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方法論記事

新生児肝外胆管細胞を単離する

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DOI：

10.3791/51621

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2014年6月5日

 , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Medicine, The Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

新生仔マウスの肝臓外胆管から胆管を単離するための技術が記載されている。ダクトは細心の注意を払って解剖し、その後、細胞が厚いコラーゲンゲル中で成長することによって単離される。この方法では、肝外胆管の開発および病理学を研究するための有用なツールを提供しています。

要約

肝内および肝外胆管は、発生的に区別され、かつ差次特定の疾患によって影響を受ける可能性がある。しかし、内および肝外胆管、および新生児と成人細胞との間の相違点は、よく理解されていない。

肝内胆管から胆管細胞を単離するための方法は当1-4確立されている。これは明確な胆管集団間および肝外ダクトをターゲットに表示されるような胆道閉鎖症などの疾患を研究の違いを理解する上で非常に有益であるが、特に新生児の肝外管細胞の単離は、まだ記載されていない。ここで説明は、新生児および成人の両方のマウス肝臓外胆管細胞を単離するための最適化技術である。この手法は、線維芽細胞のような間葉系細胞から、最小限の汚染との純粋な細胞集団が得られます。

このメトDは、肝臓外管および胆嚢の除去に基づいて細心の解剖が続き、脂肪や線維芽細胞層を除去するスクレーピングされている。構造は、その後、トリプシン処理することができ、実験的な使用のためにメッキを再単層、内胆管の伸長を可能にするために約3週間のコラーゲン培養の厚い層に埋め込まれている。

概要

内および肝外胆管の起源と発展は著しく異なっている。肝臓は、腹側前腸内胚葉5の憩室から開発しています。頭蓋領域は肝内胆管5を生成しながら、憩の尾側領域は、肝外胆管を形成している。肝内胆管、ダクトは、ポータル周囲領域6に、管板の周囲に前駆細胞に由来する。これらの細胞は、肝細胞または胆管6のいずれかに分化する能力を有する。これはcholangiopathiesは、特に胆管の1カテゴリを標的にすることができることを考えると重要な臨床的意義を持っています。アラジール症候群は肝内管に影響を与えながら、例えば、胆道閉鎖症は、最初は、新生児の肝臓外管に影響を与えます。

マウスおよびラットの肝内胆管や胆管ユニットの単離の複数の記述がある。でvestigatorsは、ダクトの単離およびその後の伸長によって、または特定の細胞表面マーカーを発現している胆管1-4のダウン肝臓消化および抗体プルで単一細胞を単離した。官能偏胆管ユニットは、肝臓消化およびサイズ濾過7によって単離されている。胆管ユニットは、単離された胆管細胞は、インビトロで 1,2小管構造を開発することが示されているが、刺激して分泌液分泌7を実証するために応答することができる。これらの方法の制限は、消化酵素で、肝臓灌流のための専門的な技術的専門知識や特殊な装置の必要性があります。また、間葉系細胞3による汚染の危険性がある。

具体的には新生児肝外胆管から、肝外胆管胆管を単離する方法は、以前に記載されていない。本論文では、新生児Aを分離するために簡略化された手法の概要を説明純度の高いレベルで成人肝外胆管細胞として周知だ。この手法は、内および肝外胆管と肝外ダクトを伴う胆道閉鎖症などの病気のメカニズムの研究の違いの研究を促進する。

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プロトコル

特に断らない限り、全手順を室温で実施される。全ての動物の仕事は地元の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルの下で人道的な条件の下で行われるべきである。

1。機器の製造とソリューション

  1. 組織培養フード、インキュベーター（ 図1A）に近接してマウス手術台をセットアップします。注意：必要とされる装置は、解剖顕微鏡、光源、12.5センチメートル長い直線アイリスはさみ、細かいチップを備えた6インチの非鋸歯状に湾曲した鉗子、湾曲した先端（ 図1B）と4インチの鋸歯状の鉗子が含まれています。
  2. 手術台に70％アルコールのガラスビーカーに滅菌機器を配置します。
  3. 無菌分離培地（ 表1）で3無菌60ミリメートルペトリ皿を埋める。手術台に2つ、フード内1、氷の上のすべてを置く。
  4. ラット尾コラーゲンを置き、滅菌した10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、滅菌水、滅菌1 N NaOHおよび組織培養フード内胆管上皮細胞（BEC）培地（ 表1）。注：コラーゲンは、氷の上でなければなりません。

2。胆管の単離および培養

  1. 意識不明の頸椎脱臼が続くまで、動物実験委員会のガイドライン（ 図1C）ごとに、二酸化炭素に曝露することによって、生命の0-3日の間、新生児マウスを安楽死させる。
    注：高齢のマウスは、特定の実験の必要性に応じて使用することができる。
  2. 仰臥位で動物を置き、骨盤の領域での正中線を横切る小さな横切開する。横方向にこの切開を拡張し、腹部の両脇まで、U字型のフラップを形成する。腹部臓器を露出するためにフラップを上げます。腹部が開いたら、慎重に肝臓のより良い視覚化のための動物の右側に腹腔と総胆管から腸を動かす。注：肝臓のより良好な識別を得るために、胸郭内に横方向の切開部を拡張する必要があるかもしれない。
  3. 解剖顕微鏡を用いて、総胆管、肝臓、及び腸を識別する。構造は非常にデリケートであるとして、注意を使用して、最初に総胆管（図1D）を特定します。鋸歯状と非鋸歯鉗子で、細心の注意を払ってきれいで胆汁を取り巻く脂肪などの結合組織を狙い撃ち。きれいにダクトやその他を保持するために1鉗子を使用してください。
  4. 胆嚢をきれいに同様の技術を使用しています。
  5. 氷上の分離培地の最初の皿にきれいにダクトや胆嚢を配置します。メディアでさらに結合組織を除去し、胆嚢から胆汁を削除しながら、静かに非鋸歯鉗子で構造体をマッサージします。
  6. 分離培地の第二の皿にダクトや胆嚢を転送します。
  7. 5匹の動物からのダクトや胆嚢の単離後、転送フード内の第三のシャーレにピース、。注：細胞は、5つ以上の動物から単離さする場合は、5匹の動物のグループごとに新鮮な溶液を使用して、バッチで行う。
  8. 組織培養フードに厚いコラーゲンゲルを準備します。
    注意：任意のサイズの皿を用いることができる。 5新生児のグループごとに3ミリリットルのコラーゲンの最終体積で60ミリメートル培養皿はうまく動作します。これは新たに単離したダクトを埋め込み時の新鮮な準備する必要があります。
    1. 氷上でラット尾部コラーゲン、無菌の10×リン酸緩衝生理食塩水（10×PBS）、無菌のdH 2 O、および滅菌1NのNaOHを置く。
    2. のdH 2 O、10×PBS、NaOHおよび1×PBS中で2 mg / mlのコラーゲンの最終濃度を有するゲルに必要なコラーゲンの体積を計算し、0.023倍に等しい1 NのNaOHの体積を用いたコラーゲンの量を添加した。注：コラーゲンの代替ソースを使用する場合、中和およびゲル形成のための製造業者の指示に従う。
    3. 一緒のdH 2 0、1を混ぜるPBS、そして1N NaOHを0X、その後でも混合を確実にするだけでなく、コラーゲンとピペットを追加します。
  9. コラーゲン溶液は、室温でゲル様コンシステンシーに増粘された後、直ちにコラーゲンダクトを埋め込む。
  10. 5％CO 2で30分間固化させたコラーゲンを可能にするために、37℃のインキュベーター内に置く。
  11. ゲルは、（透明から白への色変化）、BECメディア（ 表1）の3.5ミリリットルでオーバーレイを固化し、37℃、5％CO 2でインキュベートしたら。
  12. BECメディアを週に3回を削除し、3.5ミリリットルの新鮮な培地と交換してください。

太いコラーゲンゲルから3。遮音プライマリ胆管

注：3週間以内に、胆管のシート（埋め込みダクトから直接伸び、大きな核を有する細胞）の厚さのコラーゲンに表示されます。皿中の線維芽細胞の多数が存在する場合、それは破棄されるべきである。皿のいくつかの領域がある場合は線維芽細胞成長は、これらが外科用メスで切り出し、前の胆管を分割に除去することができる。

  1. 薄いコラーゲンゲルを準備します。
    1. 滅菌PBSで1 mg / mlのコラーゲンの濃度に希釈する。注：100ミリメートル板に1ミリリットルを使用します。他のサイズの料理のためにそれに応じて調整してください。
    2. セルスプレッダー（大食器）またはピペットチップ（小皿）で均等にコラーゲン溶液を広げ、その後、10分間室温で残す。
    3. カバーDMEM/F12でプレートし、10分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。
    4. インキュベーターからプレートを取り外し、1×PBSで洗浄します。すぐに1X PBSを吸引除去する。
    5. プレートを回転させたり、シェーカー上のプレートを配置することによって拡散コラーゲンの第二の薄膜層で被覆する。 10分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。
    6. コラーゲン後DMEM/F12と、カバープレートを凝固し、30分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。
  2. 目から細胞を分割ICKのコラーゲンゲル：
    1. それが浮遊しているように、細胞培養ヘラやセルスクレーパーで、プレートから静かにコラーゲンゲルをこすり。
    2. DMEM/F12に10 mg / mlのように入力XIコラゲナーゼ（素材リストを参照してください）​​で希釈することによりコラゲナーゼ溶液を調製する。よく混ぜ、滅菌フィルター。
    3. 太いコラーゲン中の細胞の60ミリメートル皿当たりコラゲナーゼ溶液（上記）の1ミリリットルを追加します。 （3ミリリットルでなければなりません）BECメディアを抜かないでください。 37℃、5％CO 2で30分間皿をインキュベートする。
    4. 細胞を含む溶液を除去し、15ミリリットルコニカルチューブに入れます。
    5. 5分間2200×gでスピンダウン。上澄み液を捨て、DMEM/F12の似た量のペレットを中断再。
    6. 5分間2200×gで再びソリューションをスピン。上清を取り除きます。
    7. 再懸 ​​濁し、0.5％トリプシン3ml中のペレットを、5分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。インキュベーション後、胆管のシートを分割する上下ソリューションをピペット。 BECメディアAの5ミリリットルを追加します。5分間1500×gでNDスピンソリューション。
    8. 5分間1500×gで解決策をスピンして、DMEM/F12中で上清を除去し、ペレットを再懸濁し。
    9. 上清を除去し、BECメディア（ 表1）でペレットを中断して再。以前に行った薄いコラーゲンゲル上のプレートの細胞。

細胞の4。通路及び保管

注：必要に応じて薄いコラーゲンゲル上で細胞が分割することができる。

  1. 前10〜15分間、37℃で0.25％トリプシンでインキュベートする滅菌PBSでプレートを洗浄します。
  2. BEC培地の等量を中和し、5分間、1,500×gでペレット。その後、5分間1500×gでペレット化し、DMEM/F12でペレットを洗浄します。
  3. コラーゲンコーティングされた細胞培養皿に配布するためのBECのメディアに再懸濁細胞。
    注：あるいは、細胞は、記憶媒体に再懸濁し、-80°Cの冷凍庫または液体窒素（ 表1）に記憶することができる。

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結果

K19の免疫蛍光染色（ 図2Aおよび2B）によって示されるように、優れた純度の新生仔マウスの肝臓外胆管細胞集団の単離は、このプロトコルの使用により、;我々は、成体マウスから細胞を単離する同様の結果を得る。我々はそれが厚いコラーゲンゲル上で単層を形成するために、新たに単離された胆管の細胞のための3週間かかりますことを観察した。胆管細胞は、孤立したダクトからの細胞のシートを形成し、厚いコラーゲン全体で直線的に成長する。単層が生い茂っなる前培養物は3週間前に分割されていない場合は、穴が細胞シートに表示されるので、細胞は、分割され、薄いコラーゲンゲル上で再播種する必要があります。最適な細胞増殖および線維芽細胞の汚染を最小限にするためには、切開及び洗浄工程（2.3、2.4）の間に細心の注意を払って慎重かつ繊細な肝臓外管を周囲の結合組織を除去することが重要である。線維の成長があった場合芽、メスまたは穏やかな吸引厚いコラーゲンの患部の除去は、従来の分割細胞への線維芽細胞の移動を減少させることができる。これらの細胞は、最初の3つの通路の間に急速に分裂するが、より高い通過点で、成長速度は遅くなり、細胞が大きいと空胞化と...

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ディスカッション

ここで説明するには、新生児を含むすべての年齢のマウスのマウスの肝外胆管、胆管から純粋に分離する技術である。技術は肝外胆管は、肝内胆管から別々に研究することができるという利点を提供しており、細胞のこれらの集団の主な違いを識別するための研究を容易にすることができる。我々は最近、この方法によって単離された肝外胆管に繊毛が減少し、アカゲザルロタウイルス8に感染研究実証を発表した。欠点は技術は労働集約的であり、細心の切開が線維芽細胞の汚染を防止する必要があることが挙げられる;さらに、成長および培養物中で少なくとも3週間は、ほとんどの実験のために十分な細胞を得るために必要とされる。従って、これらの細胞は、二次元培養に伴う変化を反映することができる。それはまだ得られた細胞集団は、幹細胞または細胞の有意な数を含むかどうか決定されていないperibiliary腺9,10からのS。

我々は、ラットから肝外胆管を隔離するためにこのメソッドを使用しようとしました。しかし、細胞は培養液中で成長することができなかった。主要な成長因子が培養培地中に存在しないか、他の条...

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開示事項

著者は、彼らが競合する利害を持たないことを宣言します。

謝辞

著者らは、消化器の分子研究UPenn NIDDKセンターの分子病理学とイメージングコアおよびイメージングの支援のための肝臓病（p30ポリDK50306）に感謝しています。この作品は、国立衛生研究所からの補助金（R01 DK-092111）によってサポートされ、フレッドとスザンヌBiesecker小児肝センター（RGW）と（SK）は小児肝疾患研究教育ネットワークの交わりによって行った。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEM/F12 (1:1)Gibco/ Life technologies11320-033500 ml、BEC培地で使用
FBSAtlanta BiologicalsS1115025 ml、BEC培地で使用
非必須アミノ酸を含む MEMGibco/ Life technologies11140-0195 ml、BEC培地で使用
Insulin-transferrin-seleniumGibco/ Life technologies51300-0445 ml、BEC培地で使用
Na ピルビン酸セルグロ25-000-CL5 ml、BEC培地に使用
化学的に定義された脂質濃縮物Gibco/ Life technologies11905-0315 ml、BEC培地に使用
ペニシリン-ストレプトマイシンセルグロ30-002-CI5 ml、BEC培地および500 μに使用。分離
GentamicinGibco /生命技術15750-0600.2ミリリットル、BEC媒体および500μで使用。分離
エタノールアミングマアルドリッチE9508-100ml0.13 ml、BEC培地で使用
MEMビタミン溶液Gibco/Life technologies11120-0525 ml、BEC培
大豆トリプシン阻害剤Biowhittaker17-605E5 ml、BEC培地で使用。溶媒はPBS、5 mg / mlに混合します ストック濃度
-グルタミンセルグロ25-005-CL5 ml、BEC培地で使用
ウシ下垂体抽出物ジェミニ500-1021.1 ml、BEC培地で使用
デキサメタゾングマアルドリッチD49020.5 ml、BEC培地で使用、ストックコンc 393 μエタノールで希釈したg / ml、
3 3'、5-トリヨード-L-チロニンSigma AldrichT63970.5 ml、BEC培地で使用、エタノールで希釈したストックコンク3.4 mg / ml
上皮成長因子ミリポア01-1010.5 ml、BEC培地で使用、25 μg/mL DMEM F12+1%BSA
ForskolinSigma AldrichF68865 mlで希釈し、BEC培地で使用し、ストック濃度0.411 mg/mlで使用し、DMSO
FungizoneGibco/ Life technologies15290-0181 mlで希釈し、BEC培地および500 μで使用。l単離ラット
テールコラーゲンBDバイオサイエンス354236
PBS 10xUSBコーポレーション75889スターリー、コラーゲンを作るために使用され、使用される量はコラーゲン濃度
に依存しますdH2ON/A N/A滅菌、コラーゲンを作るために使用され、使用される量はコラーゲン濃度
NaOHに依存します10 NFischer Scientificss255-1Nに希釈、滅菌、コラーゲンの製造に使用、使用量はコラーゲン濃度によって異なります
Clostridium histolyticumSigma AldrichC7657DMEMで希釈し、滅菌フィルターで希釈してから使用前に
トリプシン-EDTA (1x) 0.25%Gibco/ Life technologies25200-0563 ml、最大10分間
トリプシン-EDTA(10x) 0.5%ギブコ/ライフテクノロジー15400-0543 ml、インキュベート最大 10分
解剖顕微鏡ニコンSMZ645その他のモデルも可能
光源(光ファイバーイルミネーター)ショット・フォステックエース EKE LR 92240その他のモデルも可能
12.5cmストレートアイリスハサミケント・サイエンティフィックその他のモデルも可能
6インチ非鋸歯状湾曲鉗子細い先端を持つ電子顕微鏡科学他のモデルも可能
4インチ鋸歯状のステンレス製鉗子と細い先端電子顕微鏡科学その他のモデルも許容できる
シ地で使用Lシ、コラーゲンの使用の濃度に応じて可変、 1 のコラーゲン濃度に依存します コラーゲンの種類 XI ズ

参考文献

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