このプロトコルは、ホルマリン固定、パラフィン包埋生検組織におけるサイトメガロウイルスのqPCR検出について説明しています。これは、迅速で、感度が高く、特異的で、曖昧なヘマトキシリンとエオシン、または免疫組織化学染色パターンの解釈に役立ちます。
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方法論記事
定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、
この記事について
サマリー
要約
これは、重症感染症を開発するための彼らの大きなリスクを考えると、胃腸（GI）免疫抑制患者の管内でのサイトメガロウイルス（CMV）感染を識別することが重要です。 CMV感染の検出のための多くの実験室方法は、血清学、ウイルス培養、および分子の方法を含む、開発されている。多くの場合、これらの方法は、CMVによる全身の関与を反映し、特に局所的な組織の関与を特定していない。したがって、GI管におけるCMV感染の検出は、しばしば、生検組織の伝統的な組織学によって行われる。免疫組織化学（IHC）に連動して、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、これらの生検を調べた柱が残っている。 H＆EおよびIHCは時々の解釈を困難にし、非定型（あいまい）染色パターンになる。これは、CMVの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）が正常に非常にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織生検を行うことができることが示された高い感度および特異性。このプロトコルの目的は、臨床検査の設定でのFFPE生検組織におけるCMVの検出のための定量PCRテストを実行する方法を示すことです。この方法は、GI生検におけるCMVのための曖昧な染色例の患者のために非常に有益である可能性が高い。
概要
臨床検体中のサイトメガロウイルス（CMV）感染の解釈は非常に重要である。 CMVはヘルペスウイルスのbetaherpesvirinaeサブファミリーのメンバーである。他のヘルペスウイルスと同様に、CMVはアクティブなウイルス複製1の欠如を特徴と持続性または潜伏感染を確立する能力を持っています。ウイルスの再活性化は、疾患の症状2-4を伴うことがあるビリオン放出を特徴と活発なウイルス複製につながる、ストレスや他の免疫抑制の時間帯に発生する可能性があります。胃腸（GI）のCMV疾患の症状が頻繁に腹痛および/ または血便1が含まれています。
組織学によるCMV胃腸炎の診断は、CMVウイルスの介在物を同定するためにヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）を利用する。臨床的疑いが高く、まだ明らかな介在物が観察されない場合において、免疫組織化学（IHC）は、しばしば補助試験法として使用される。しかし、IHCまた、解釈が難しい（ 図2）5作る珍しい非古典登場する携帯染色パターン（あいまい）によって妨げられることができる。なお、GI生検においてCMVを検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）GI生検組織および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）から抽出したDNAを使用することが求められていた。この技術は、GI生検においてCM....
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プロトコル
治験審査委員会の承認を得て、電子実験室のデータベースの検索は、胃腸内のサイトメガロウイルス（CMV）感染例組織病理によって診断（GI）生検（ヘマトキシリンを表す（FFPE）ブロックと組み込みホルマリン固定、パラフィンを特定するために実施されたエオシン（H＆E）および/または免疫組織化学（IHC））。
FFPE GI生検組織からの1。組織処理
- サイトメガロウイルス（CMV）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）のためにFFPE GI生検組織ブロックを集める。これらのブロックは、室温で保存されている。
- ブロックの固有の識別番号を事前にラベル1.7ミリリットルのマイクロチューブ。
- ミクロトームのハンドホイールをロックします。
- カセットクランプに組織ブロックを装着します。
- 新しい未使用のブレードを使用して、ミクロトームナイフ角度にブロックの位置を合わせます。
- 厚さ10μmの部分をカットするミクロトームを調整します。
- 目のロックを解除Eのハンドルとブレードに向かってブロックを進める。
- 各カットは、組織のスクロールにロールバックできるように、厚さ10μmの間隔でブロックの5つのセクションをカット。各スクロールが必要な生検組織の適切な表現が含まれていることを確認してください。
- ミクロトームのハンドホイールをロックします。 ....
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結果
228組織ブロックの合計91サイトメガロウイルス（CMV）陽性組織学および陽性免疫組織化学（IHC）に基づいてケース、あいまいCMV IHC 18、および79ネガティブコントロールで構成された定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により試験した。 図2に示すように、CMV陽性症例は、典型的なCMVウイルス封入体（A）および/ または陽性IHC染色（B）を実証しているであろう。ネガティブコントロールがない不審な組織学またはIHC染色5を示さなかったであろう一方、疑わしいケースは、稀な、非古典的な登場染色パターン（C）を証明したであろう。
組織病 理によるCMVのための肯定的な91検の、88は定量PCR（ 表2）で陽性であった。伝統的な組織学に基づいた真陽性の定義では、典型的なCMVウイルス介在物および/ または一般的なCMV IHC、すなわち 、これらのデータは、.......
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ディスカッション
多くの実験室的方法は、最近実証されたように、血清学、ウイルス培養、分子ウイルス血アッセイ、生検材料の組織学、および、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）生検の分子アッセイを含む、サイトメガロウイルスの診断（CMV）感染にご利用いただけます組織5,6。血清学的検査は、診断の主力一度のみ確実に露出を識別し、急性CMV感染7とよく相関しない。ウイルス培養、両方の従来の初期抗原シェルバイアルを、後者の8例で最高の2〜3日で、長時間のアッセイ時間によって妨げられる。分子ウイルス血アッセイは、ほとんどが治療効果9-11を監視するための定量的な可能性を有するという利点を有する、開発されている。胃腸（GI）管の局所的関与の臨床懸念がある場合には、残念ながら、ウイルス血アッセイは、全身の関与を反映し、特異的に局在感染を識別しない。そのため、HistologyはGI管のCMV感染を識別するためのゴールドスタンダードとなっている。
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
我々は、図面の製造における彼らの努力のためにこの原稿を準備し、フレドリックSkarstedtとライアン·クリスティと彼女の援助のためエイミートマソンを認める。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.7 mlマイクロフュージチューブ | Costar | 3620 | |
| 鋸歯状鉗子 | 電子顕微鏡サービス | 62086-1S | マイクロ鉗子 MF-1 |
| 卓上遠心分離機 (マイクロフュージ) | エッペンドルフ | 5424 | |
| キシレン | フィッシャー | フィッシャー サイエンティフィック: X3P | 1 ガロン |
| エタノール | フィッシャー フィッシャーサイエンティフィック: ET108 | 96-100% | |
| ミクロトーム | ライカ | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE 組織キット | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR サプリメントキット | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler 遠心分離機 | ロシュ | 75005087 | |
| LightCycler 冷却ブロック | ロシュ | ||
| LightCycler キャッピングツール | ロシュ | 3357317 | |
| 色補正キット | ロシュ | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl キャピラリー | ロシュ | 1 909 339 | |
| ブレード | サクラ | ッシャーサイエンティフィック: 4689 | アキュエッジ ロープロファイル |
参考文献
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day ....
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再版と許可
