プロテオームとトランスクリプトーム解析のための蜘蛛から毒の抽出と毒液腺Microdissections

毒は主に捕食や防衛のために別の動物に注射し、動物の分泌物であり、また、生物医学関連性^1-3との重要な生物学的なアプリケーションを持っている。唯一の特定の動物は毒を合成するが、それは進化して独立しているため、その生産は、無脊椎動物（ 例えば 、刺胞動物、コーンカタツムリ、サソリ、クモ）および脊椎動物（ 例えば 、ヘビ、いくつかの魚や哺乳類）全体の分類学的に広まっている複数回^1,4 。毒の生化学的特徴付けは、典型的には、主に急速に構成毒素^1を送達するために注入された動物の循環系および神経系に作用するタンパク質およびペプチドの多様な、から構成されて示されている。有毒動物のごく一部には、ヒト、synanthropic分布⁵で特に種に脅威を与えることがあります。毒組成および機能活性の研究が重要な役割を果たしてきました機能的な脊椎動物の細胞成分（特に、神経細胞のイオンチャネル^）6の特性と基本的な細胞プロセスを解明する（ 例えば神経分泌^）7。また、選択毒ペプチドは、癌および疼痛^8,9の治療としてのそれらの使用を含む生物医学の文脈において有用な特性を有する、候補薬物リードおよび抗毒素の開発のために採掘されている。毒はまた従って、これらの危険な分泌物の収集は多くのユーティリティを持って、生態学と進化の研究^1,4,10,11において顕著な役割を果たしている。

そこに蜘蛛（クモ目秩序）の>4万説明し種があり、100以上のクモファミリーの1つを除くすべてが牙¹²で終端ペア毒腺を持っている。クモの高い種の多様性は、彼らが毒の生物の最大のクレードを表すことを示唆している。しかし、クモ毒の生化学的特徴付けは、Lを有しargely最も頻繁に人​​間毒物注入に関連した種の数が少ないに集中した。クモ毒の最近のプロテオミクスとトランスクリプトーム研究は、彼らは通常、多くのユニークなタンパク質およびペプチド^2,13,14を含んで示している。高スループットcDNAの配列決定および質量分析ペプチドフィンガープリントの進歩は著しく、これらの毒タンパク質¹⁵の発見を容易にした。それにもかかわらず、このような作業は、このような技術のためのクモから十分な毒および/ ​​または毒液腺の収集、および詳細なドキュメントで始まり、いくつかの¹⁶である。

本論文では、同様のサイズのクモに適用することができ、黒の未亡人のスパイダーからの毒と毒腺の収集のためのプロトコルを提示します。別々腺からの毒のコレクションは、他の細胞の機能を実行するタンパク質とは対照的に、毒液中に分泌されるタンパク質の同定を可能にする。黒い未亡人や他のL種atrodectus広く、時には多量の発汗、筋肉の収縮、高血圧、呼吸困難や斑状麻痺⁵が付属して、ヒトでの激しい痛みを引き起こす彼らの非常に神経毒性毒に起因最も危険なクモ、間にあるものとして認識されている。ここで紹介する毒収集プロトコルは、筋収縮と毒のリリースを引き出すために麻酔をかけ、スパイダーに電流を提供するために電気刺激を使用しています。毒滴が迅速にマイクロキャピラリーを用いて収集し、冷凍保存のためのチューブに分注される。プロトコルは危険な手順が含まれているので、それだけで十分な訓練を受けた個人によって行われるべきであると注意が重要なステップで付勢されている。収集された毒は、生理学的実験または機能アッセイ¹⁸のためのこのような構成分子²の特徴付け及び単離のような多くの用途を有し、そして毒遺伝子発現^11を刺激すること。プロトコルはDESCRで締めくくり毒特異的遺伝子のクローニングに有用な毒液腺解剖と保存のiptionは、の発現が異なるクモ^10,11における毒枯渇後の2-3日に起こることが示されている。

電気刺激装置の作製

1. コンセントと外部信号入力​​に外部フット·ペダルを接続する電気刺激装置の電源コードを接続します。
   注意：電気配線が適切に絶縁されなければならず、電流を供給露出した金属が触れてはいけません。保護のためにラテックスまたはニトリル手袋を着用してください。電源コードを取り付け、ワイヤーを取り付ける際に電気刺激電源スイッチがOFFの位置にあるべきである。
2. （極性スイッチが通常モードにあるとき）、電気刺激の赤い出力端子に正極を接続し、黒の出力端子に負極を接続する。注：各電極線は、ワニ口クリップで終端する必要があります。
3. 次の推奨初期設定に刺激を設定します。電圧= 7 V、毎秒周波数= 1パルス、ディレイ= 0ミリ秒、持続時間= 200ミリ、ツインパルスは=定期的な切り替え、モードスイッチ=オフ。
4. voltmeするワニ口クリップを取り付けることにより、電極のテスト出力TER正と負のテストリード。刺激の電源スイッチをオンにして、フットペダルと電流を供給。

固定化鉗子及びその他の材料の作製

1. 液体プラスチックコーティングにフェザー級鉗子の1の突起を浸し、コーティングを乾燥させるために4時間待つ。しっかりと結び目でエンドを結ぶことにより、綿の縫製糸の単層、およびセキュアな糸で、対向する突起の先端部の15ミリメートルを包む。
   注：スレッドは、プラスチックコーティング、現在遅延させるために絶縁を提供するが、導電性を促進適用食塩水を吸収するために使用される。
2. 鋭いハサミで鈍い皮下注射針の先端をカットし、サンドペーパーで口を滑らかに。チューブを介して真空廃棄物トラップ（ 例えば 、真空フィルターフラスコ）に針を取り付けます。
   注：ニードルは、水を離れて吸引し、逆流、および刺激電極によって作成された回路を完成するのに役立つであろう。針開口μstが目詰まりすることなく、真空ソリューションにまだ十分に大きな、クモに害を与えない程度に小さいこと（ 例えば 、25のGゲージ×1 1/2物質一覧を参照してください）。
3. 底の上部とスレッドコーティングされた突起上の鉗子のプラスチックコーティングされた突起を持つビューの解剖顕微鏡の視野の下で、磁気ベースまたは固定スタンド装置に固定ビニールで覆われた二股のクランプを使ってしっかりと閉じた位置に水平に位置フェザー級鉗子。
   注：二股クランプはクランプホルダによる磁気ベースに静止位置に維持されている（材料リストを参照してください）​​。ゴムバンドは、しっかりと一度導入クモの周りに閉じた位置にフェザー級鉗子を保つために追加の圧力を加えるために、次のクランプホルダーに、フェザー級鉗子の突起の周りに固定してもよい。
4. スレッドの上流に鉗子「ボトムのプロングに正極ワニ口クリップを取り付け、金属製の真空針を鈍ら負ワニ口クリップを取り付けます。 スレッドとワニ口クリップの間に鉗子のプロングに正のリードを配置し、鈍真空針に負のリードを配置することによって、電圧計を使用したテスト回路の電流。十分な電流が検出されたことを確認し、十分な電流が検出された場合に、リードを除去するためのプレスフットペダル。
5. 毒のコレクションのためのいくつかのマイクロキャピラリーチューブを準備します。ブンゼンバーナーの炎の上に水平に鉗子開催エンドを置く、手袋をはめた手で、そして滅菌金属鉗子でもう一方の端に一端で、単一のマイクロキャピラリーチューブを開催しています。静止位置にもう一方の端を保持しながら、細長い先端部を作成するために離れて炎からの金属鉗子でマイクロキャピラリーを引っ張る。
   注：マイクロキャピラリーが簡単に破断することができますように、保護メガネを着用してください。
6. シャーレに取り付けパテストリップ上に準備されたマイクロキャピラリーを休ま。マイクロキャピラリーは、解剖顕微鏡下で終了し、滅菌した金属鉗子で引っ張っ端にある小さな、ベベル開口部を作成調べます。
7. ラ滅菌0.5ミリリットルチューブのベル可変数。滅菌チューブ（ 例えば 、オートクレーブの脱イオン水5μl）を滅菌脱イオン水を加える。氷の上を閉じ、チューブと場所チューブ。
8. ビーカーに生理食塩液を調製し、オートクレーブ処理水と第二のビーカーを埋める。

鉗子でスパイダー3.固定化

1. 長い金属鉗子を用いてCO ₂チャンバー内に（材料リストを参照してください）バイアルを収集し、閉じたプラスチックからのCO ₂のタンクと転送クモをオンにします。
   注：黒い未亡人のスパイダーは、危険な毒を持っています。常にこのプロトコル中に手袋を着用してください。
2. 5〜10分間、または麻酔し、もはや静かに長い鉗子で突いたときに移動するまで、チャンバ内のクモを保つ。食塩水で鉗子にスレッドを湿らせるトラ​​ンスファーピペットを使用してください。
   注：黒い未亡人のためのCO ₂麻酔パラメータのガイドラインについては、スペイン広場とムーア¹⁹を参照してください。
3. CO ₂から麻酔をかけたクモを取得鈍い解剖鉗子や手袋をはめた手を使用して、その前方の足でそれを拾うことによってチャンバー。鉗子装置はフェザー級に麻酔をかけクモを移動します。独立したクローズドフェザー級鉗子の突起と突起の間に蜘蛛の頭胸部を配置し、突起がクモを確実にするために、シャット閉じることができるように所定の位置にしっかりと保持されているが押しつぶされていません。正極は一番下の突起に付着したままで、クモがスレッドコーティングされたプロング上に載っている、（クモ解剖するためのガイドのためのFoelix ^20を参照）を下方甲背側に配置され、甲羅の腹側がプラスチックコーティングに直面していることを確認してください。クモを取り扱う際は迅速に作業。
4. 蜘蛛の鋏角と牙がはっきりと見えるようになるまでの顕微鏡倍率、フォーカス、および光源を解剖調整します。

4.ヴェノムコレクション

1. シリンジnをひっくり返した第二鈍を用いて水溶液で真空及びスプレースパイダー鋏角をオンにするeedle。不純物を除去するために真空針で水を離れて吸引する。
2. クモ演壇に付着した負極を備えた真空針をタッチし、フットペダル一回以上のパルスを提供します。必要であれば真空は離れて逆流。
   注：クモの演壇は鋏角とendites（詳細なクモの解剖学のためのFoelix ^20を参照）との間に背側表面に鋏角する口の後部の内側にある。注：各パルスでは、クモの足契約および毒液が牙から現れる明確な液滴として表示されます。
3. 毒を集める（溶液がキャピラリーに吸い込まれる）水または緩衝液で0.5ミリリットルチューブにマイクロキャピラリー先端と転送キャピラリー先端で滴。
   注：血リンパ汚染や死につながる可能性が毛細血管でクモを穿刺避ける。また、紡糸口金からシルクや接着剤で毛細血管の汚染を避ける。
4. チューブ（収集先端と反対側の端部で）マイクロキャピラリーへのアダプタおよびdで転送シリンジを取り付けバックチューブにispense毒ソリューション。チューブを氷上に置く。
   注：近くの鋭利物容器に廃棄物の毛細血管廃棄してください。
5. クモに近いそのキャップと一緒に、オープンなプラスチックの収集バイアルを置きます。慎重に鈍鉗子かつ迅速近いキャップでバイアルを集めるにクモをスライド、もう一方の手で片手で保持鈍い解剖用ピンセットでクモの脚と慎重に開いているフェザー級鉗子プロングを把握する。終了したら、-80℃の冷凍庫内の次のクモや店舗毒-含むチューブに進みます。
   注：バックバイアルに鉗子からクモを移動するときは注意して運動を続ける。収集バイアルとキャップは、その迅速な転送のためのスパイダーに近くなっていることを確認しますと手袋を着用してください。

5.毒腺解剖

1. 毒採取後2対三日間、CO ₂チャンバー内でクモを麻酔（ステップ3.1を参照）。解剖顕微鏡の隣に液体窒素キャリアと場所を記入してください。
   注：WH液体窒素での作業途中で、目の保護と極低温の手袋を使用しています。
2. クリーンな解剖エリアとRNaseとDNAの混入を排除ソリューションで解剖鉗子。バッファー（ 例えば 、1X生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）バッファ）解剖と解剖顕微鏡下に置かれた小さなペトリ皿を埋める。
3. 皿のペトリかつ迅速腹部から頭胸部を分離するために鉗子を使用するようにCO ₂室からクモを転送します。
4. ピンセットで解剖顕微鏡下で頭胸部を持ち、視野内に鋏角を配置。鋏角の横方向の側面を甲羅に入社キューティクルをカットする鉗子の第二対の鋭い端を使用してください。横方向に鉗子の第二の対を使用して、鋏角を持ち、静か毒腺が引き出されるまで、前後に引っ張る。
5. 鋏角とは別の腺cyrosafe 0.5ミリリットルチューブに転送（または残す必要に応じて、鋏角に取り付けられている）。クロを置く液体窒素中で編管。
   注：各解剖はこれ以上15分以上を取る必要があります。
6. 仕上げまで追加のクモで解剖を繰り返します。 -80℃の冷凍庫内に液体窒素から移送管。

毒と毒腺解離の集合は、しばしば配列レベル10,11,15で毒タンパク質およびペプチドを特徴付けるために実施される。収集された毒はまた、それらの機能的活性18を決定するために、生理学的ア ​​ッセイにおいて使用され得る。毒のコレクションは、それによってRT-PCR 10,11を介して、特定の毒素転写産物のクローニングを容易に毒腺遺伝子発現を刺激する。毒タンパク質の同定はまた、15,21毒腺cDNAライブラリーから生成された配列データベース標準質量分析技術を統合することにより、ハイスループット様式で行うことができる。このような作業の例は、毒液腺その有効性を実証し、上記で詳述したプロトコルを使用して収集から開始して、 図1に示されている。

L.から収集毒Hesperusの成人女性をトリプシンで消化し ​​、溶液中に供したタンデム質量分析（MS / MS）をHPLC（高速液体クロマトグラフィー）を結ぶMuDPIT分析。ここMuDPIT分析はプロテオミクスコンソーシアムアリゾナ大学によって行った。 （スペクトルから推測された娘イオン）を検出するペプチドの質量及びそれらの解離フラグメントは、理論的にはL.から構築遺伝子発現ライブラリーから得られたcDNA配列の翻訳から予測されたペプチド配列と比較したHesperusの毒腺21（腺切開プロトコルによって取得された、上述した）。この実験では、36のタンパク質は、99​​.9％の確率閾値で、すべての収集されたスペクトルから検出され、かつ少なくとも1つの検出されたペプチドを含有していた。検出されたタンパク質の一つはタンパク質配列（ 図1B）の35％をカバーする三排他的ペプチドに対応する、43の合計スペクトル（ 図1Aに示される模範スペクトル）によって支持されている。 collecteから翻訳検出されたタンパク質（ D cDNAは）L.からlatrodectinするトップのBLASTpヒットした図2e-46の電子スコア、およびこの実験で検出されるタンパク質とアミノ酸配列レベルでの株式80％の同一性を有するtredecimguttatus（GenBankアクセッション番号P49125.1）。また、α-ラトロトキシン低分子量タンパク質として知られているLatrodectinは、クロゴケグモの認識毒成分が提示プロトコルの有効性を検証し、22、23、スパイダーある。毒から同定されたいくつかのタンパク質はBLASTヒットが検出されないれる配列に対応する。未知のタンパク質が、毒汚染物質を表し、またはので、それは、クモのために利用可能な限られたゲノムリソース、ならびにそれらのタンパク質のための制限された機能情報にそのような結果があるかどうかは不明である。それにもかかわらず、遺伝子またはタンパク質の発現は、それが本物の毒の成分であるかどうかを明らかにする必要があり、他の組織に比べて毒腺におけるこのような新規タンパク質の存在量を調べる分析する。

著者は、開示することは何もなし競合する経済的利益を持っていません。