヌクレアーゼ	、NEB		、またはその他のサプライヤー
Fast-Link DNAライゲーションキット	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	またはその他のサプライヤー
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	またはその他のサプライヤー
TBEバッファー	Amresco	0658	またはその他のサプライヤー
臭化エチジウム	Applichem	A2273,0005	Ethidium bromide is mutagenic
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	or any other DNA ladder
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	or any other supplier
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	ライフテクノロジー	K158501	1.5mlチューブ用
マグナセップ磁性粒子セパレーター	ライフテクノロジー	ズK158696	96ウェルプレート
Amicon Ultra-0.5、Ultracel-30 メンブレン	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	、またはその他の電気泳動システム
TProfessional 96	Biometra	050-551	またはその他の 96ウェルプレート用サーモサイクラー
オービタルシェーカー KS 260 ベーシック	IKA	2980200	またはその他の水平シェーカー
PCR ソフトチューブ 0.2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	またはその他の 0.2 ml PCR チューブ
1.5 ml チューブ	Eppendorf	12682	またはその他の 1.5 ml チューブ
ゲルドキュメンテーションシステム	PeqLab		またはその他のゲルドキュメンテーションシステム
Nanodrop ND-1000 分光光度計	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 プレキャストゲル	Elchrom Scientific	3497
水中ゲル電気泳動装置 SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100電気泳動バイオアナライザーAgilent	Technologies	G2939AA