このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される

7.9K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/51551

⸱

2014年7月30日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Department of Biochemistry, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa

この記事について

サマリー

アクチンにおける疾患の原因となる変異は、細胞骨格の機能を変更することができます。細胞骨格の動力学は、全内部蛍光顕微鏡を用いて蛍光タグ化タンパク質の画像化を介して定量化される。一例として、細胞骨格タンパク質、Aip1pは、変異アクチンアイソフォーム、R256Hを発現する細胞に局在化および運動を変更した。

要約

アクチンの変異は、多くの場合、細胞骨格の機能を変更する特定の分子変化によるヒト疾患の範囲を引き起こす。本研究では、全内部蛍光を用いて、蛍光タグ化タンパク質のイメージングは​​（TIRF）顕微鏡法は、細胞骨格の力学の変化を視覚化し、定量化するために使用される。 TIRF顕微鏡および蛍光タグの使用はまた、アクチンの突然変異によって引き起こされる細胞骨格の力学の変化の定量化を可能にする。この技術を用いて、生細胞中の細胞骨格機能の定量化は、常に時代のタンパク質機能のインビトロ研究で補完する。一例として、アクチン残基R256に影響するミスセンス変異は、このアミノ酸は、相互作用の調節に重要な役割を果たしている示唆して3つのヒトアクチンアイソフォームが同定されている。細胞骨格アクチンの運動に突然変異R256Hの効果は酵母モデルを用いて検討した。アクチン脱重合にコフィリンを補助することが知られているタンパク質、AIP1があったN-末端緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識しTIRF顕微鏡法を用いてインビボで追跡した。野生型および変異株の両方でAip1pの移動速度を定量化した。 R256H変異型アクチンを発現する細胞では、Aip1p運動は制限され、移動速度が1.60に比べR256H細胞で0.88±0.30ミクロン/秒（野生型細胞で測定されたほぼ半分の速度では±0.42、野生型細胞ではミクロン/秒、P <0.005）。

概要

アクチンは細胞骨格を構成する支配的なタンパク質であり、細胞分裂、細胞小器官の動き、細胞の運動性、収縮、およびシグナリングを含む重要な細胞プロセスに参加しています。過去10年間で、アクチンにおける疾患の原因となる変異は、筋障害の冠動脈疾患1-7に、障害の範囲につながる6ヒトアクチンアイソフォームの各々で発見されました。アクチン変異が疾患につながるそれによってプロセスが解明され続けています。酵母モデルは、単一の本質的なアクチンアイソフォーム、遺伝従順とアクチン配列及び機能の高い保存性の利点により、アクチン機能の変​​異の生化学的効果を研究するためのゴールドスタンダードのまま。研究では、個々のアクチン変異がドミナントネガティブ効果8との分子の特定の機能不全につながることを示している。たとえば、のLys-118残基に影響を与え、γ-非筋アクチンにおける難聴の原因となる変異はによって規制を変えるアクチン結合タンパク質ARP2 / 3 9。研究は、しばしば、インビトロで用いるタンパク質の分析：タンパク質相互作用。細胞中のタンパク質の局在化結合細胞生物学上のアクチン変異の効果の調査、特に、アクチンは限られている。

生体内での酵母細胞骨格の研究では、従来、倒立蛍光顕微鏡10からの固定された細胞の画像に依存しています。これらの実験は、アクチン細胞骨格の形態学についての基礎的なデータを提供しました。調査は複雑なので、細胞骨格網11,12を可視化する三次元共焦点イメージングを組み込んでいる。この撮影は、豊かさとアクチンパッチやフィラメントの相対的な位置の定量化を可能にします。薄いセクションの電子線トモグラフィーは保存細胞内構造13と比較して密な線維状のネットワークの形態画像に使用されてきた。混雑した携帯S小断面のペースは、この技術を用いて微粒子を詳細に調べることができる。イメージング研究は、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて生細胞に拡張されている。光退色およびバックグラウンド蛍光を緩和することができる場合には、タイムラプスイメージングは、細胞骨格タンパク質の動力学および環境条件11,14に対する応答として調べることができる。これとは別に、 インビトロでのアクチンフィラメントのダイナミクスの可視化は、全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡法を導入することにより進めた。広視野顕微鏡法と比較して、TIRFが減少バックグラウンド蛍光と個々のフィラメント15,16を監視するための造影という利点を有する。これらの特性により、TIRF顕微鏡法は、原形質膜17,18で細胞構造を監視するために、細胞生物学者によって適合されている。細胞骨格の変化を含む細胞事象、、することができます低光毒性、最大コントラスト、最小のバックグラウンド蛍光19でリアルタイムに可視化すること。

より良いセル、全反射顕微鏡およびタンパク質のタグ付けに動き、ローカリゼーション、および細胞骨格タンパク質のターンオーバーにアクチン変異の影響を理解するために使用された。ここで、 サッカロミセス·セレビシエにおける細胞骨格アクチン動態における臨床的に関連する突然変異の効果を研究するための方法が記載されている。具体的には、アクチン結合タンパク質、Aip1pの局在化および運動は、アクチンにおけるR256H変異を発現する細胞中で可視化し、定量した。これらの技術は、in vitro生化学的研究で補完し、タンパク質相互作用や機能をより深く理解することを可能にする。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1。PB1996プラスミドへのクローニング

  1. デザインと注文DNA標的配列に隣接し、選択した親プラスミド中のユニークな制限部位を含むオリゴヌクレオチド製造会社からのプライマー。注：この場合、プライマーは、AIP1配列の5 '末端に400塩基対を増幅するように設計した。 XhoI制限部位は、約20bpのAIP1配列の前にプライマーに組み込んだ、とXmaI AIP1は、標的配列の後に約20塩基対を含めた。クローニングに用いたプラスミドは、蛍光用3XGFPタグ、酵母株選択のためのURA遺伝子、および細菌選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含むPB1996であった。
  2. 裏酵母一倍体株からゲノムDNAを精製する。注：クローン作成プロセスの図については図1を参照してください。
  3. いずれかの専用の制限部位とAip1p遺伝子を増幅するために二つのプライマーおよび酵母ゲノムDNAを用いた標準的なPCR反応を実行D。推奨されるプロトコルをメーカーごとに別々の反応において制限酵素でPCR産物およびPB1996プラスミドを消化する。この場合のXmaIおよびXhoIで1時間37℃で添付の緩衝液で使用した。
  4. 消化されたDNA断片を分離するために、0.8％アガロースゲル電気泳動を実行する。 1ウェル内に、低いDNA質量ラダーをロードして、別々のウェルに、各々の消化から全反応をロードします。色素の先端がゲルの終わり近くになるまで、約1時間、100ボルトでゲルを実行します。 UV光下でゲルを視覚化し、タンパク質のセグメントに対応するセグメントと切断プラスミドを精製した。
  5. 消化AIP1セグメントとPB1996プラスミドを連結。製造元のプロトコルを用いてDH5α細胞中に製品を変換（2分間42℃で、氷、熱ショックで30分間、100μlの細胞を有する10μlのDNA、37℃で2時間SOC培地中で増殖）と、培養プレート上にプレートつまり、この場合のLB +で、選択のための抗生物質を含んでAmpプレート。液体培養で1コロニーを選択し、成長する。新たに設計されたプラスミドを精製する。

2。変異酵母株の生成

  1. アクチン対立遺伝子変異酵母株を構築するために削除された半数体酵母株を使用してください。注意：この株は染色体アクチン遺伝子を欠いており、野生型酵母をコードするプラスミドが含まれているこの場合、親株は、ピーター·ルーベンスタイン（アイオワ大学）からの寛大な贈り物だったと建設はCook ら 20により記述されていた。アクチンとウラシル。
  2. 突然変異誘発の21のベースプラスミドとしてのTrp +選択とのPRSコードするプラスミド野生型酵母のアクチンを使用してください。
  3. アクチンにミスセンス変異を設計するのPRSプラスミド上の部位特異的突然変異誘発を行う。
    1. アクチンにおけるR256H変異について、彼の256のArg 256を変更するために、プライマー5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3」を作る。標準の突然変異誘発を実行ステップ2.2からのプラスミドを用いたPCR反応。
    2. DH5α細胞中にPCRから、変異アクチンプラスミドを変換します。プラスミドDNAを単離し、変異を確認するために、アクチン遺伝子を配列決定する。
  4. ステップ2.1からの半数体酵母株に変異酵母のアクチンをコードするプラスミドを変換します。
  5. 文化TRP-プレート上の形質転換細胞は変異酵母アクチンプラスミドを含むのTrp +を含む酵母を選択した。
  6. 5 - フル酸（5-FOA）を含有するプレート上TRP-プレートから継代培養細胞による野生型アクチンと（2.1で説明）ウラシルをエンコードし、元のプラスミドを欠いた細胞を選択する。 5-FOAは、機能的URA3遺伝子を発現賛否株で、毒性型、5 - フルオロウラシルに変換される。段階的に選択した後に成長した細胞のみが、変異アクチンプラスミドが含まれています。
  7. 新しい酵母株からのプラスミドDNAを精製する。アクチン遺伝子変異体が存在する保証するために、プラスミドを配列決定。このS使用さらなる研究で訓練。このプロセスを図2に図解されている。

3。酵母細胞にプラスミドの変換

  1. 酵母染色体への組込みを可能にする制限酵素でAip1p-GFPプラスミドを消化する。 NOTE：制限部位は、蛍光タグ、目的の遺伝子、および選択マーカーを含むシーケンスブロックの外でなければならない。この場合、37℃で8μlのDNAを、1時間に伴う10倍の緩衝液1μlでのHpaI制限酵素の1μlを使用する
  2. 文化S. 30℃でのホイールのYPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロース）中の5mlの一晩ウラシル（裏株）を合成することができない（工程2.5からの） セレビシエ細胞千X gでダウン5分間の細胞の1ミリリットルを紡ぐ。
  3. プレートの混合物を作る。のddH 2 Oで43 mlの1 MトリスpH7.5、5mlの250mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）2 mlを添加することにより10XTEを作る0を追加20mlの1XTEに酢酸リチウムの0.204グラム、次いで8ポリエチレングリコール（PEG）（MW〜3,300）のg及びフィルター滅菌し。
  4. ステップ3.2でスピンダウンした細胞から上清を除去し、残りの液体中の細胞を懸濁します。懸濁した細胞を、10 mg / mlのサケの精巣キャリアーDNAの2を添加する。ステップ3.1渦から消化したプラスミドDNAの10を添加する。プレートと渦の0.5ミリリットルを追加します。 1 M DTTおよび渦の20を添加する。
  5. 25℃で6〜8時間にわたって混合物をインキュベート熱は、10分間42℃の水浴中の細胞に衝撃を与える。彼らは、裏板に沈降してきたマイクロ遠心管の底部からの細胞のプレートを100μl。 2〜3日間、またはコロニーが形成されるまで30℃で培養する。
  6. 外裏板に個々のコロニーと連勝を選択します。注：これらの細胞は、成長を考慮して、染色体に組み込まAIP1-GFPおよび裏遺伝子を有するプラスミドを含んでいる。次いで、これらの細胞をmicroscoで使用されるPY。

4。全反射蛍光顕微鏡を用いてAip1pタンパク質運動の可視化

  1. 30℃で一晩ホイールにYPD中で組み込まAip1p-GFPで酵母細​​胞の培養を育てる9ミリリットルの浦のメディアへのサブカルチャー一晩培養物1ミリリットルを。それらが対数増殖期にあることを確実にするために、30℃でシェーカー上でさらに3〜4時間、細胞を増殖させる。
  2. ガラス顕微鏡スライドに細胞の3μLを加え、カバースリップを追加します。細胞は5分間スライドに解決することができます。ステージプレートの金具でスライドを置きます。
  3. 客観的な油浸100X TIRFとデジタルCCDカメラを用いて全反射蛍光（TIRF）顕微鏡（488ナノメートル）でAip1p-GFPタンパク質を観察します。 SlideBook 5.0ソフトウェアを使用して、（取得された画像の個々のフレームは、 図2Aに示されている）5コマ/秒の速度で20秒間の画像を得る。
    1. Cに集中するのエル、オープンSlideBook 5.0ソフトウェアとフォーカスコントロールにアクセスするには、ツールバーにフォーカスウィンドウのボタンをクリックします。 [スコープ]タブを選択し、100X-TIRF目的を選択します。上のランプの電源を入れ、15％、ランプバーをスライドさせます。 2×2にビンの設定を変更します。明視野にフィルタを変更してください。
    2. 顕微鏡、コンピュータの画面上で見られるように焦点に細胞を持って来るためにファインフォーカスダイヤルを使用しています。
    3. ランプをオフにし、フォーカスウィンドウ内のコントロールを使用して、ライブフィルタを変更し、TIRFM]ボタンをクリックします。
    4. 顕微鏡の右側ポートに接続されたTIRFM照明に、Onにレーザ発光を回す。
    5. フォーカスウィンドウ内のストリーム]タブを選択し、録音を開始してから、明視野]ボタンをクリックして次のチェックボックスをオンにします。
    6. TIRFM照明に、レーザーの入射角を調整するマイクロメータを回す。これは、AIP1-GFP病巣からの蛍光発光を最適化し、バックグラウンド蛍光を最小化するために使用される細胞とスライド。
    7. 所望の画像が表示されたら、[スタート]を押し​​ます。 20秒後、停止ボタンをクリックします。画像を保存します。メインメニューバーの[ファイル]タブの下で、名前を付けて保存するスライドを選択し、ファイルの場所と名前を入力します。
  4. 画像を分析するためにImageJソフトウェアを使用してください。蛍光Aip1p病巣の動きとレートを追跡するために、マクロプラ​​グイン「手動トラッカー」を使用してください。 0.2秒の時間間隔のパラメータを変更します。
    1. 追加トラックの選択を使用して、四から八結合フレームを通じて、個々の蛍光タンパク質を選択し、追跡します。終了トラックコマンドを使用して、各フレーム間のタンパク質の動きの速度が結果ウィンドウに表示されます。
    2. Microsoft Excelスプレッドシートを使用して、各フレーム間の平均速度を決定する。目的の各細胞株のためのAip1p運動の平均速度を計算するための値を使用します。 NOTE：Aip1p運動の速度および平均非線速度の散布図は、 ふぃぎゅに示されている図2（b）再。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

画像への方法は、細胞内の細胞骨格タンパク質のダイナミクスを提示されている。アクチン結合タンパク質、Aip1pは、GFPでタグ付けされた。タグ付けされた生成物をコードするプラスミドのデザインを図1に示す。プラスミドは、次いで酵母細胞に形質転換した。蛍光の発現はAip1p、細胞内でのタンパク質の挙動の可視化を可能にしたタグ付けされた。 Aip1pは、一般的にエンドサイトーシス22のサイトで、アクチンパッチに局在する。 図2Aに示すように、Aip1pの動きを定量化するために、50以上の蛍光Aip1p病巣は、10以上の細胞中で追跡した。平均速度は、各蛍光Aip1p領域（ 図2Bを参照）を算出した。野生型細胞では、Aip1pの動きは、セル間での範囲であり、それ以降表示されなくなります。野生型細胞におけるAip1pの移動の平均速度は1.60±0.42ミクロン/秒である。 cyのアクチンの異常な形態を有することが知られてR256H変異アクチンを発現する細胞、23 toAllでは、変更されたAip1p表現型を...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

病原性の変異による検査において細胞骨格と実用性のダイナミクスを可視化するための効果的な戦略は、ここに記載されている。高度な画像診断法は、細胞膜の近くにタンパク質の細胞内の動きを理解するための新しい機会を作成しました。全反射蛍光顕微鏡（TIRF）は、生きた細胞内の機能研究のための高感度の技法である。 TIRFはカバーガラスと、水性媒体の屈折率の差によるエバネッセント場を作成する角度のついた励起レーザーを使用しています。エバネッセント場のエネルギーは、フルオロフォアを励起するが、カバーガラスと水の間の界面の距離と共に指数関数的に減少する。これは、信号対雑音比及びカバースリップ/媒体界面上記50-250ナノメートルから強力な分解能と高い信号が得られる。これらの資質は、全反射顕微鏡を少なくして、生きた細胞内の単一分子レベルでの細胞骨格タンパク質を可視化するための強力なツールを作る光毒性および他の技術24に対して強化されたコントラスト- 26。

細胞骨格は、細胞のニーズに適応するために協調して取り組んで多数のタンパク質が含まれます。コフィリンによる...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者は、元PB1996クローンするための有用な議論と技術的なアドバイスのためのピーター·ルーベンスタイン、デビッドPellmanに感謝します。この作品は、ダイムの月からの助成金や子供のためのライドからの資金によって支えられている。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガローrpi9012-36-6
ブロモフェノール ブルーアムレスコ115-39-9
BSANEBB9001S
Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis KitUSB Corporation4166059
CutSmart BufferNEBB7204S
DNA、サケ精巣からの一本鎖Sigma9007-49-2
EDTA pH 7.4Sigma93302
Ethidium bromideInvitrogen15585-011警告!有害な刺激
真菌/細菌 DNA キットSymo ResearchD6005
HpaINEBR0105S
酢酸リチウムAlfaAesar6108-17-4
低 DNA 質量ラダーInvitrogen10068-013
NE バッファー #4NEBB7004S
Platinum PCR SuperMix High FidelityInvitrogen12532-016
Miniprep KitQiagen27106Any kit will work
Quick Ligation KitNEBM2200S
Sodium azideSigma26628-22-8
PBSInvitrogen10010-023
PEGAmresco25322-68-3
Tris Base Ultrapurerpi77-86-1
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromega2015/01/
XhoINEBR0146S
XmaINEBR0180S
YPD メディアLabExpress3011-URA
メディアLabExpress3010
PCR MachineInvitrogen4359659どんなPCRマシンでも使えます
TIRF顕微鏡オリンパス IX81
浜松 ORCA-Rカメラ浜松
ス 06

参考文献

  1. Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
  2. Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
  3. Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
  4. Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
  5. Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
  6. Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
  7. Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
  8. Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
  9. Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
  10. Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
  11. Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
  12. Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
  13. Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
  14. Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
  15. Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
  16. Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
  17. Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
  18. Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982(2012).
  19. Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
  20. Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
  21. Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
  22. Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
  23. Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
  24. Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
  25. Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
  26. Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
  27. Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

R256H TIRF GFP
Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。